手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

要約

レーザーマイクロダイセクションでは、実質の微量から選択された細胞の回復を可能にする技術です。ここでは、トランスクリプトーム研究のために使用される手術標本からヒト膵島を取得するためのプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、このように彼らのコレクションを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を向上させます。

要約

レーザーマイクロダイセクション（LMD）は実質^1,2分の金額から選択した細胞や組織の回復を可能にする技術です。解剖した細胞は、トランスクリプトームやプロテオーム研究は、DNAや染色体分析評価^2,3として調査、種々の用途に使用することができます。 LMDの特に困難なアプリケーションは、RNA ⁴の不安定性に起因して、細胞は、膵臓などのRNaseの豊富な組織から解剖される場合に特に顕著であることができ、トランスクリプトーム解析、です。標的細胞の迅速な識別と収集を可能に顕微解剖プロトコルは組織の処理時間を短くすると、その結果、RNAの保全性を確保するためには、この設定には不可欠です。

ここでは、トランスクリプトーム研究⁵に使用する手術標本からヒト膵β細胞を取得するためのプロトコルを記述します。約0.5〜cの膵臓の小片m ^3をティッシュテックOCTコンパウンド、直ちに2 -メチルブタンチルドで凍結し、-80℃で保存しセクショニングまで、Cに埋め込 ​​ま摘出膵臓標本の健康現れるマージン、から切り出した。 10μmの厚さの四連続切片1〜2分間クライオスタット内部に乾燥したガラススライドに個別に転送-20℃設定、、、下のクライオスタットでカットし、-80℃で保存した

直ちにレーザーマイクロダイセクションの手順の前に、切片を氷冷100％の2つの1分インキュベーションすることにより、氷の寒さの中に固定されたばかりの30秒間、70％エタノールを調製し、氷冷DEPC処理水で5月6日ディップで洗浄し、脱水したエタノールは4分間キシレン（組織の脱水に使用される）に続いて、組織切片を3〜5分間、その後、風乾した。重要なことは、すべての手順は、キシレン中でのインキュベーションを除いて、氷のように冷たいの試薬 ​​を用いて行った-以前に記述されたプロトコル⁶以上修正。 UT氷冷試薬のilizationは、ベータ細胞の内因自家蛍光の顕著な増加をもたらした、との認識を容易にした。顕微解剖のために、4つのセクションでは、各時間脱水した：2、ホイル·ラップに入れた50 mlチューブ、湿気や漂白から組織を保護するために、残りの2は直ちに顕微解剖された。この手順は、（AutoLPC）モードに突入させた自動レーザ圧接を採用PALMマイクロビーム装置（Zeiss）を用いて行った。 40-60分よりもはや不要4凍結切片からベータ細胞/小島清の完成。細胞は1 AdhesiveCapに集め、10μlの溶解緩衝液で溶解した。トランスクリプトーム解析のために、それぞれの単一のRNA試料がピコ純粋なRNA単離キット（アルクトゥルス）を用いてRNAを抽出し、10セル顕微サンプルを結合することにより得た。このプロトコルは、このように彼らの迅速かつ正確な認識とcを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を改善ollection。この手順のさらなる改善は、2型糖尿病に伴う変化を理解するためのより良い可能性のある影響で、表現型が異なるβ細胞の解剖を可能にするかもしれません。

プロトコル

1。ヒト膵臓組織の凍結

1. メスとピンセットで脂肪組織、血管、神経、非実質組織を削除し、ピース（〜0.5〜1センチメートルキューブ）に膵組織を切断。
2. Cryomoldの中央に1膵組織片を置き、冷たいティッシュテックOCTコンパウンドで完全にそれをカバーしています。その底液体窒素で予め冷却2 - メチルブタンとスナップ凍結で覆われている瓶にCryomoldを置く。 -80℃で凍結したサンプルを保存

2。凍結切片の作製

1. RNAの変性を避けるために、すべてのステップを通して手袋を着用してください。
2. アウェイ冷たい100％エタノールおよびRNaseのクライオスタットナイフ、試料ホルダーと絵筆を清掃してください。クライオスタット内部の凍結組織を置きます。
3. 組織、ナイフとブラシが-20℃に到達するまで待つ待っている間にクライオスタット室の内部SuperFrostプラススラ​​イドやプレクールそれらをラベル組織は-20℃に到達するための
4. 試料ホルダー上のティッシュ - Tek社のOCTコンパウンドを塗布し、上に凍結組織を置く。
5. ティッシュテックOCT化合物が凍結されたらcryoblockをトリミングして、カミソリの刃で組織 - Tek社のOCT化合物の任意の過剰を取り除く。
6. 膵組織ブロックから連続4010μmのスライスの合計をカット。さらに我々は、顕微解剖プロセス中にスライス内の膵島の識別を容易にすることができ膵臓セクションの概要図面用に保存される最初と中間スライスを切ることをお勧めします。
7. セクションでは、厳守しなければならないための唯一の地域を暖めるために指でスライドの裏面を（手袋で覆われて）に触れることによりSuperFrostプラススラ​​イドの中央にナイフの刃からセクションを転送します。
8. -20℃クライオスタット内のセクション1-2分℃、あなたがドライアイス上に置かれたスライドの箱に入れた後、乾燥させてください。セクションを保存-80℃
9. 必要に応じて、紙タオルと冷たい100％エタノールでナイフの刃を清掃してください。

