ターゲット-エステラーゼ誘起染料の読み込み（TED）とERカルシウムの直接イメージング

要約

標的と-エステラーゼ誘導し染料ロード（TED）は、蛍光イメージングによる細胞内カルシウムストアのダイナミクスの解析をサポートしています。それは合成の低親和性のCaローカルマスキングを改善し、小胞体（ER）に換えカルボキシルエステラーゼの標的に対するメソッド拠点 ^{2 +インジケーター色素。}

要約

カルシウム動態の可視化は、細胞生理学におけるカルシウムの役割を理解することが重要である。カルシウム動態を調べるために、合成蛍光Ca ^{2 +}のウインカが人気となっている。ここでは、TED（=ターゲット·エステラーゼ誘導される色素ロード）、のCa ^{2 +}放出異なる種類の細胞の小胞体内腔におけるインジケーター色素を改善するための方法を示しています。今日まで、TEDは、細胞株、グリア細胞、およびin vitroでのニューロンに使用した。ベクターコンストラクトを用いた小胞体内腔に高いカルボキシルエステラーゼ活性の標的効率的組換えでTED拠点その急行カルボキシルエステラーゼ（CES）。最新のTEDベクトルは、このように同時2カラー撮像を可能にし、赤色蛍光タンパク質に融合CES2のコア要素を含んでいる。対応するER構造が赤で表示されている間、ER内遊離カルシウムのダイナミクスは、一つの色に結像される。プロシージャの先頭で、細胞をレンチウイルスで形質導入されています。その後、感染した細胞再は、最終的に生細胞のイメージングを可能にするためにカバースリップ上に播種した。その後、生きている細胞は、インスタンスFluo5N-AM、MAG-Fluo4-AM、またはMAG-たFura2-AMのため、低親和性のCa ^{2 +}指標のアセトキシメチルエステル（AM-エステル）フォームでインキュベートする。のCa ^{2 +}指標と親水性蛍光色素/ Ca ^{2 +}の錯体のAM形からの疎水性側鎖を切断オフER内エステラーゼ活性が形成され、ER内腔に閉じ込められている。色素ローディング後、細胞を倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡で分析される。細胞は継続的にリンガーのようなソリューションで灌流し、ERのカルシウムダイナミクスタイムラプスイメージングによる直接可視化されています。 ERカルシウムストアの補充は、蛍光強度の増加を生じるのに対し、ERからのカルシウム放出は、関心のある領域における蛍光強度の減少によって識別される。最終的に、経時的に蛍光強度の変化はΔF/ F ₀の計算によって決定される。

概要

ERの生理的なカルシウム応答を解決するために、我々は、ERに合成炭酸カルシウム感受性色素の捕捉を改善するための新しい戦略を開発した。方法は、細胞外カルシウムの存在下で自由ERカルシウムの直接、無停止リアルタイム監視を可能にします。

ERカルシウムの機能とシグナリング

カルシウム信号は、異なる細胞型、 例えば、筋肉細胞、ニューロンおよび学習および記憶^1,2におけるシナプス伝達の関与に筋収縮を媒介からグリア細胞とその機能の範囲に見出される。カルシウムは遺伝子転写、細胞増殖、神経細胞の興奮性、細胞死および他の細胞シグナル伝達事象^1-7の調節に関与しているため、遊離カルシウム濃度の変化は、高い科学的関心である。これらのすべての細胞内カルシウムシグナルは、細胞内カルシウム機能的に接続され、貢献店舗ダイナミクス^8-10。

すべてのカルシウムシグナルの間で共通の特徴は、主にERやミトコンドリア、細胞外空間、細胞質と細胞小器官の間でのカルシウムの流れです。これは、異なるシグナル伝達成分によって感知されるこれらの細胞小器官内のカルシウム濃度のダイナミックな変化を引き起こす。一般的には100〜800μmの間のERの範囲内カルシウム濃度は、細胞質ゾルのカルシウム濃度は、100nMの近隣にあり、細胞外空間内濃度は1〜2 mMの程度である。従って、細胞質ゾルのカルシウム^2,9,10に向かって流れに対して高い化学的駆動力が存在する。

