甲状腺未分化癌の同所性マウスモデル

要約

甲状腺未分化癌の同所性マウスモデルの生成は、ここで記載されている。この技術は、このように、疾患の進行、並びにスクリーン革新的な治療的介入を研究するための、より臨床的に関連する設定を作成し、免疫不全マウスの甲状腺にヒト甲状腺未分化癌細胞の外科的な配置を採用している。

要約

ヒト甲状腺癌の動物モデルのいくつかのタイプは、免疫不全マウスへの癌細胞の皮下異種移植片と同所移植を含む、確立されている。皮下異種移植モデルは、前臨床スクリーニングおよび新規治療処置を評価するために貴重であった。皮下モデルを使用する多くの利点があり、1）急速、2）再現性、及び3）腫瘍の確立、成長、および治療剤に対する応答は、目視検査によって監視することができる。しかし、実質的な証拠は^1-3皮下異種移植モデルの短期出入りに光を当てました。例えば、皮下異種移植モデルで治療特性を示す薬用治療は、多くの場合、人間の病気には顕著な影響を及ぼさない。異種移植移植または注射部位の微小環境は、この相違の中心に位置しています。

同所性腫瘍の異種移植モデルは、よりbioloを提供病気を研究する中でgically関連コンテキスト。宿主動物内での解剖学的起源と同等に病気の細胞や組織を移植することの利点は、適当な腫瘍 - 宿主相互作用のためのサイト、疾患関連転移の開発と治験治療の救済にサイト固有の影響を調べるための機能が含まれています。彼らは密接に人間の病気を再現するので、したがって、同所移植モデルは、はるかに多くの臨床的価値を抱く。これらの理由から、グループの数は、研究ツールとして^4-7同所性甲状腺癌モデルを利用している。

ここでは、高度に侵襲的で未分化甲状腺癌（ATC）の研究のため同所モデルを確立し、治療に抵抗し、すべての診断された患者に事実上致命的であるアプローチを記述します。培養された細胞は、ATC基底膜マトリックスを含む溶液中で解離し、細胞懸濁液として調製される。小音量がゆっくりINJです右甲状腺にected。マウスの全体的な外観と健康最小限の術後合併症を確保し、癌の病理学的浸透度を測定するために監視される。マウスは、4週間後に屠殺し、そして組織学的分析のために回収される。動物は、疾患のより高度な進行を調べるために後での時点で採取してもよい。当社ATC病理の理解、および有効性のための2）の画面の現在および将来の治療薬ATCとの闘いでさらに1）：この同所マウスモデルの生産は、二つの目的を達成するプラットフォームを確立します。

プロトコル

1。細胞調製

注 2）場所マトリゲル1）完全RPMI 1640ベースの文化·メディア·レシピ（500ミリリットル）435ミリリットルRPMI 1640、50ミリリットル熱不活性化FBS、5ミリリットル非必須アミノ酸、5ミリリットルのピルビン酸ナトリウム、5ミリリットル抗生物質抗真菌が含まれています4℃で一日のセルの収穫前に。

1. 人間ATC細胞ラインTHJは-11T ^8は 6ウェル培養プレートで増殖させた80〜90％コンフルエントに一度収穫される。
2. 室温で4分間200×gで遠心分離によって細胞をペレット化する。
3. RPMI 1640培地[2ミリリットル/ 6ウェルプレート]でメディアと再懸濁した細胞を吸引。
4. 0.4％トリパンブルー色素の一つのボリュームに追加し、TC10自動セルカウンターを用いて細胞密度を決定し、細胞懸濁液の小体積を取る。
5. 注入5×10 ⁵細胞/マウス倍の数のマウスを得るために必要な細胞懸濁液の体積を計算する。

注：広告を確保するためあなたは、マウスの二重数を（ 例えば 5匹のマウスを注入する場合は、10匹のマウスを注入したかのように、その後、細胞懸濁液を準備）を注入されているかのように、注射用の細胞懸濁液を同一視する、細胞を調製。

6. 15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液の必要な量を転送します。
7. 室温で4分間200×gで遠心分離によって細胞をペレット化する。
8. 完全RPMI 1640培地でのメディア再懸濁した細胞を吸引。
9. 1.6 mlチューブに細胞を移しマトリゲルの1ボリュームを追加して、徐々に内と外ペッティングにより穏やかに混合。

注：各マウスは細胞懸濁液/マトリゲルカクテル10μlのを受け取ります。 10μlの注射量に懸濁し、5×10 ^5個の細胞が正常に以前のATC同所の研究^9-10で使用されてきたので、本報告書でこれらのパラメータを使用していました。