3。凍結切片の脱水

1. 試薬の準備：30ミリリットル作りたての70％エタノール、30ミリリットルDEPC処理水、2x30ミリリットルの100％エタノールと50ミリリットルCellstarチューブ（ファルコン）に30mlのキシレンを注ぎ、寒さと氷の上に全ての試薬を（キシレンを除く）を保持します。
2. 100％エタノールとRNaseZAPとボンネットの下に作業スペースを清掃してください。
3. 次のようにプロセス2凍結切片は：氷冷DEPC処理水で5月6日クイックディップで洗浄し、30秒間氷冷70％エタノールで固定し、キシレン中で4分間インキュベートし、氷冷100％エタノールで1分間ずつ2回脱水室温（25℃）、3〜5分間乾燥した空気で。凍結切片の別のペアを使用してこの手順を繰り返します。
4. 光や湿気から守るためにアルミホイルで包まれた50ミリリットルCellstarチューブに背中合わせに2乾燥した凍結切片を挿入します。

4。 PALMマイクロビーム、ツァイスとのβ-細胞のレーザーマイクロダイセクション

1. RNaseZAPと顕微鏡を清掃し、RoboMoverにおける接着剤キャップを取り付けます。
2. フィルタセット09（励起：450から490 nmの発光> 515 nm）を、AutoLPCモード、50％のレーザーエネルギー、65％のレーザー焦点、100％のレーザー速度、AutoLPCショット間5μmの距離、6μmの距離が次のように設定します。 -10100：行に、高さを働く。
3. ステージに1スライドを挿入します。
4. 顕微鏡可視化（5倍または10倍レンズ）の下で自家β細胞を見つけます。
5. 40倍のレンズに切り替えて、 "フリーハンド"選択ツールを使ってβ細胞を選択し、レーザーを使用してそれらを顕微解剖。
6. 1 AdhesiveCapに4脱水凍結切片の組織をキャプチャします。
   コメント1：1脱水凍結切片のベータ細胞を分析する時間がもたらすであろう組織切片の水分補給を避けるために10〜20分より長くするべきではありませんRNAの分解。
   コメント2：チェックポイントにステージを移動させた後、目視検査によって成功した顕微解剖プロセスを確認します。

5。マイクロダイセクションβ細胞濃縮組織の溶解

1. RoboMoverからAdhesiveCapを削除します。
2. AdhesiveCapの蓋と42でそれを逆さまインキュベート℃を30分間にピペットで10μlの抽出緩衝液（XB、PicoPure RNA単離キット、アークトゥルス）。
3. 10,000 xgでスピンダウンし、ドライアイス上でライセートを置く。 RNA抽出が実行されるまで、それは、-80℃で保管してください。
4. 手順3を繰り返します。）〜5）。他のすべてのセクションで。

6。 RNA抽出

1. 全1010μlの溶解物を組み合わせる
2. 70％エタノール（DNase処理を含む）に1:1の比率の抽出バッファー（XB）を使用して、PicoPure RNA単離キット、アルクトゥルスのプロトコルに応じて室温で働くことによってRNAの単離を進めてください。

7。 RNA分析

1. アジレント2100 Bioanalyser（ピコチップ社）を使用して質と量の分析のために1μlのRNAを使用します。定量的評価は、チップ上で並列にロードされた標準RNAを基準に行われます。

結果

図1に示すように、修正された脱水プロトコルは、以前公表されたプロトコール⁶に比べてβ細胞の自家蛍光の改善につながった。記述されたプロトコルを適用すると、39外科膵臓標本のそれぞれが31'544'704μmの³組織/膵臓標本（： - 81'522'153μmの³ 8'742'390範囲）の平均のための40のシリアル凍結切片を生成するために使用された表1

ディスカッション

我々は外科膵臓検体からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクション（LMD）のための信頼できるアプローチについて説明します。 LMD顕微鏡が利用可能な場合、この手順は、これにより、両方の非糖尿病と2型糖尿病患者からのヒト膵島材料へのアクセスを増加させる、部分的pancreatectomiesを実行する任意の研究機関で実施されることができる。これは、膵島単離のために提供膵臓の不足与えら?...

資料

試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
2 - メチルブタン（イソペンタン）	ROTH	3927.1
AdhesiveCap（不透明、500μL）	ツァイス	415190-9201-000
Cellstarチューブ（50ml）を	グライナーバイオ1	210 261	サポートスカート
Cellstarチューブ（50ml）を	グライナーバイオ1	227.261
ジエチルピロカーボネート（DEPC）	SIGMA	D 5758
ドライアイス
無水エタノール	VWR	20821.310
液体窒素
絵筆
PALMマイクロビーム	ツァイス
ピールウェイの埋め込み型（切り捨て）、12×12ミリメートル	ProSciTech	RR12	トップ内部22x22のミリメートル、奥行き21ミリメートル
アルクトゥルスPicoPure冷凍RNA単離キット	アプライドバイオシステムズ	キット0204
プラスチック製のクランプ
かみそり
RNaseフリーのDNaseセット	キアゲン	79254
RNaseZAP	SIGMA	R 2020
スカルペル/外科用ブレード	テクノカット	2800111
SuperFrostプラス接着顕微鏡スライド	サーモサイエンティフィック	J1800AMN​​Z	25x75x1.0ミリメートル
組織 - Tek社のOCTコンパウンド	桜	4583または0807000022
ピンセット	BRAUN	BD168R
キシレン	VWR	28975.291