Зондирование Барьерного ткани Срыв с транзистора Органическая Электрохимический

Резюме

Органический Электрохимический транзистор интегрирован с живыми клетками и используется для контроля поток ионов через желудочно-кишечный эпителиальный барьер. В этом исследовании, увеличение потока ионов, связанных с нарушением плотных контактов, индуцированной присутствии хелатора кальций EGTA (этиленгликоль-бис (бета-аминоэтил эфир)-N, N, N ', N'-тетра уксусной кислота), измеряется.

Аннотация

Желудочно-кишечного тракта является примером барьерной ткани, что обеспечивает физический барьер от проникновения патогенов и токсинов, позволяя при этом прохождение необходимых ионов и молекул. Нарушение этого барьера может быть вызвана снижением внеклеточной концентрации кальция. Это уменьшение концентрации кальция вызывает конформационное изменение белков, участвующих в герметизации барьера, что приводит к увеличению потока парацеллюлярной. Для имитации этого эффекта кальциевые хелатор этиленгликоля-бис (бета-аминоэтил эфир)-N, N, N ', N'-тетра уксусной кислоты (EGTA) использовали на монослой клеток, известных как представитель из желудочно-кишечного тракта. Различные методы для обнаружения нарушения барьерной ткани уже существуют, например, иммунофлюоресценции и проницаемости анализов. Однако эти методы требуют больших затрат времени и дорого и не подходит для динамических или высокой пропускной измерений. Электронные методы измерения барьерную тканьЦелостность также существуют для измерения сопротивления трансэпителиальной (TER), однако они часто дорогостоящим и сложным. Развитие быстрых, дешевых и чувствительных методов срочно необходима как целостность барьера ткани является ключевым параметром в лекарственных препаратах и ​​диагностике возбудителя / токсина. Органический электрохимический транзистор (OECT) интегрирован с барьером ткань формирования клеток было показано как новое устройство, способный динамически контроль целостности барьерной ткани. Устройство может измерять мельчайшие изменения в ионной потока с беспрецедентной временным разрешением и чувствительностью, в реальном времени, в качестве индикатора целостности барьерного ткани. Этот новый способ основан на простое устройство, которое может быть совместим с скрининга приложений с высокой пропускной способностью и изготовлен по низкой цене.

Введение

Желудочно-кишечный эпителий является примером барьерной ткани, который контролирует прохождение молекул между различными отсеков тела. Эпителий состоит из удлиненных столбчатых клеток соединены друг с другом комплексов белков, которые обеспечивают физический барьер ¹ против патогенов и токсинов, позволяя при этом прохождение воды и питательных веществ, необходимых для поддержания тела. Такая избирательность обусловлена ​​поляризации эпителиальных клеток, что создает два различных мембранных доменов: апикальной стороне клеток, подвергнутых воздействию просвета и базальной стороне клеток на якорь на подлежащие ткани ^2,3. Плотные соединения (TJ) представляют собой комплексы белков, присутствующих на апикальной части эпителиальных клеток и являются частью более крупного комплекса, известного как апикальной стыке ^4. Ион поток через барьер ткани может либо пойти через трансцеллюлярного (через ячейку) или через парацеллюлярная (между двумя соседними клетками) тропа. Сумматранспорт через обоих путей известен как сопротивление трансэпителиальной. Апикальный узел отвечает за регулирование ионов и молекул, проходящих через барьер ^5,6 с помощью специальной открытия и закрытия функции. Дисфункция или нарушение этих белковых комплексов часто связано с болезнью ^7-11. Кроме того, многие кишечные возбудителей / токсины, как известно, в частности, цель данного комплекса, таким образом, поступающих в организм и приводит к диарее, скорее всего, как следствие массивной регуляции потока ион / воды через барьер ^12-14. Барьер ткани могут быть также модифицированы путем изменения внеклеточного микросреду. Cadherin является критическим для белок межклеточной адгезии, а также участвует в формировании апикальной перехода. Кальций необходим для правильного структурной конформации кадгерина, и уменьшение внеклеточный кальций, как было показано привести к разрушению клетка-клетка перехода и последующего открытияпарацеллюлярная путь между клетками ^15. В этом исследовании, EGTA (этиленгликоль-бис (бета-аминоэтил эфир)-N, N, N ', N'-тетра уксусной кислоты), специфический хелатирующий агент кальция, был использован, чтобы вызвать нарушение в барьерной ткани, как это имеет Было показано, что быстрое и сильное воздействие на парацеллюлярной потока ионов ^16,17. Этот хелатор кальций был использован на сливной и дифференцированной монослое клеточной линии Сасо-2. Искусственный в культуре клеток вставки, эта клеточная линия, как известно, развивать характеристики желудочно-кишечного тракта и широко используется в фармацевтической промышленности для проверки всасывание лекарственных ^18,19.

