くも膜下出血の急性および後期後遺症の研究のためのウサギの血液シャントモデル：技術的側面

要約

The experimental intracranial pressure-controlled blood shunt subarachnoid hemorrhage (SAH) model in the rabbit combines the standard procedures — subclavian artery cannulation and transcutaneous cisterna magna puncture, which enables close mimicking of human pathophysiological conditions after SAH. We present step-by-step instructions and discuss key surgical points for successful experimental SAH creation.

要約

初期の脳損傷および遅延脳血管攣縮の両方が、くも膜下出血（SAH）後に不利な結果に貢献しています。両方の条件をシミュレートし、再現可能かつ制御可能な動物モデルは、現在、まれである。したがって、新しいモデルはSAHに起因するヒトの病態生理学的状態を模倣するために必要とされる。

このレポートでは、脳内の圧力（ICP）の制御を可能にウサギ血液シャントSAHモデルの技術的なニュアンスを説明しています。体外シャントは、動脈系と閉じた頭蓋内、検者に依存しないSAHを可能にくも膜下腔、の間に配置される。ステップバイステップの手続きの手順や必要な機器が記載されているだけでなく、技術的な検討事項最小限の死亡率および罹患率を持つモデルを生成する。この堅牢シンプルで一貫性のICP-制御SAHのウサギモデルの成功の外科的作成に必要な重要な詳細が説明されている。

概要

くも膜下出血（SAH）は、頻繁に永続的な神経障害や死につながる^1、神経病理学的な条件を脅かす最も生命の一つです。過去の研究では、SAH ²に関連する神経障害の主要な病因として、遅延脳血管攣縮（DCVS）に焦点を当てている。しかし、血管痙攣の治療後にSAHに罹患している患者の一般的に不良な臨床転帰は、SAH ³後早期脳損傷（EBI）の影響を含めるための研究の焦点の拡大をもたらした。 SAH後の不良な臨床転帰に貢献するEBIとDCVS両方の重要性の理解は、より効果的な治療戦略の開発に不可欠である。

これまで、大槽へのシングルとダブルの自己血注入はDCVS ^2-6の研究のためのSAH誘導のための標準的な方法であった。一般的に、以前の研究で使用されているが、このモデルは最も可能性の高いEBI ⁷誘発性SAHに関連した神経病理学主要な変更点を再現していません。対照的に、血管穿孔を部分的EBI ⁷の症状を模倣する重度の急性病態生理学的変化を生じることが知られている。

このレポートでは、SAHの新規ウサギモデルが記載された技術では、標準的な大槽モデルは動脈系を接続することにより適合されている_。それによって、SAH誘発性病理^8-10のより正確な特性評価が可能、EBIとDCVS両方の調査を可能にするように設計について説明します体外シャントを経由して鎖骨下動脈と大槽の。血流がそれによってウサギの生理機能にリンクされ、動脈血および頭蓋内圧との間の圧力勾配によって駆動される。脳内の圧力（ICP）は、拡張期血圧が等しく、シャントシステム内の血液が凝固する際の出血が停止します。ホスト＆＃を利用し8217;の生理機能を確実EBIとDCVS両方の表現型^3,8-10を生産SAHのより一貫性のあるモデルにつながる、審査官依存のSAH誘導を低減します。

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プロトコル

2.5計量三ヶ月齢の雌のニュージーランドウサギ - 3.5キロは、この手順のために使用された。この研究は、実験動物の管理と使用のための健康ガイドラインの国立研究所に従ってベルン、スイス（承認＃105/13）のカントンの動物管理委員会の承認を得て実施した。すべての外科的処置はベルン、スイスのベルン大学病院での臨床研究科の実験的手術研究所で、無菌条件下で行った。獣医麻酔科医は手術中におよび回復を通して動物を監視した。

