Um modelo de camundongo ortotópico de Carcinoma anaplásico da tiróide

Resumo

Geração de um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma anaplásico de tireóide é descrito aqui. Essa técnica emprega colocação cirúrgica de células de câncer de tireóide anaplásico humanos na tireóide de ratos imunodeficientes, criando assim um ambiente mais clinicamente relevante para estudar a progressão da doença, bem como tela de intervenções terapêuticas inovadoras.

Resumo

Vários tipos de modelos animais de carcinomas humanos terem sido estabelecidas, incluindo xenoenxerto subcutâneo e implante ortotópico de células de cancro em ratinhos imunodeficientes. Modelos subcutâneos xenoenxerto ter sido valioso para a seleção e avaliação de novos tratamentos terapêuticos pré-clínica. Há um número de vantagens de se utilizar um modelo subcutâneo: 1) rápida, 2) reproduzível e 3) estabelecimento do tumor, o crescimento, e resposta a agentes terapêuticos podem ser monitorizados por meio de inspecção visual. No entanto, evidências substanciais lançou luz sobre as insuficiências da subcutâneos modelos de xenoenxerto ^1-3. Por exemplo, tratamentos medicinais que demonstram propriedades curativas em modelos subcutâneos xenoenxerto muitas vezes não têm impacto notável sobre a doença humana. O microambiente do site do transplante xenographic ou injeção está no cerne desta divergência.

Modelos de xenoenxerto tumor ortotópico prestar um serviço mais biolomacologicamente contexto relevante para estudar a doença. As vantagens da implantação de células ou tecidos doentes, em sua origem equivalente anatómicos dentro de um animal hospedeiro inclui um local adequado para as interacções do tumor-hospedeiro, o desenvolvimento de metástases e doenças relacionadas com a capacidade de analisar a influência específica do local sobre as soluções terapêuticas experimentais. Portanto, os modelos de xenoenxerto ortotópico abrigar muito mais valor clínico, porque intimamente reproduzir doenças humanas. Por estas razões, um certo número de grupos têm aproveitado num modelo ortotópico de cancro da tiróide como uma ferramenta de investigação ^4-7.

Aqui, descrevemos uma abordagem que estabelece um modelo ortotópico para o estudo de carcinoma anaplásico (CTA), que é altamente invasivo, resiste ao tratamento, e é praticamente fatal em todos os pacientes diagnosticados. ATC células cultivadas são preparados como uma suspensão celular dissociada numa solução que contém uma matriz de membrana basal. Um volume pequeno é lentamente injected na glândula tireóide direita. Aparência geral de saúde e os ratinhos são monitorizados para assegurar complicações pós-operatórias e mínimo para avaliar penetrância patológica de cancro. Ratos são sacrificados em 4 semanas, eo tecido é coletada para análise histológica. Os animais podem ser tomadas em pontos temporais mais tarde para examinar mais de progressão avanço da doença. A produção deste modelo ortotópico rato estabelece uma plataforma que realiza dois objetivos: 1) a nossa compreensão da ATC patologia, e 2) tela agentes terapêuticos atuais e futuros para a eficácia no combate à ATC.

Protocolo

1. Preparação celular

Notas: 1) Formulação completo RPMI 1640 com base meios de cultura (500 ml), compreende 435 ml de RPMI 1640, 50 ml de FBS inactivado pelo calor, 5 ml de aminoácidos não essenciais, 5 mL de piruvato de sódio, 5 ml de antibiótico-antimicótico, 2) lugar matrigel a 4 ° C, um dia antes da colheita de células.

1. Human linha celular ATC THJ-11T ⁸ são cultivadas em placas de cultura de 6 poços e colhido uma vez 80-90% confluentes.
2. Células por centrifugação a 200 xg durante 4 minutos à temperatura ambiente.
3. Aspirar o meio e ressuspender as células em meio RPMI 1640 [2 ml / placa de 6 poços].
4. Tomar um pequeno volume da suspensão de células, adiciona-la a um volume de 0,4% de corante azul de tripano e determinar a densidade das células usando TC10 contador de células automatizado.
5. Calcular o volume de suspensão de células necessário para obter 5 x 10 ⁵ células / mouse vezes os ratos número injetáveis.

Nota: Para garantir anúncio equiparar suspensão de células para injeção, preparar as células como se você está injetando o dobro do número de ratos (por exemplo, se injetando 5 ratos, em seguida, preparar suspensão celular como se estivesse injetando 10 ratos).

6. Transferir necessário volume de suspensão de células para um tubo cónico de 15 ml.
7. Células por centrifugação a 200 xg durante 4 minutos à temperatura ambiente.
8. Aspirar mídia e Ressuspender as células em RPMI completo 1640.
9. Transferência de células para um tubo de 1,6 ml, adicionar um volume de matrigel e misture delicadamente por pipetagem lentamente dentro e para fora.

Nota: Cada ratinho recebe 10 uL da suspensão / matrigel cocktail célula. Desde 5 x 10 ⁵ células em suspensão em um volume de 10 ul injectável ter sido usado com sucesso em estudos anteriores ATC ortotópicos ^9-10, foram utilizados os parâmetros neste relatório.