Методы для мониторинга целостности барьера тканей многочисленны. Эти методы часто оптические, опираясь на иммунофлюоресцентного окрашивания конкретных белков, известных как в апикальной стыке ^20, или опираясь на количественного флуоресцентного индикаторного молекулы, который обычно непроницаемы для барьерной ткани21,22. Тем не менее, без наклеек методы (то есть без флуорофора / хромофора) являются предпочтительными в качестве использование этикетке может понести артефакты, и часто увеличивает стоимость и анализа времени. Электрические, этикетка без мониторинг барьера ткани недавно стала динамического метода мониторинга ^23. Например последних технологических достижений в электрической импедансной спектроскопии позволили развитие коммерчески доступного аппарата сканирования ^24,25, который может измерять трансэпителиальный сопротивление (TER), измерения ионного проводимости через клеточную слоя.

Органическая электроника создал уникальную возможность для взаимодействия в мире электроники и биологии ^{26,27 28,29} помощью проводящих полимеров, которые могут проводить как электронные, так и ионные носители. Новая техника для выявления нарушений в барьерном ткани с помощью OECT ^30-32 недавно был введен. Это устройство было сверяются существующих методик насред оценить целостности барьера тканей, в том числе иммунофлюоресценции, анализов проницаемости с использованием Люцифер желтый и импедансной спектроскопии с помощью Cellzscope. В случае всех токсичных соединений была OECT было обнаружено работать с равной или лучшей чувствительности и с повышенным временным разрешением по сравнению с вышеуказанными методами. В этом устройстве PEDOT: PSS, проводящий полимер, который, как было показано, чтобы быть стабильной и биосовместимый ^33,34, используется в качестве активного материала в канале транзистора. OECT состоит из сливных и исходных электродов по обе стороны от полимерного электропроводного канала. Это затем вводят в контакт с электролитом, который образует неотъемлемую часть устройства. Ворота электрод погружают в электролит (рис. 1), а в случае положительного напряжения на затворе применяется в воротах, катионы из электролита вынуждены в канале, тем самым dedoping проводящий полимер и приводит к изменению в исток-сток тока. Гevice Таким образом, чрезвычайно чувствительны к малейшие изменения в ионной потока из-за усиления по транзистора. Слой клеток, выращенных на культуре клеток вставки был помещен между электродом затвора и проводящего полимера канала. Наличие неповрежденной слоя клеток выступает в качестве барьера для катионы, входящие в проводящего полимера, таким образом, в присутствии неповрежденной монослоя, ток уменьшается дренажные (рис. 2: переход от области А: В). В присутствии токсичных соединения, барьер ткань будет постепенно терять свою целостность, позволяя катионы войти в полимерной пленки и повышение ток стока (Рисунок 2: область с). С помощью данной методики, нарушение в барьерной ткани рассматривается модуляции тока стока, соответствующая модуляции потока через монослой. Это устройство может измерять мельчайшие изменения в ионной потока с беспрецедентной временным разрешением и чувствительностью в режиме реального времени. Данная технология Вильл представлять интерес в области токсикологии для тестирования на наркотики, диагностики заболеваний или фундаментальных исследований, как модель барьер может быть легко адаптированы. Этот метод также поможет уменьшить экспериментов на животных, так как позволяет валидация моделей в пробирке, чтобы заменить в естественных условиях тестирования.