最も一般的に調査し、ER由来のカルシウムシグナルは、その後ホスホリパーゼC（PLC）を活性化するGタンパク質共役受容体（GPCR）の刺激に依存します。順番にPLCはイノシトール1,4,5 -三リン酸（IP ^_3）1を生成します。その視聴にIP ₃の結合時ER-膜におけるeptor（IP ₃ -録音、 図1）は 、カルシウムイオンは、ER内腔から放出される。歴史的には、ERからIP ₃媒介カルシウム放出は初めてだった-たとえ間接的に- Streb ら腺膵臓細胞で測定された1983年^11インチ 。本書は、初めてアセチルコリン、ホスホリパーゼC、およびIP _3が関与するシグナル伝達カスケードを示唆した。カルシウム放出のこの方法は、一般的にIP ₃誘発性カルシウム放出（IICR）（ 図1）と呼ばれます。受容体チロシンキナーゼリンクIP ₃標高¹²後シグナリングERカルシウムの増殖因子や神経栄養因子の作用によるホスホリパーゼCγのキナーゼ依存的活性化。 IICRに加えて、カルシウム上昇は電位依存性カルシウムチャネル（CA _V）、およびリアノジン再によるその後のカルシウム誘発性カルシウム放出（CICR）を経由して、たとえば、イオンチャネル型カルシウム流入によって媒介され得るceptors（RYR）。 IICRとCICRは生理的にストア作動性カルシウム流入（SOCE）にリンクされています。 SOCEはERのカルシウム放出するためのセンサであるSTIM（間質相互作用分子）の作用を有している。 STIMは、一過性受容体電位チャネル（トリプトファン^）13、往来カルシウムチャネル^14、さらには電位依存性カルシウムチャネル^15（ 図1）を介して細胞外のカルシウム流入を刺激することが示されている。 ERカルシウムの損失が動的に積極的にポンプカルシウムバックERにサーコ-小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）の作用によって救出されています。などタプシガルギンなどの薬物とのSERCAをブロックすると、細胞質コンパートメントにERカルシウムの継続的損失を発表。このERカルシウム"リーク"などSec61タンパク質複合体^16,17（ 図1）のように小胞体膜内の細孔複合体によって引き起こされる。

1998年には、Berridgeは、モデル、 "ニューロンモデル内ニューロン"、whicを発表hはニューロンのカルシウム^5を統合するERの原則生理的役割を示唆している。このモデルは、神経細胞の原形質膜⁵の細胞内の"画像"を形成する連続的なER膜システムの存在を考慮する。このバイナリ真核生物の膜システムは、ニューロンにおける高速と低速のカルシウムシグナルの時間的·空間的統合のための基本的な前提条件であると主張しました。同じニューロンの異なる棘や樹状突起に同時にまたはその後のどちらか起こるカルシウムシグナルは、細胞の細胞体または彼らは^5,18を総括しているERを介して核に付与されています。そして、その合計がシグナル伝達カスケードのニューロンの興奮性、遺伝子転写の調節や統合に影響を与えることがある。したがって、ERは、カルシウムシグナルの統合をサポートしています。この概念の一つの前提条件は、いくつかの研究で主張されていると、少なくとも体性-Dのために証明されている単一のセル内のERの継続ですendriticエリアと短距離軸索投射^19-21。長い軸索投射内ER継続性があるかどうかは議論の問題です。