10. 使用する準備まで氷上で細胞懸濁液を置きます。

_title "> 2。マウスの準備

1. 70％エタノールですべての表面を拭いて、解剖範囲と周辺地域を含む外科的なゾーンを、清掃してください。
2. 動物は手術から回復される加熱ランプ/パッドをオンにします。
3. 1ミリリットル、27G½ "ツベルクリン注射器を用いて10グラム体重腹腔あたり0.1ミリリットルケタミン/キシラジン（ケタミン9 mg / mlのとキシラジン1mg/mlのから成る薬物カクテル）を管理。
4. 手術のための準備マウス：1）マウス（あごのラインから胸骨と外のトップに腕に）、2の頸部を剃る）手術領域をスクラブ三回chorhexadine浸したガーゼの正方形と、3）ベタジン浸したガーゼで行う最後のスクラブ、4 ）優しく乾燥から目を防ぐために、眼軟膏を適用します。
5. マウスが十分に鎮静されていることを確認するために反射ペダルチェック。
6. 解剖スコープの下に使い捨て無菌フィールドバリアに背側横臥に動物を置き、布テープで所定の位置に動物を固定します。
7. スクラブ手とfingernailsその後無菌手術用手袋を置く。
8. 滅菌方法では、開腹手術はパックや楽器を手配。
9. 暴露だけ手術部位を残して、動物を介して無菌ドレープを置きます。

3。甲状腺および細胞注入に外科用アクセス

1. 滅菌、使い捨てメスを使用して、喉の正中線に沿って1対1.5センチメートル縦切開を行います。

注：正中線からの偏差は、気管にアクセスすることがより深いカッティングが複雑になります。かなり正確な正中切開は、あなたが一緒に左右の唾液腺を保持膜組織を介していじめるとカットすることができ、大規模な動脈ニッキングまたは切断の可能性を低減します。

2. 気管周囲のストラップの筋肉に第二切開を行い、次に右甲状腺を公開する側に切開筋肉の右側を引っ張る。
3. 止血は、筋層を保持するために、この時点で使用することができる甲状腺（ 図1）に簡単にアクセスするためのパーツ。

注：手順は、2つの手術スタッフによって実行された場合準備注射シリンジは支援スタッフが外科医に渡されている間あるいは、筋層が単に鉗子で戻って開催することができる。

4. ゆっくりゆっくり針を除去31G 5/16 "インスリン注射器を使用して右の甲状腺に細胞懸濁液10μlを注入。

4。手術部位とマウスの回復の閉鎖

1. どちら連続または断続縫合スタイルを使用して6.0縫合材料と縫合筋層。
2. 同じ方法でステッチが皮膚。
3. 直接切開部位上トリプル抗生物質軟膏の層を適用します。
4. 動物は暖かい加熱パッドで背側横臥位で回復することができます。動物が支援なし胸骨横臥位を実現することができたら、それを他のマウスに戻って配置することができる。

5。術後モニタリングとティッシュコレクション

1. 手術後一週間、毎日動物の切開部位と全体的な健康状態を確認し、週に一度確認してください。縫合糸は、14日後に無傷のままである場合、それらは除去される。

注：健康の衰え（ 例えばかなりの減量、だらしない髪は、呼吸をこじつけ）の兆候を示す動物を安楽死させ、組織が ​​収集されるべきである。

2. 一度マウスはキシラジン/ケタミン落ち着いた、上記説明するように管理し、所定の手術後の時点に達しています。
3. 心臓内に動物を灌流し、収穫甲状腺/気管や関心のある他の組織（ここでは詳細に説明しない）。

結果

私たちは、4週間後にATC細胞を注射したマウス20の合計から19浸潤性甲状腺腫瘍を検出しました。 図2Aに示す例では、添付された条件下で増殖5X10 ⁵ ATC細胞の同所注射を受けたマウスは、4週間後噴射による甲状腺に癌細胞の有意な浸潤を示す。好酸性細胞質と大きな核を有する特性spindled細胞と中〜巨大サイズの細胞と侵入ATC細胞の性質は、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色により確認した。比較のため、非注入された対照動物から甲状腺及び気管は、 図2Bに示されている。非注入動物の卵胞が近く、まだ緩い、関連付けを表示し、基本的に丸い形態を有する。