протокол

1. PEDOT: PSS Подготовка решения

1. К 50 мл PEDOT: PSS, добавить этиленгликоль (увеличивает проводимость) в объемном соотношении 1:4 (этиленгликоль к PEDOT: PSS), 0,5 мкл / мл додецилбензолсульфокислоты (БРЮА) в качестве поверхностно-активного вещества и 10 мг / мл 3-глицидоксипропилтриметоксисилан (GOPS) в качестве сшивающего агента для содействия адгезии проводящего полимера на стекле.

2. OECT Изготовление (рис. 3)

1. Определить термически испарились золотые истоком и стоком контакты через старт литографии:
   1. Спин пальто фоторезиста на нормальном чистым стекло при 3000 оборотах в минуту в течение 30 сек. Размеры стекла являются 3 х 1 дюйма
   2. Определить закономерности с помощью фотолитографии. Размеры могут быть изменены, однако размеры, указанные здесь были показаны привести к оптимальной чувствительности. Затем с помощью разработчика.
   3. Выпаривают 5 нм и 100 нм хрома и золота соответственно.
   4. Старт фоторезиста в переменномЭтоне ванна в течение 1 часа, в результате чего подложку с истоком и стоком Au только область контакты.
2. Желаемый длина PEDOT: PSS канал 1 мм. Это достигается за счет рисунка с использованием парилен-C (Pa-C) отслаивания техники:
   1. Загрузите 3,5 г Па-C в настройках покрытия. Равномерно испаряться 2 мкМ Parylene-C на верхней части подложки с Au контактов.
   2. Шаблон канал с помощью фотолитографии:
      1. Спин пальто фоторезиста на 3000 оборотах в минуту в течение 30 сек.
      2. Используйте маску для освещения канал и золотой контакт 20 сек к УФ, подвергаются фоторезиста станет растворим в разработчика.
      3. С помощью проявителя, чтобы открыть область канала на фоторезиста.
   3. Протравите Па-C в области канала на шаг плазмы 15 мин (О ₂ (50 стандартных см) и CHF ₄ (3 стандартных см) плазменный при 160 W), чтобы открыть канал и золотую контакт.
3. Депозит в PEDOT: PSS смесь раствора методом центрифугирования при500 оборотов в минуту в течение 45 сек. Выпекать в течение 30 сек при 110 ° С
4. Пил-офф Па-С выявить PEDOT: PSS канал подложки под ним. Этот канал должен слегка перекрывать с контактами Au, сделанных в Протоколе 1.
5. Образцы Выпекать в течение 1 часа при 140 ° С в атмосферных условиях.

3. Ассамблея устройства

1. Сделать PDMS путем смешивания двух растворов (обычно поставляемые вместе в комплекте) при соотношении 1:10 отверждения решение в базовой решения. Выпекать его в течение 1 часа при 120 ° С
2. Дизайн также с помощью дырокола и вырезать прямоугольник вокруг нужной области.
3. Клей PDMS хорошо на верхней части канала, чтобы привести в зоне канала приблизительно 6 мм ^2. Убедитесь, что истоком и стоком контакты не распространяется.
4. Сделать пластиковый поддержку с отверстием в нем (можно использовать держатель для культивирования клеток вставки), а затем приклейте ее на вершине PDMS. Дайте ему высохнуть в течение ночи.
5. Протестируйте хорошо, не просыпался по prefilling с Ватэ.
6. Припой электрические провода на источник и сток контакте с оловом.

4. Культура клеток

1. Подготовка культуральной среды клеток следующим образом:
   1. В DMEM, добавьте 1% глутамина, 10% фетальной бычьей сыворотки, 0,5% пенициллин-стрептомицин и 0,1% гентамицина.
   2. Стерилизовать культуры клеток с помощью стерильного фильтрующее устройство.
2. Поддержание клеток Сасо-2 прохода между 49 и 68 при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO _2, в культуральной среде клеток.
3. Разделите клетки один раз в неделю, используя трипсин и семена в 1,5 х 10 ⁴ клеток / вставки.
4. Изменение питательных сред клеток два раза в неделю в течение 3 недель.