ER膜上の遊離カルシウムの流れを測定するための戦略

カルシウムシグナルは、最も頻繁に細胞質ゾル^22,23に監視されています。したがって、容易のCa ^{2 +を}細胞外から^6,24又は細胞内貯蔵から細胞質内に流入されているかどうかを区別することができない。この制限を克服するために、直接ERカルシウムイメージングのための方法論的な戦略が開発されている。要約すると、以下の戦略が使用されます。（1）ER-ターゲット遺伝子組み換えタンパク質の指標^25-27タンパク質ベースの低親和性のCa ^{2 +}インジケーターはタンパク質を感知カルシウムとの組み合わせで生物発光タンパク質イクオリンやGFPを使用しています。これらの遺伝子組み換えのCa ^{2 +}インジケータ（GECIs）ができますシグナルペプチドの助けを借りて、ERを対象とすることが、積極的に保持し、検索のモチーフを使用してERに保持されます。カメレオン原則上の共通ERのCa ^{2 +}指標ベースとカメレオンYC4.3 ^26,28です。カメレオンスプリットYC7.3ER ²⁹と、カメレオンD1 ^30。 （2）インジケーター色素のAM-エステル低親和性のCa ^{2 +} 指標^31,32。AM-デリバティブの直接エステラーゼ系色素ローディング （MAG-たFura2-AM、MAG-Fluo4-AMまたはFluo5N-AM）が合格親油性、カルシウムと小文字を区別しない状態での生体膜。その後、細胞質ゾルで同様ERで、内因性エステラーゼAM-エステル基の開裂とは、細胞質内のアクティブな染料ある程度の後ろとERに残して、Ca ^{2 +}のインジケータを解放。細胞質カルシウム濃度が十分にデ以下に留まるようしたがって、このアプローチは限り、ERの高いカルシウム濃度の条件下で有用である特に特徴的なカルシウムシグナル（低μMに例えば nM）を間に低親和性指標の護制限、。 （3） 細胞膜透過性³²との組み合わせでAM-エステルローディング。すべて残り細胞質のCa ^{2 +}指示薬は、人工細胞内バッファに"マイルド"洗剤（ 例えばサポニン）少量の細胞膜透過処理によって除去される。したがって、細胞内膜を直接形質膜における"細孔"を介して、細胞内のバッファ内のIP ₃を、例えば 、刺激されてもよい。 （4）ER内腔や細胞質ゾル ^32,33 中のCa ²の細胞全体の構成や同時測定⁺下の細胞質ゾルの透析。セルが最初に低親和性のCa ^{2 +}指示薬（ 例えば MAG-たFura2-がロードされAM、）、レシオメトリックUV光。その後、パッチピペット、残っCYTの助けを借りてosolic低親和性のCa ^{2 +}インジケーターは高親和性のCa ^{2 +}指示薬（ 例えばフルオ-3、可視光）を含む緩衝液を用いて細胞質ゾルの外透析されています。この戦略は、細胞質およびER派生信号の同時記録が可能。 （5） 目標-エステラーゼ誘発性染料ローディング ^8,34。カルボキシルエステラーゼ（CES）は、ERの内腔に標的化および低親和性のCa ^{2 +}指標のAM-エステル体を効率的に捕捉するための高エステラーゼ活性を提供する。

標的と-エステラーゼ誘導し染料ロード（TED）

ER内腔に低親和性のCa ^{2 +}指標のターゲッティング改善するには、TEDが開発されました。 TEDは、発現構築物によって達成されるER標的マウスカルボキシルエステラーゼ（CES2）（ 図2）の過剰発現を必要とします。換えCES-コンストラクトを発現する細胞は、中のカルシウムのAM-エステルフォームでインキュベートするdicator色素（Fluo5N-AM、 図2）。次に、ERで、染料は、したがって、ER内腔⁸に高濃度で染料をトラップ、高エステラーゼ活性によりCa ^{2 +}の敏感な、膜不浸透性のCa ^{2 +}指示薬複合体（Fluo5N/Ca ^{2 +）}に変換されます^、34。方法はSERCA ¹⁷の遮断後にインスタンスに対して直接"リークチャネル"を介して、代謝、プリンまたはグルタミン酸受容体^8,34を介して、例えばIICR-経路を介して、小胞体のカルシウム放出を調査し、ERカルシウム枯渇を可視化するために特に便利です^、34。我々の経験に低親和性のCa ^{2 +}指示薬Fluo5N-AMは、現在TED染料ローディング戦略で使用する利用可能な最善の指標である。 Fluo5N-AMは、Ca ^{2 +}のための低親和性を持っている（解離定数K _D〜90μM、 図2）、ほぼ非蛍光そのAM-形であるが、calciu際高い蛍光発光を提供していますMバインディング^8,34。 Fluo5N/Ca ^{2 +}錯体は、そのようなFITC、アレクサ488、またはeGFPのような標準的な染料に対応〜490ナノメートルの標準光源で励起することができる。細胞質カルシウム信号は殆ど低μMの範囲の濃度に到達しない為、ほとんど細胞質内Fluo5N ³⁵によって検出される。

TEDのパフォーマンスを向上させるには、いくつかの組換えベクター構築物（ 図3）を開発した。もともと、CES2のコード配列（のRefSeqアクセッション番号NM_145603、CES2c）と最高のTEDのパフォーマンスに基づいてTEDベクトルはCES構築物の安定発現で観察されています。新しいTEDベクターは、赤色蛍光タンパク質TagRFP-T2 ³⁶に融合CES2のコア要素を表現する。これらのベクターは、それらが形質導入細胞識別し、Fluo5N/Ca ²の変化を正規化するための内部コントロールとして赤色蛍光を使用するために使用することができるという利点を有し⁺蛍光。赤色蛍光はまた刺激条件でERとERダイナミクスの変化の構造分布を可視化する可能性を提供しています。

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プロトコル

このプロトコルは、細胞株、海馬ニューロンと皮質のグリア細胞に適用されるTEDを紹介します。 TEDベクトルが安定して発現されたときTED性能はレンチウイルスベクターによる例えば、最適です。 TED方法の概略を図4に示されている。

