有機電気化学トランジスタにバリア組織破壊の検出

要約

有機電気化学トランジスタは、生細胞と統合および胃腸上皮バリアを横切ってイオン流束を監視するために使用される。本研究では、カルシウムキレート剤EGTA（エチレングリコール - ビス（ベータ - アミノエチルエーテル）-N、N、N '、N'-四酢酸の存在によって誘導密着結合の破壊に関連するイオン流束の増加、酸）を測定する。

要約

胃腸管は必要なイオンや分子の通過を可能にしながら、病原体および毒素の侵入に対する物理的なバリアを提供するバリア組織の一例である。この障壁内の違反は、細胞外のカルシウム濃度の低下によって引き起こされる場合があります。カルシウム濃度の減少は、傍細胞フラックスの増加をもたらす、バリアのシールに関与するタンパク質の立体構造変化を引き起こす。この効果を模倣するためにカルシウムキレート剤のエチレングリコール - ビス（β-アミノエチルエーテル）-N、N、N 'は、N'-四酢酸（EGTA）は、胃腸管の代表であることが知られている細胞の単層上で使用した。バリア組織の破壊を検出するためのさまざまな方法は、すでにこのような免疫蛍光及び透過性アッセイとして、存在しています。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、費用がかかり、動的またはハイスループットの測定に適していない。バリア組織を測定するための電子的方法整合性も上皮抵抗（TER）を測定するために存在するが、これらは多くの場合、高価で複雑である。バリア組織の完全性は、創薬および病原体/毒素診断において重要なパラメータであるように、急速な安価、かつ高感度な方法の開発が急務である。バリア組織形成細胞と一体化有機電気化学トランジスタ（OECT）は動的に、バリア組織の完全性を監視することが可能な新しいデバイスとして示されている。デバイスは、バリア組織の完全性の指標として、リアルタイムで、前例のない時間分解能および感度で、イオンフラックスの微小変化を測定することができる。この新しい方法は、ハイスループットスクリーニング用途と適合性であり、低コストで製造することができる簡単な装置に基づいている。

概要

胃腸上皮は、身体の異なる区画間での分子の通過を制御するバリア組織の一例である。上皮は、身体を維持するために必要な水や栄養素の通過を可能にしながら、病原体および毒素に対する物理的障壁^を提供する¹のタンパク質の複合体によって結合細長い円柱細胞からなる。ルーメンと下にある組織^2,3に固定された細胞の基底側に曝露された細胞の頂端側：この選択性は、二つの異なる膜ドメインを作成し、上皮細胞の分極に起因している。タイトジャンクション（TJ）は、上皮細胞の頂端部分に存在するタンパク質の複合体であり、頂端の接合部⁴として知られている大規模複合施設の一部である。バリア組織を横切るイオンの流れは、（セルスルー）経を介して、または（2隣接セル間の）傍細胞経路を介して行くことができるどちらか。の合計両方の経路を通る輸送は、上皮抵抗として知られている。頂端の接合部は、特定の開閉機能を介してバリア^5,6越え通過するイオンや分子の制御を担当しています。これらのタンパク質複合体の機能不全又は破壊は、多くの場合、疾患^7-11に関連している。さらに、多くの腸管病原体/毒素は^12-14障壁を横切るイオン/水の流れの大規模な調節不全の結果として、おそらく、それによって体内に侵入し、下痢をもたらす、特にこの複合体を標的化することが知られている。バリア組織はまた、細胞外微小環境を変化させることによって修飾することができる。カドヘリンは細胞 - 細胞接着に重要なタンパク質であり、頂端接合の形成に関与している。カルシウムは、カドヘリンの正しい構造コンフォメーションに必要であり、細胞外カルシウムの減少は、細胞 - 細胞間結合の破壊とその後の開口部をもたらすことが示されているセル¹⁵間の傍細胞経路。それが有する限り、この研究では、EGTA（エチレングリコール - ビス（β-アミノエチルエーテル）-N、N、N '、N'-四酢酸）、特定のカルシウムキレート剤は、バリア組織における侵害を誘導するために使用された傍細胞イオン流^16,17上で迅速かつ劇的な効果を有することが示された。このカルシウムキレート剤は、Caco-2細胞行のコンフルエントと差別化された単層で使用した。細胞培養インサートで培養し、この細胞株は、胃腸管の特性を発現することが知られており、広く^18,19薬物の吸収を試験するために製薬産業によって使用される。