5. Измерения с OECT

1. Подключение провод Ag / AgCl в sourcemeter для использования в качестве электрода затвора. Погрузить наконечник в культуральной среде клеток, который используется в качестве электролита, как показано на фиг.1а.
2. Подключите провода от истоком и стоком тон sourcemeter (установку двухканальный).
3. Применить прямоугольный импульс положительного напряжения (V _GS) между затвором и истоком (используется в качестве электрода сравнения: на первом). Отрицательное постоянное напряжение между стоком и истоком (V _ДП) наносят и соответствующий ток (I _DS) измеряется.
4. Используйте сбор данных программы работает ПК. OECT параметры, введенные в настроенной программы приобретения должны быть следующими: V _DS = -0,2 В, V _GS = 0,3 В, V _GS на время = 2 сек, время выключения = 28 сек.
5. Считать ток исток-сток (я _DS) и ток затвора (я _GS). Провести измерения в течение нескольких минут, чтобы обеспечить стабильную базовую сигнал.

6. Интеграция клеток с OECT для измерения

Примечание: Перед эксперимента, целостность клеточной слоя может быть проверена путем измерения ТЭР с импедансной спектроскопии устройства. ТЕР каждого 3-недельного Сасо-2 клетки InSeRT должна быть выше 400 ^Ω. см ^2.

1. Во время отключения измерения OECT: Снимите электрод затвора из электролита, включить клеточной культуры вставки и заменить электрод затвора внутри клеточной культуры вставки.
2. Провести базовый измерение с клетками в течение нескольких минут, чтобы обеспечить стабильный сигнал. Этот базовый будет использоваться как для вычисления нормализованной величины, соответствующей интактной монослоя (0).

7. Подготовка и внедрение токсичным соединением

1. Подготовка 1М раствор EGTA в деионизированной воде, сначала доведение рН раствора до 7,4 с помощью трис-основания.
2. Добавить EGTA решение в соответствующем объеме, чтобы получить нужную концентрацию (например от 5 мм до 100 мм), принимая во внимание объем. EGTA должны быть добавлены в базальном камере в течение мертвого времени.
3. Измерьте непрерывно в течение 90 мин, как в Протоколе 5. Если измерение байнг проводят при комнатной температуре, устойчивость клеток не будет оставаться постоянной через 90 мин.
4. В конце концов, поцарапать слой клеток, приведет к полному разрушению барьерным слоем и мере в течение 15 мин, эта точка может быть сделано путем удаления фильтра и погружая электрод затвора в средствах массовой информации. Этот базовый будет использоваться как для вычисления нормализованной величины, соответствующей разрушенного монослое.

Результаты

На первом этапе измерения, ток стока может изменяться до некоторой степени, но в большинстве случаев должны оставаться стабильными (рис. 2, раздел а). Если сигнал не является стабильным, транзистор должен быть уничтожен и заменен. Эта проверка стабильности также гарантирует, чт?...

Обсуждение

Эта техника обеспечивает новый способ интеграции органический электрохимический транзистор с живых клеток для измерения целостности барьера ткани. Основные преимущества этого метода являются быстрота и чувствительность, но и низкая стоимость устройства для динамического монитори?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clevios pH 1000	Heraus Clevios
AZ9260 resin	Cipec Specialties
Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA)	Acros Organic
3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS)	Sigma Aldrich
24-well Suspended cell Culture insert Millicell  PET 0.4 μm Millipore	Dominique Dutscher	51705
24-well Cell culture plate BD Falcon	Dominique Dutscher	51705
Stericup-GPT PES 0.22 μM	Dominique Dutscher	51246
Advanced DMEM Marque GIBCO	Fisher Scientific	E3434T
FBS Heat Inact.	Fisher Scientific	E3387M
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific	E3470C
GlutaMAX	Fisher Scientific	E3524T
Trypsin 0.05% EDTA	Fisher Scientific	E3513N
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma Aldrich	E4378
Ethylene glycol, anhydrous, 99.8%,	Sigma Aldrich
Caco-2 cells	ATCC
PDMS	Dow Corning	SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER
Au (99.99%)	NEYCO	AU3X6
Chromium (99.95%)	NEYCO
Parylene C	Specialty Coating Systems
Ag/AgCl wire	Harvard Apparatus
Photoresist	Cipec Specialties