1。溶液の調製

以下の溶液を開始する前に準備されるべきであると示されているように記憶することができる。我々は一般的に殺菌し、ガラスやプラスチック材料とオートクレーブ水を使用。

1. HEPESリンガー（単位：mm）準備します。125のNaCl、3のKCl、25 HEPES、2 _{し、MgSO 4·7H 2} O、2のCaCl _2、1.25のNaH ₂ PO _{4、H 2} O、10 glucose.H ₂ O 127のNaCl、3のKCl、25 HEPES、2 _{し、MgSO 4·7H 2} O、1.25のNaH ₂ PO _{4、H 2} O、10 glucose.H ₂ O、0.1 EGTA：カルシウムフリーHEPES-リンガー（単位：mm）で構成されています。グルコースなしでこれらのイメージングソリューションは、B缶4℃で保存電子℃、 D-グルコースの必要量は、使用前に新たに追加される。
2. 海馬ニューロンにおけるTED解析では、人工脳脊髄液（ACSF）を推奨します。 ACSFは（単位：mm）で構成されます：127のNaCl、23のNaHCO _3、3のKCl、2.5呈₄ H ₂ Oは、25 D-glucose.H ₂ O、2のCaCl _2、2のMgCl _2·7HのddH ₂ 0。 ₂ 0。
3. 5mMの濃度にFluo5N-AM準備します。可溶化は、凍結乾燥Fluo5N-AMの50μgの20％プルロニックF-127（DMSO中で、湿気や光から保護し、室温で保存）の8.9μLを追加するのに役立ちます。その後、少なくとも2分間水浴超音波処理によってFluo5N-AM溶化。ストアアリコートà-20℃で0.5μlのは、光と湿気から保護。
4. 必要に応じて、アンタゴニストおよびアゴニスト株式を準備します。例えば：）10mMのH ₂中のATPまたはADP（H ₂ O、プリン受容体の代謝活性化）、b）の10mMのカルバコールO（アゴニストムスカリン性アセチルコリン受容体）、c）のDMSO中に30mMのシクロ酸（CPA）（SERCAのブロッカー）、d）は、PBS中の50mMのDHPG（mGluRの_IおよびmGluRの₅代謝調節型グルタミン酸受容体アゴニスト）、e）のH中の10mMグルタミン酸₂ O、f）のDMSO（イオノフォア）、g中の1mMのイオノマイシン）DMSO中の5mMタプシガルギン（SERCAの高親和性ブロッカー）。 -20℃で保存のアリコート
5. レンチウイルスベクター：このプロトコルは、レンチウイルスTED発現ベクター粒子の使用を含む。その生産および貯蔵は、このプロトコルの一部ではありません。私たちは、細胞株、グリア細胞と神経細胞への組換えカルボキシルエステラーゼの転送のための第二世代のレンチウイルスベクターを使用しています。発現ベクターFUGW ³⁷と、パッケージングプラスミドpCMVΔR8.91またはpsPAX2及びシュードプラスミドpMD2.G ^38,39の私達のレンチウイルスシステム拠点注意：組換え自己不活性化レンチウイルスベクターを用いた作業は慎重を必要とすることを考えてみましょうバイオセーフティガイドラインの考察。多くの国では、これらのベクトルは、バイオハザードリスクグループ2に分類される。詳細については、を参照してくださいhttp://www.addgene.org/lentiviral/ 。

2。準備とマウス海馬ニューロンのウイルス感染

1. 約30分間、70％エタノールで直径20cm（皿当たり100カバーグラス）1Xのガラスシャーレにカバーガラスを洗ってください。最後に、2分間、100％エタノール（PA）を追加します。残留エタノールを除去し、無菌のボンネットの下にカバースリップを乾燥。
2. B27 1時50分との神経細胞用基礎培地、グルタマックス1:100、及びN2サプリメント1:100：と、（b）完全培地B27 1時50で（a）は神経細胞用基礎培地：海馬ニューロン培養のためのメディアの2種類を準備します。無菌ろメディア、使用するまで細胞インキュベーターに格納します。
3. 前の解剖に一日、カバースリップを最初に各1つ無菌10ミリメートルカバースリップを配置することによって調製される4ウェル細胞培養皿のウェル。その後、慎重にコート各80-100μlの0.1％のポリ-L-リジンとカバースリップとは、一晩インキュベーターに料理を保存します。
4. 解剖と細胞培養の日に、100μlのHBSSでカバースリップ3回洗浄から始まり、それぞれのカバースリップに100μlの神経細胞用基礎培地を転送します。平衡インキュベーター（マウスの解剖中など ）に皿を置きます。