バリア組織の完全性を監視するための方法はたくさんあり​​ます。これらの方法は、頂端側接合部²⁰であることが知られている特定のタンパク質の免疫蛍光染色に頼る、またはバリア組織に対して通常不浸透性である蛍光トレーサー分子の定量化に頼ることが多い光である21,22。ラベルの使用は、アーティファクトが発生し、多くの場合、コストと分析時間を増加させることができますしかし、（ つまり 、フルオロフォア/発色団のない）ラベルフリーの方法が好ましい。バリア組織の電気、ラベルフリーの監視は、最近の動的監視方法²³として浮上している。例えば、電気インピーダンス分光法における最近の技術的進歩は、経上皮抵抗（TER）、細胞膜を横切るイオン伝導度の測定値を測定することができる市販の走査装置^24,25の開発を可能にしている。

有機エレクトロニクスは、電子とイオンキャリアの両方を行うことができる導電性ポリマーを使用して電子機器や生物学^{26,27 28,29}の世界をインタフェースするユニークな機会を作成しました。 OECT ^30〜32を使用して、バリア組織内の違反を検出するための新しい技術が最近になって導入されました。このデバイスは、既存の技術問い合わせに対して検証したCellzscopeを用いて免疫蛍光、ルシファーイエローを使用して透過性アッセイ、およびインピーダンス分光含むバリア組織の完全性を評価するために編、。試験したすべての有害化合物の場合、OECTは同等以上の感度で動作することが見出され、そして上記の技術と比較して増加した時間分解能とした。この装置では、PEDOT：PSS、安定した^、33,34、生体適合性であることが示されている導電性ポリマーは、トランジスタ·チャネルにおいて活性物質として使用される。 OECTは、導電性ポリマー流路の両側にドレイン電極とソース電極から構成されている。これは、デバイスの一体部分を形成する電解質と接触して配置される。ゲート電極は、電解質（ 図1）に浸漬し、正のゲート電圧がゲートに印加されると、電解質から陽イオンは、このように導電性ポリマーを脱ドープし、ソース-ドレイン間の変更を伴う、チャネルに強制される現在。 Deviceは、このように、トランジスタによる増幅とイオンフラックスの分の変化に非常に敏感である。細胞培養インサート上で増殖させた細胞層は、ゲート電極と導電性高分子のチャネルとの間に配置した。無傷の細胞層の存在は、ドレイン電流が減少するが（：領域aからbまでの遷移図2）カチオンは無傷の単層の存在下で、従って、導電性ポリマーの中に入るための障壁として作用する。毒性化合物の存在下では、バリア組織が ​​徐々に陽イオンが高分子膜に入り、ドレイン電流（：領域c 図2）を増加させること、その完全性を失うことになる。この技術では、バリア組織における侵害単層を横切る磁束の変調に対応し、ドレイン電流の変調によって見られる。この装置は、リアルタイムで前例のない時間分解能および感度で、イオンフラックスの微小変化を測定することができる。この技術ウィルLは、薬物検査、病気の診断や関門モデルを簡単に適応させることができるように基礎研究のための毒物学の分野において関心がある。また、このメソッドは、それがin vitroモデルの検証がin vivo試験に置き換えることを可能にするように、動物実験を減らすのに役立ちます。

プロトコル

1。 PEDOT：PSS溶液の調製

1. PEDOT 50mlに：（PEDOTエチレングリコール：PSS）PSS、エチレングリコール（導電率を増加させる）を1:4の体積比での追加、0.5μlの/界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（DBSA）の溶液、および10mg /溶液をスライドガラスに導電性ポリマーの接着を促進するための架橋剤として3 - グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（GOPS）。