10. Coloque suspensão de células em gelo até que esteja pronto para uso.

_title "> 2. Preparação Rato

1. Limpar a zona cirúrgica, que inclui o âmbito de dissecação e área circundante, limpando as superfícies com etanol a 70%.
2. Ligar lâmpadas de aquecimento / almofadas onde os animais serão recuperando de uma cirurgia.
3. Administrar 0,1 ml de cetamina / xilazina (coquetel de drogas consistindo em cetamina 9 mg / ml de xilazina e 1mg/ml) por 10 g de peso corporal por via intraperitoneal usando um 1 ml, 27G ½ "seringa de tuberculina.
4. Prep rato para a cirurgia: 1) barbear pescoço de rato (de linha da mandíbula ao topo do esterno e para os braços), 2) esfregar área cirúrgica três vezes com chorhexadine quadrados gaze embebida, 3) esfoliação último feito com betadine gaze embebida, 4 ) aplicar suavemente pomada para evitar que os olhos sequem.
5. Verifique pedal reflexo para garantir rato está adequadamente sedado.
6. Coloque o animal em decúbito dorsal sobre uma barreira de campo estéril descartável no âmbito de dissecação e garantir o animal no lugar com fita de tecido.
7. Esfrega as mãos e os fingernails em seguida, colocar luvas cirúrgicas estéreis.
8. De uma forma estéril, a cirurgia aberta embalar e organizar instrumentos.
9. Coloque cortina estéril sobre animal, deixando apenas sítio cirúrgico exposto.

3. O acesso cirúrgico à tireóide e injeção de células

1. Usando um estéril, bisturi descartável, fazer uma incisão longitudinal de 1 a 1,5 centímetros ao longo da linha média do pescoço.

Nota: Desvio da linha média complica mais profundo corte de acesso à traquéia. Bastante incisão precisa mediana permite brincar e cortar o tecido membranoso segurando glândulas salivares esquerdo e direito juntos e reduz a chance de entalhar ou cortar grandes artérias.

2. Faça uma segunda incisão nos músculos da cinta ao redor da traquéia, em seguida, puxe o lado direito do músculo incisão para o lado para expor a glândula tireóide direita.
3. Hemostats podem ser usadas neste ponto para segurar a camada de músculo umparte de fácil acesso para a glândula tireóide (Figura 1).

Nota: Como alternativa, se o procedimento realizado por duas equipes cirúrgicas, a camada muscular pode simplesmente ser detido com uma pinça, enquanto uma seringa injetável pronto é entregue ao cirurgião pela equipe auxiliar.

4. Lentamente, injetar 10 ml de suspensão de células na glândula tireóide direita usando um 31G 5/16 "seringa de insulina, em seguida, retire cuidadosamente a agulha.

4. Fechamento da ferida cirúrgica e recuperação Rato

1. Camada muscular da sutura com material de sutura 6.0 usando um modelo de sutura contínua ou interrompida.
2. Costure a pele da mesma forma.
3. Aplique uma camada de pomada antibiótica tripla directamente sobre o local da incisão.
4. Permitir animal a se recuperar em decúbito dorsal sobre almofada de aquecimento quente. Uma vez que animal pode atingir decúbito esternal sem ajuda, ele pode ser colocado de volta com outros ratos.

5. Acompanhamento pós-operatório e coleta de tecido

1. Verifique o local da incisão e de saúde geral do animal diariamente durante uma semana após a cirurgia, em seguida, verifique uma vez por semana. Se as suturas são ainda intactas após 14 dias, elas são removidas.

Nota: Os animais que apresentem sinais de declínio da saúde (por exemplo, perda de peso substancial, cabelo desalinhado, dificuldade para respirar) devem ser sacrificados e os tecidos coletados.

2. Uma vez que os ratos chegaram a um pós-operatório ponto de tempo pré-determinado, administrar cetamina / xilazina como descrito acima para sedar.
3. Perfundir animais intracardially e colheita da tireóide / traquéia e outros tecidos de interesse (não descrito em detalhes aqui).

Resultados

Detectamos 19 tumores da tiróide invasivas de um total de 20 ratinhos injectados com células ATC após 4 semanas. No exemplo mostrado na Figura 2A, os ratinhos receberam uma injecção ortotópico de 5X10 ⁵ ATC células cultivadas sob condições anexas, apresentam infiltração significativa de células cancerosas para a tiróide às 4 semanas após a injecção. A natureza das células ATC invasores com uma característica de células fusiformes e células-gigante e médio porte, com citoplasma eosinofílico e núcleos grandes foi verificada por hematoxilina e eosina (H & E) coloração. Para fins de comparação, da tiróide e da traqueia a partir de um animal de controlo não injectada é mostrado na Figura 2B. Folículos do animal uninjected exibir fim, ainda solto, de associação e têm essencialmente uma morfologia round.