解剖

我々は、我々の機関の動物のケアと使用率の委員会によって承認された欧州連合のガイドラインに従ってマウスと我々の実験を行う。

5. 合計脳を取り出し、両側海馬を解剖。
6. 慎重に海馬以外の髄膜や組織を除去し、450μlのHBSSを含む1.5mlチューブで各1海馬を配置。海馬十分な数の単離されたまで氷上で組織を格納する。

細胞培養

7. 各チューブに50μlの1％トリプシン（ワーシントン）を追加し、15分間37℃の水浴中でそれらをインキュベート。時折チューブを振る。消化反応を停止させ、各チューブに50μlの1％トリプシンインヒビターを加え、チューブを数回反転させる。
8. 海馬は、液体の移送を回避1 15ミリリットルファルコンチューブに5までのすべての組織を移す。 5ミリリットルの最終容量にB27-培地（）を追加します。
9. 丁寧に上下にピペッティングによって火災ポリッシュパスツールガラスピペットを用いて組織を摩砕注意：空気の泡を避ける！
10. 3分間400 XGでスピン、上清を吸引し、5ミリリットルB27-培地（）で細胞ペレットを再懸濁します。
11. 1,000μlのプラスチックフィルターチップの助けを借りて、二回をガラスピペットで再び組織を摩砕し、。としてステップ2.9と2.10で説明これを実行してください。
12. 最後の遠心分離後、2ミリリットルフルmediuで細胞ペレットを再懸濁しM（b）および200μlのプラスチックフィルターチップと磨細胞。単一細胞懸濁液から、残りの細胞塊を分離するために、細胞塊が1〜2分のために落ち着くことができます。
13. 細胞をカウントし、ウイルス感染のために必要なセルの総数を計算する。 TEDイメージングのために10ミリメートルのカバースリップあたり25,000セルを使用。
14. コントロールとしてのメッキ追加25,000非形質導入細胞は、この時点でお勧めします。

ウイルス感染

15. 新鮮な15ミリリットルファルコンチューブ、400×gで3分間遠心分離器へのウイルス感染の細胞懸濁液を移す。
16. 上清を吸引除去し、300μlの培地で細胞を再懸濁（b）の
17. レンチウイルス感染TED発現ベクター粒子の適切な量を追加し、ファルコンチューブを10分間室温で放置する。
18. 完全培地でチューブを埋める（b）のメッキ（各10ミリメートルのカバースリップのために100μl）をするために必要な最終的なボリュームに、COVから培地を吸引erslip、すぐにそれぞれのカバースリップ上に100μlの細胞懸濁液を配置。
19. すべてのセルが落ち着い（約2時間）と、彼らは2 mlの培地（b）に含まれているまで、慎重に料理をいっぱいするまでインキュベーターに皿を置きます。
20. ニューロンは少なくとも1週間に成長しましょう​​。毎週培地の50％を交換してください。

3。マウス皮質グリア細胞の培養とウイルス感染

準備

1. グリア基礎培地（10％FCS、5％HS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、0.45％のグルコースを含むDMEM/F12の1:1混合物）及び4ミリリットル0.5 ngの/ mlのポリ付きT75細胞培養フラスコのコーティングを調製することによって開始する-DL-オルニチン臭化水素酸塩（PORN）（150mMのホウ酸溶液、pHは8.35で希釈した）。 2時間37℃でインキュベートした後、または一晩、HBSSで細胞培養フラスコを3回洗浄し、B27 1:50 10 ngの/ mlのEGFを含んだ18ミリリットル基礎グリアメディアを追加します。インキュベーター内で細胞培養フラスコ（最大3時間）平衡。

解剖

1. 我々は、我々の機関の動物のケアと使用率の委員会によって承認された欧州連合のガイドラインに従ってマウスと我々の実験を行う。
2. 1 P5-P7マウスの脳を解剖し、2.5で説明したように両半球から海馬と髄膜を除去する。
3. 前頭皮質を解剖、いくつかの小さな部分にそれをカットし、HBSSを含む1.5mlチューブでそれらを収集します。チューブを氷上に保存し、細胞培養部に進みます。