2。 OECT作製（図3）

1. リフトオフリソグラフィーを経由して熱的に蒸発した金ソースおよびドレインコンタクトを定義します。
   1. 30秒間3000rpmで通常の清浄なガラススライド上にコートしたフォトレジストをスピン。ガラスの寸法はインチ×1の3である
   2. フォトリソグラフィによりパターンを定義します。寸法は、しかし、ここに記載されている寸法は、最適な感度をもたらすことが示された、変更することができる。その後、現像液を使用しています。
   3. それぞれ、5 nmおよびクロムと金を100nmを蒸発させる。
   4. リフトオフACにおけるフォトレジストソースとドレインAuのみに接触面積を有する基板を残して1時間etone浴。
2. PEDOTの所望の長さ：PSSチャンネルは1mmである。これは、パリレン-C（Paの-C）剥離技術を用いてパターニングすることによって達成される。
   1. コー​​ティングのセットアップで、PA-Cの3.5グラムをロードします。一様に金接点を有する基板上にパリレン-Cの2程度を蒸発させる。
   2. フォトリソグラフィによるパターンのチャンネルを：
      1. 30秒間3000rpmでコートしたフォトレジストをスピン。
      2. 紫外線へのチャネルおよび金接点20秒を照射するためにマスクを使用し、露光されたフォトレジストを現像液に可溶となります。
      3. フォトレジスト上にチャネル領域を開くために、開発者を使用しています。
   3. チャネルと金接点を開くために15分間のプラズマステップ（O _2（50 SCCM）および160 WのCHF _4（3 SCCM）プラズマ）により、チャネル領域にPA-Cとエッチ。
3. でスピンコーティングによってPSS混合物溶液：PEDOTを堆積45秒間500 rpmで。 110℃で30秒間焼く
4. 剥離PA-Cは、PEDOTを明らかにする：下の基板のPSSチャネルを。このチャネルは、わずかにプロトコル1で行われた金接点と重複する必要があります。
5. 大気条件下で140℃で1時間ベークサンプル。

3。デバイス組立

1. 基本中の溶液を硬化さとの比1:10（通常キットに一緒に付属）2溶液を混合することによって、PDMSを作る。 120℃で1時間焼く
2. 穴パンチを使って、うまく設計し、所望の領域の周りの正方形をカット。
3. 約6mm ²の流路面積をもたらすように、チャネルの上にウェルを接着PDMS。ソースおよびドレイン電極がカバーされていないことを確認してください。
4. それの穴（セルカルチャーインサート用のホルダを使用することができます）とプラスチック製のサポートを行ってから、PDMSの上に接着します。一晩乾燥してみましょう。
5. ワットで予備充填により漏れたためによくをテストER。
6. スズと、ソースとドレインの接触時に電線を半田付けします。

4。細胞培養

1. 次のように細胞培養培地を調製する。
   1. DMEM中で、1％グルタミン、10％ウシ胎児血清、0.5％ペニシリン - ストレプトマイシン、および0.1％ゲンタマイシンを追加。
   2. 滅菌フィルター装置を用いた細胞培養培地を滅菌する。
2. 細胞培養培地中で、5％CO ₂の加湿雰囲気中、37℃で通路49と68との間のCaco-2細胞を維持する。
3. 一度1.5×10 ⁴細胞/挿入でトリプシンおよび種子を使用して週にセルを分割します。
4. 細胞培養培地は、3週間にわたり週二回変化する。