Devido ao pequeno tamanho da tiróide e utilização do fornecimento de injectável, podem surgir resultados não intencionais. Figura 3A ilustra omais frequentemente observados, o que é o desenvolvimento de uma massa tumoral de fora, mas não abrangendo a tiróide. Isso é mais do que provável que, devido à penetração da agulha através e além da tireóide quando as células são expulsos. Ocasionalmente, os ratinhos que apresentavam nenhum crescimento do tumor, tanto grosseiramente e histologicamente, são detectadas como mostrado na Figura 3B. Ausência de desenvolvimento de tumor detectável pode ser causada por expulsão da suspensão de células a partir do local de injecção e de difusão para os tecidos vizinhos e cavidades.

Figura 1. Expor a tireóide. Etiquetas indicam as glândulas da tireóide direita e esquerda, ladeando a traquéia.

Figura 2. O exame histológico do crescimento do tumor e, emvasion após a injeção de tireóide bem sucedida. amostras de tecidos foram seccionados ao longo do plano coronal. A) Imagem tomada em 200X de rato apresentando crescimento substancial tumor com células fusiformes característicos e células-gigante e médio porte, com citoplasma eosinofílico e núcleos grandes em HE ( H & E) mancha Tu indica a lesão primária a partir da qual as células do tumor invadir a tireóide B) traquéia e tireóide de animais controle (imagem tirada em 100X) Tu, tumores;... S, músculo liso; Tr, traquéia; Thy, glândula tireóide.

Figura 3. Resultados não intencionais de injeção ortotópico. Amostras de tecidos foram seccionados ao longo do plano coronal. A) o crescimento do tumor periférico sem crescimento evidente na thyroi(seta preta, imagem tomada no 100X). B) exame d Falta de detecção do tumor em bruto (não mostrado) ou histológico (imagem tirada em 50X). Thy, glândula tireóide.

Discussão

Em nosso modelo, os animais demonstraram a metástase do tumor da tireóide e doenças relacionadas angústia e caquexia respiratória por quatro semanas após a injecção. Tal como acontece com a maioria dos outros modelos ortotópico utilizando entrega injetável de uma suspensão de células, a injeção dentro dos tecidos circundantes e vazamentos pós-injeção que se espalha além da meta é possível. Com isso dito, um desconhecido potencial reconhecível produzido por este processo é o efeito da exposição fora do alvo de metástases não relacionados com a doença ou complicações. Esta é uma preocupação geral, com a maioria dos transplantes xenographic, independentemente da doença a ser investigada. No entanto, as consequências não intencionais de metástase pode ser significativamente minimizado garantindo todo o bisel da ponta da agulha penetrou a membrana que cobre confortavelmente a glândula da tiróide e expulsando-se lentamente a suspensão celular. Se forem observadas fugas durante ou após a injecção, os animais podem ser omitidas a partir do estudo.

É essencial que os animais são perfundidos, antes da colheita da tiróide / traqueia e outros tecidos. As vantagens são duplas, 1) as células vermelhas do sangue são eliminadas e não atravancar espécimes histológicos e 2) a morfologia do tecido e integridade são preservados. Além disso, ressecado tireóide / traqueia, que têm uma massa tumoral anexado ou estão sepultadas dentro dela devem ser cortados de uma forma que marcos anatômicos podem ser identificados antes de serem incorporados para a preparação histológica. Isto irá reduzir drasticamente o tempo de preparação de amostras.

Neste relatório nós descrevemos o crescimento local e invasão de tumor de tireóide avançado após a injeção ortotópico de células ATC. ATC metástase pode ser investigada por análise de preparações histológicas de outros tecidos, usando manchas histológicas convencionais, tais como hematoxilina e eosina, ou por imuno-histoquímica de células ou utilizando marcadores relevantes patologia. Este sistema pode ser desenvolvido por genetically modificar células de cancro da tiróide com os repórteres de fluorescência de modo a que imagens ao vivo pode ser usado para monitorar a metástase e a eficácia dos tratamentos terapêuticos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 cell culture media	Mediatech	10-041-CV	Media and additives used depend on cell line
TC10 Automated Cell Counter	Bio-Rad	145-0001
Matrigel	Becton, Dickinson and Company	354234
Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4"	Roboz	RS-5135
Disposable scalpel, No. 15	Feather	2975#15
Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated	gSource	gS 21.5400
6-0 nylon black monofilament suture	Surgical Specialties Corporation	1279B
Heating Pad, reusable, 8" x 12"
Cloth tape, 1" X 10 yds	Medline	MIINON260101	For restraining anesthetized mouse
Peanut Clipper/Trimmer	Wahl	8655	For removing hair from surgical site
ChlorHex-Q SCRUB 2%	Penn Veterinary Supply	VED1222
Betadine	Henry Schein Company	6906727
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
2 x 2 gauze, 12-ply	Butler Animal Health Supply	6936
Sterile Field, Barrier, 18" x 26"	Busse	696
Drapes (CSR Wrap)	Cardinal Health	AT 21 412
27G ½" needle	Becton, Dickinson and Company	309623
31G 5/16" needle	Becton, Dickinson and Company	328438
Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution
Triple antibiotic ointment