細胞培養

4. チューブから火ポリッシュガラスピペットを用いて15ミリリットルファルコンチューブにすべての組織を移す。
5. 5ミリリットルの最終体積に基礎培地を追加し、火災研磨ガラスピペットで上下に数回ピペッティングして組織を摩砕。 3分間、300×gで遠心分離した後、培地を吸引し、5ミリリットル基礎培地で細胞ペレットを再懸濁します。
6. 二回3.5を繰り返します。
7. THIの後RDの遠心分離は、B27（午前1時50分）と10 ngの/ mlのEGFを含む2ミリリットル基礎グリア培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
8. 再びTitruate、準備T75細胞培養フラスコに細胞懸濁液を転送し、細胞は3〜4日間増殖させ。

グリア細胞（培養で3〜4日後）の洗浄：

9. その一方で、それがタイト保持しながら、10ミリリットルのPBSで細胞を1回洗浄し、精力的にタップやそっとあなたの手でフラスコを数回押してください。このステップの細胞残屑と細胞クラスターによって培養物から除去される。
10. PBSを吸引し、B27（1時50分）と10 ngの/ mlのEGFを含む新鮮な基礎グリアメディアを追加します。細胞は、80％がコンフルエントに達するまでさらに5-7日培養を育成。

グリア細胞の分裂、形質導入と最終播種：

11. コー​​トの10mM（原液：0.1％、PBSまたはHBSSで希釈した1/50広告20μgの/ ml）を100μlのポリ-D-リジンとカバーガラスとインキュベート晩インキュベーター内でそれら。 HBSSでカバーガラスを三回洗浄し、100μlの基礎グリアメディアを追加します。インキュベーター（3時間）でカバースリップを平衡化。
12. 10ミリリットルPBSで2回グリア細胞を洗浄し、PBSを吸引し、3ミリリットルトリプシン（TrypLE、原液）を追加します。最大1分までのため、細胞をトリプシン処理注意：オーバートリプシン処理を避けてください。全てのセルは通常80％以下で1分後に取り外され、これは、健康な細胞の数百万を有するのに十分であるている。
13. 10ミリリットル基礎グリア媒体を加えて反応を停止し、3分間、300×gで15ミリリットルファルコンチューブ、遠心分離機に細胞懸濁液を移す。上清を吸引除去し、5ミリリットル基礎グリア培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
14. 繰り返しになりますが、スピンと、ステップ3.15で説明吸引、その後5ミリリットル基礎グリア培地で細胞を再懸濁します。
15. 1.5 mlのチューブに細胞の必要数を転送します。 10 ^{4×10 4}グリア細胞は、1つの10ミリメートルカバースリップのために十分である。通常、サスペンション巻4ウェルディッシュが200μl未満である1細胞を形質導入するUME。細胞へのレンチウイルスTED発現ベクター粒子の適切な量を追加し、10分間RTでそれらをインキュベートする。その後、播種量（カバースリップあたり100μL）に基礎グリア媒体とサスペンションを埋める。
16. およそ2時間のためにカバースリップとインキュベート当たり感染細胞の種子100μlを、を2 mlの最終容積にB27 1:50 10 ngの/ mlのEGFを含む基礎グリアメディアを追加します。
17. 理想的な培養条件の場合はメッキの翌日3-7で実験のためにセルを使用。

4。レポーター細胞株の生成と文化

TEDレポーター細胞株は、HeLa細胞、BHK21、HEK293及びSH-SY5Yに基づいて確立した。ここでは、HeLa細胞のためのプロトコルを提供するが、プロトコルは同様に任意の他の細胞系に伝達される。

安定したHeLa細胞株の生成

1. 野生型のHeLa細胞株と転写10万Cを分割1.5mlチューブに200μlの量のエルボ。
2. チューブにレンチウイルスTED発現ベクター粒子の適切な量を加えて室温で10分間、細胞のウイルス懸濁液をインキュベートする。 3日間の30ミリメートル皿とインキュベートにおける2 mlの培地（DMEM、10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）の総量で次にシードのセルを。
3. PBSで1回洗浄した後、培地を吸引し、500μlのトリプシン（TrypLE、PBSで2時03）を追加します。約インキュベートする。 3分間、その後の3ml媒体を添加することにより反応を停止。 3分間、400×gで15ミリリットルファルコンチューブと遠心分離機にサスペンションを移す。
4. 200μlの培地中で細胞ペレットを再懸濁し、再び4.2に記載されているようにレンチウイルス粒子を細胞に感染。次いで、10mlの培地中のT25細胞培養フラスコ中のシード細胞。
5. 60〜80％の集密度に達するまで細胞を増殖。その後、文化を分割。