5。 OECTによる測定

1. ゲート電極として使用するためにソースメータに銀/塩化銀線を接続します図1aに示すように、電解質として使用する細胞培養培地中に先端を浸し。
2. Tに、ソースとドレインから配線を接続彼はソースメータ（デュアルチャネル設定）。
3. 方形パルスに正の電圧（：地上基準電極として使用される）、ゲート·ソース間（V _GS）を適用します。ドレインとソース（V _DS）との間の負の定電圧が印加され、対応する電流（I _DS）が測定される。
4. パソコン、実行中のプログラムのデータ収集を使用してください。次のようにカスタマイズされた取得プログラムに入力されたOECTパラメータは次のようになります。V _DS =-0.2V、V _GS = 0.3 V、V _GS時間に= 2秒、オフ時間= 28秒。
5. ソース-ドレイン電流（I _DS）、ゲート電流（I _GS）を読み出す。安定したベースライン信号を確実にするために数分間測定を行う。

6。測定のためにOECTで細胞を統合

注：実験前に、細胞層の完全性は、インピーダンス分光素子とTERを測定することによって検証することができる。それぞれ3週齢のCaco-2細胞InSeにのTERRTは400Ωを超えるべきである^{。CM 2。}

1. OECT測定のオフ時間中：、電解質からゲート電極を取り外し、細胞培養インサートを組み込んで、細胞培養インサートの内部にゲート電極を置き換える。
2. 安定した信号を確実にするために数分間細胞とベースライン測定を実施しています。このベースラインは、インタクトな単層（0）に対応する正規化値を算出するためとして使用される。

7。毒性化合物の合成と紹介

1. 第トリス塩基で7.4に溶液のpHを調整する、DI水にEGTAの1 M溶液を調製する。
2. 考慮容積をとる（ 例えば 、5 mMおよび100 mMの間）に所望の濃度を得るために、適切な容量のEGTA溶液を加える。 EGTAはオフ時間の間、基底チャンバー内に追加する必要があります。
3. プロトコル5のように90分間連続して測定します。測定はBEIの場合ngの室温で行って、細胞の安定性は、90分後に一定のままではありません。
4. 実行の最後に、この点は、フィルタを除去し、培地中のゲート電極を浸漬することにより行うことができる15分間バリア層と測度の完全な破壊をもたらすのに細胞層を傷つける。このベースラインは、破壊された単層に対応する正規化された値の計算のためとして使用されます。

結果

測定の最初の段階の間に、ドレイン電流が多少変動してもよいが、ほとんどの場合（ 図2、区間a）安定なままであるべきである。信号が安定していない場合には、トランジスタを廃棄、交換する必要があります。この安定性チェックは、デバイスの導電率のいずれかの最初の損失は、その後の測定に影響を与えないことが保証されます。測定の数分後、細胞は、バリア形成組織?...

ディスカッション

この技術は、バリア組織の完全性を測定するために生きた細胞を用いて、有機電気化学トランジスタを統合するための新規な方法を提供する。この技術の主な利点は、迅速性及び感度でなく、バ​​リア組織の動的監視のための装置の低コストである。

この方法は、生細胞を使用するので、重要な点は、完全なバリア層を表している単分子層を、使用してくださいする?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clevios pH 1000	Heraus Clevios
AZ9260 resin	Cipec Specialties
Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA)	Acros Organic
3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS)	Sigma Aldrich
24-well Suspended cell Culture insert Millicell  PET 0.4 μm Millipore	Dominique Dutscher	51705
24-well Cell culture plate BD Falcon	Dominique Dutscher	51705
Stericup-GPT PES 0.22 μM	Dominique Dutscher	51246
Advanced DMEM Marque GIBCO	Fisher Scientific	E3434T
FBS Heat Inact.	Fisher Scientific	E3387M
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific	E3470C
GlutaMAX	Fisher Scientific	E3524T
Trypsin 0.05% EDTA	Fisher Scientific	E3513N
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma Aldrich	E4378
Ethylene glycol, anhydrous, 99.8%,	Sigma Aldrich
Caco-2 cells	ATCC
PDMS	Dow Corning	SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER
Au (99.99%)	NEYCO	AU3X6
Chromium (99.95%)	NEYCO
Parylene C	Specialty Coating Systems
Ag/AgCl wire	Harvard Apparatus
Photoresist	Cipec Specialties