注射可能な送達の甲状腺および使用のサイズが小さいため、意図しない結果が生じる可能性がある。 図3Aは、例示する最も一般的に観察された、それは外の腫瘤の開発ですが、甲状腺を包含しない。細胞が排出されるとき、これは甲状腺を通じて以降針浸透に起因する可能性が高い以上のものです。 図3Bに示すように、時折、無腫瘍の成長、両方の肉眼および組織学的に、と提示したマウスが検出されています。検出可能な腫瘍発生の有無は、隣接組織およびキャビティへの注入部位と普及からの細胞懸濁液の放出によって引き起こされることができる。

図1。甲状腺を公開する。ラベルは、気管に隣接する左右の甲状腺を示す。

図2。腫瘍増殖のとで組織学的検査成功した甲状腺注射後vasion。組織標本は、前頭面に沿って切片。好酸性細胞質とヘマトキシリンおよびエオシンで大きな核（と特性spindled細胞と中〜巨大サイズのセルと実質的に腫瘍の成長を示すマウスの200Xで撮影）画像H＆E）は染色火は、腫瘍細胞が甲状腺に侵入し、そこから原発巣を示すB）気管および対照動物から甲状腺（100Xで撮影した画像） 火、腫瘍;。。。S、平滑筋、Trは 、気管、 汝 、甲状腺。

図3。同所注射の意図しない結果。組織標本は、前頭面に沿って区分された。）周辺腫瘍増殖thyroiで明らかにしない成長D（黒い矢印、100Xで撮影された画像）。B）総時腫瘍検出（図示せず）又は組織学的検査の欠如（50倍 ​​で撮影した画像）。 汝 、甲状腺。

ディスカッション

我々のモデルでは、動物は、4週間後噴射によって悪液質および呼吸窮迫に関連甲状腺腫瘍転移および疾患を示した。細胞懸濁液の注射可能な送達を利用して他のほとんどの同所性モデルと同様に、周囲の組織への注射及び目標を超えて広がるポスト噴射の漏れが可能である。それが言われていると、この手順で生成1認識潜在不明、非疾病関連の転移や合併症へのオフターゲット暴露の効果である。これは関係なく、調査されて、病気の、ほとんどの異種移植移植の一般的な関心事である。それにもかかわらず、転移の意図しない結果が有意にぴったりと甲状腺を覆う膜を貫通した針先端の全体のベベルを確保し、徐々に細胞懸濁液を排出することによって最小化することができる。漏れが注入中または後に観察された場合、それらの動物を研究から省略してもよい。

それは動物が甲状腺/気管や他の組織を採取する前に灌流されることが不可欠である。利点は、組織形態と整合性が保持されます）赤血球がパージされ、組織標本と2を乱雑にしません）、1の二倍である。さらに、どちらかの腫瘍塊が添付されているか、その中に埋葬されて切除甲状腺/気管、解剖学的ランドマークは、組織学的準備のために埋め込まれる前に識別することができるような方法でカットする必要があります。これは劇的に標本作製時間を短縮できます。

本稿では、ATC細胞の同所注射後高度甲状腺腫瘍の局所成長および浸潤を記述します。 ATC転移は、ヘマトキシリン​​及びエオシンなどの標準的な組織学的汚れを使用して、他の組織の組織学的調製物を分析または免疫組織化学によって細胞または病理学関連マーカーを利用することによって調べることができる。このシステムはさらに、報告して開発することができるリアルタイム画像は、転移の治療処置の有効性をモニターするために使用することができるようにenetically蛍光記者と甲状腺癌細胞を修正する。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 cell culture media	Mediatech	10-041-CV	Media and additives used depend on cell line
TC10 Automated Cell Counter	Bio-Rad	145-0001
Matrigel	Becton, Dickinson and Company	354234
Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4"	Roboz	RS-5135
Disposable scalpel, No. 15	Feather	2975#15
Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated	gSource	gS 21.5400
6-0 nylon black monofilament suture	Surgical Specialties Corporation	1279B
Heating Pad, reusable, 8" x 12"
Cloth tape, 1" X 10 yds	Medline	MIINON260101	For restraining anesthetized mouse
Peanut Clipper/Trimmer	Wahl	8655	For removing hair from surgical site
ChlorHex-Q SCRUB 2%	Penn Veterinary Supply	VED1222
Betadine	Henry Schein Company	6906727
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
2 x 2 gauze, 12-ply	Butler Animal Health Supply	6936
Sterile Field, Barrier, 18" x 26"	Busse	696
Drapes (CSR Wrap)	Cardinal Health	AT 21 412
27G ½" needle	Becton, Dickinson and Company	309623
31G 5/16" needle	Becton, Dickinson and Company	328438
Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution
Triple antibiotic ointment