TEDレポーター細胞株

6. TEDレポーター細胞株を維持することができる任意の標準的な培地、 例えば DMEM、5％または10％FCSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有におけるオピニオンが使用される。
7. プレート滅菌10ミリメートルカバースリップ（上記参照）、 例えばカバースリップあたり10,000〜20,000個の細胞を含む4ウェルディッシュ中の細胞の適切な数。
8. TEDイメージングのためにそれらを使用する前に少なくとも2日のために細胞を増殖。

5。倒立顕微鏡でのライブイメージング手順の準備

1. 1. Prewarm室温にHEPES-リンガーとD-グルコースを追加します。
   2. 室温ACSF（のCa ^{2 +}およびMg ^{2 +}なし^）PrewarmとD-グルコースを追加します。 5分間カーボゲンとACSFを通気する。その後、2 mMの各最終濃度に_塩化カルシウムとのMgCl ₂ 1 Mストック溶液を追加します。
2. ライブイメージング顕微鏡と、すべてのコンピュータ·プログラムを開始する。
3. "ダミー"イメージング室に灌流を開始して、チューブシステムを平衡化します。
4. 顕微鏡ステージのインライン溶液ヒータと撮像チャンバPrewarm。加熱インサートの撮像室を修正。
5. あなたは染料ロード手順を開始°Cの前に32-37に、システムを平衡化注意：我々は、顕微鏡のステージを保護するために、目標やエラストマーシリコーンシート（1ミリメートル）の周りの毛のタイを使用顕微鏡システムへの灌流液の偶発的流れを避けるために。

6。セルタイプのどちらかの染料読み込み

1. 100μlの温めイメージングソリューション（HEPESリンガーまたはACSF）でFluo5N-AMの1アリコートを（1.3を参照）を再懸濁します。
2. 90秒間水浴超音波処理におけるイメージングソリューション（HEPESリンガーまたはACSF）でFluo5N-AM溶化。
3. または1つのウェルから24ウェルプレートと転送400μlの温めイメージングソリューション - 新鮮な4を使用してください。 5μM溶液を500μlのに来て、同じウェルに色素溶液を追加。
4. 慎重に細胞（ 例えばとカバースリップを置く井の中の直径10〜18ミリメートル）、上向きに細胞。
5. 37°C（その間顕微鏡ステージでの画像形成の設定を準備する）で細胞培養インキュベーター中で適当な時間インキュベートする。典型的な色素ローディング時間は、ニューロンおよびグリア細胞7-15分間および細胞系10〜20分間である。

CRUCIAL：色素ロード時間と染料濃度は、細胞型、細胞密度、および実験固有のニーズに依存する！染料の存在下で長いインキュベーション時間は、細胞に害を与え、特にプライマリーニューロンとプライマリグリア細胞、これは生理的な刺激に対する反応性のために重要である可能性があります。長いインキュベーション時間（ 例えば 30分）だけ、小さな細胞内構造で例えば細かい突起や棘をERカルシウムの分布を調査するためにERカルシウムローカライズ実験のために有用であろう。いくつかの実験において、撮像溶液で1/3増殖培地の混合物Fluo5N-AM中に細胞を保護するのに役立つローディング。

6. 即座に、ウェル撮像液（HEPESリンガー又はACSF）を含む他の細胞培養物にカバースリップを転送し、撮像チャンバに細胞を取り付け開始。

7。共焦点走査顕微鏡倒立レーザーとER-カルシウム生細胞イメージング

1. イメージング室に高真空グリースを適用するペイントブラシを使用してください。グリースは、灌流チャンバーの底部にカバーガラスを固定するために必要とされる。そこで我々は、毎分15倍緩衝液交換までの高灌流速度を可能にし、小音量で10〜12ミリメートルカバースリップのために自作イメージングチャンバーを使用しています。 18ミリメートルカバースリップのために市販の灌流チャンバー、ワーナ​​ー楽器（RC-49FS）から購入することができる。この室はまた、ニューロンのフィールド刺激を可能にします。
2. Fluo5Nロードされた細胞を用いてカバーガラスを拾うとイメージングソリューションで覆われた細胞を維持する細胞にイメージングソリューション（50〜100μL）の小滴を追加します。逆さまにカバースリップを回し、イメージングチャンバーに細胞をマウントします。シリコン接着剤にカバースリップを押すように、（ 例えば Q-TIPS）綿棒を使用しています。
3. 綿棒のガラスカバースリップの底から離れて残った液を拭き注意：高分解能イメージングのための高開口と油対物レンズを用いたときに慎重に離れて残留水分を拭いてください。残留塩は、最高の水により除去される。グリースの偶発的なスメアをアセトンまたは純粋なエタノールで除去することができる。
4. 実験的なイメージング室との交流は、 "ダミー"イメージング室。連続灌流により5〜10分間、細胞を洗浄します。
5. 5のために細胞を洗浄 - 連続灌流で10分。
6. セル選択の場合はレーザー照度、高スキャンレート（2-4 Hz）で、小さな画像サイズ、および高利得の最小量を使用しています。
7. 注意：Fluo5N標識細胞の選択のためepifluorescenと光や直接照明を過剰に使用していないTライト。 Fluo5N/Ca ²の明るい照明⁺錯体は2-4秒（ 図5）内のER-固有の蛍光の完全な損失を引き起こす。
8. 計画された実験によると、顕微鏡をセットアップします。配向について、異なるTEDベクトルとイメージングのための代表的な設定は、 表1に示す。とスペクトル検出器システム、共焦点顕微鏡倒立レーザーのために、我々はダイオードレーザー（559 nmであり、20 mWの473 nmであり、15 mW）と装備されている1000年Fluoview共焦点システムと組み合わせたオリンパスIX81顕微鏡を使用しています。
9. 実験ドキュメントの先頭に高解像度のX、YZの画像スタックによって目的の細胞。
10. 具体的な実験条件下でERカルシウム動態を監視するためにX、YT撮影を行う。我々のシステムのための典型的な設定は、 表2に示す。
11. イメージングソリューションの連続灌流下ERカルシウムの変化を監視します。典型的なバッファの為替レートは、電子ですxemplarilyは、（a）SERCAブロックによる細胞洗浄ストア枯渇：1.5ml /分と、（b）ATP / DHPG刺激：1 ml /分。
12. 12ビット（4096グレイ値）と優先的にデジタル画像を取得する。 Fluo5N/Ca ²のパラレルイメージングのために⁺やRFP、8ビット画像は（256階調値）データのオーバーフローからシステムを救う可能性があります。
13. ImageJの互換性のあるフォーマット（ 例えば TIFF）において細胞時系列画像（X、YT）または3D画像スタック（X、YZ）を（Fluo5N/Ca ^{2 +}複合体の細胞分布のために）住んで保管してください。

8。画像処理とデータ解析

1. ImageJのプログラムで画像スタックを開きます。 ImageJので尋ねられたとき多色イメージングの場合には、RGBチャンネルを分割します。
2. （ 例えば強度対時間プロットの助けを借りて）画像スタックを慎重に検討することによって、興味（ROI）のお住まいの地域（複数可）を特定する
3. ROI（F _生 ）の平均ピクセル強度を読み出す時系列分析プラグインを使用してください。 DependinわざとG、完全ERまたは周辺セル領域の樹状突起のER 例えば ERの小領域のどちらかの周りのROIを描きます。また、バッ​​クグラウンド減算のための細胞を含まない領域で1-3 ROIが含まれています。
4. 背景ROIの平均蛍光値を計算することによって、平均バックグラウンド蛍光（F _b）に計算し、F _ROI値を取得するF _生の値からバックグラウンド値F b _を減算する。
5. 静止状態で各ROIのための10〜30蛍光値の平均値を計算することにより、細胞の基底蛍光でF _0を計算する。
6. 式でΔF/ F ₀による蛍光のバックグラウンド補正され相対的変化を計算します。

7. 内に存在する相対的な変化は、蛍光を発するY軸とX軸の時間のためのΔF/ F ₀のトレースとしてNCE。

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結果

このプロトコルは、無料のERカルシウムの直接イメージングのための非破壊的なアプローチを提供します。低親和性合成のCa ^{2 +}指標が解放され、標的ER、組換えエステラーゼ酵素活性の助けを借りて、ERの内腔に閉じ込められている。 ER内腔へのCa ^{2 +}指示薬色素の改良された負荷は、ERカルシウムストアダイナミクスの直接かつ高速イメージングを可能にします。

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ディスカッション

TED方法の利点と欠点は、最近の刊行物^34,35で広く議論されている。上述した他の方法に比べて、TEDは、細胞を破砕し、灌流の問題を回避する。さらに、二つの側面が強調される必要がある。 ERカルシウムイメージングのためのTEDの原理はTEDベクター構築の助けとの低親和性合成AM-エステルの（2）効率的かつ優先的なリリースで、ERの内腔に積極的にカルボキシルエステラーゼの（1）?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham's F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.