1動物の準備、位置決めおよび鎖骨下動脈のカニューレ挿入

1. 有害に対するウサギの反応をチェックすることによって、麻酔の制御深さケタミンの筋肉内注射（30mg / kgの;ケタラール、50 mg / ml）をウサギに全身麻酔を誘導し、キシラジン（Xylapan 20 mg / mlのkgを6ミリグラム/） stimulatイオン（ 例えば、つま先のピンチ）。肯定的な応答の場合には1.7を参照してください。
2. 両眼の下蓋をプルダウンして、乾燥やさらなる刺激を防止するために、まぶたに軟膏を少量を適用します。
3. 、20 Gbutterflyのvenflon（20 G血管カテーテル）と横方向の耳静脈にカテーテルを挿入粘着テープで固定し、0.9％塩化ナトリウム（500ミリリットル/ 24時間）およびケタミン（40ミリグラム/ kg /時間）を含む重力バッグに接続する持続静脈内（IV）麻酔用/キシラジン（4 / kg /時間）。追加の鎮痛薬を15分毎に静脈（フェンタニル、1マイクログラム/ kg）を管理します。注意：CPPの低下と関連している揮発性のガス麻酔薬、CBFを増加し、酸素が ​​脳代謝率を低下させるの回避¹¹静脈麻酔薬が脳研究する最上重要であり、CBF、脳血管収縮^、12を保存^することにより、脳神経外科麻酔のためのより理想的な特性を提供する。血管攣縮。加えて、死亡率がSPONTで増加するもののaneously動物呼吸、それはより良い急性SAHのヒトの状況を模倣することがあります。
4. 呼気終末二酸化炭素（ETCO _2）監視を可能にする呼吸マスクを介して- （2L /分1）酸素吸入を行う。
5. ウサギの腹側の三角形の配置で3チャネル心電図（ECG）.Place 3皮下電極をインストールします。具体的には、両方の手足に分布下腹部に二つの電極（鎖骨下動脈カニューレ挿入のための無菌剃らフィールドまでの距離で）右midthoracic領域上に一方の電極を配置します。
6. 呼吸速度に追従して、手術中の麻酔深度を15分毎に監視し、心拍数（HR）は、ECG信号から監視し、侵害刺激に対する反応。
7. 侵害刺激に対する肯定応答（つま先ピンチ）の場合は、ケタミンボーラスによって麻酔深度を適応させる（6ミリグラム/ kg）を静脈内およびキシラジンボーラス（0.05ミリグラム/ kg）を静脈内および/またはフェンタニル（1 MCでさらに鎮痛ボーラスグラム/ kg）を静脈内
8. ダウンヘッド20°に傾けると鎖骨下動脈が露出される側に対側に少し回転、ボディ温暖化プレート上の仰臥位でウサギを修正しました。
9. 眼軟膏を適用し、鎖骨の中央3分の周りの右胸筋の上、およびfrontal-、parietal-と後頭部頭蓋骨、首の上に、右大腿動脈の上の毛を剃ることにより、手術の領域を用意。
10. 防腐剤、広域スペクトル、 例えば 、ポビドンヨードで3分間の皮膚を消毒。
11. 無菌シートウサギをカバー。無菌条件下でさらなるすべての手順を実行し、頻繁に局所的に血管の操作や地元の感染によって動脈血管攣縮を防ぐために、HClおよび抗生物質溶液（硫酸ネオマイシン5 mg / ml）をパパベリン4％を適用します。
12. 局所麻酔薬（リドカイン1％の最大6ミリグラム/ kg）で胸筋潜入。胸骨皮膚切開を行い、準備を胸筋。顕微鏡を使用して、鎖骨下動脈を解剖し、露出端の周り近位および遠位合字（4-0 polyfilament縫合糸）で固定します。カテーテルを確保し、遠位に容器を連結する場所に近い端の制御に1合字にしてください。
13. 湾曲したmicroscissorで動脈を切開することによって鎖骨下動脈の壁に動脈切開を行い、小血管内三方活栓に逆行鎖骨下動脈にカニューレを挿入。動脈の近位部の動脈ねじれや曲がりを防ぎ、滑りや大量出血を回避するために、遠位合字に向かってダブルノット結紮によってカテーテルを固定します。

2血圧や動脈血ガスモニタリング

1. 動脈血ガス（ABG）用の血管内カニューレは、pHが、PACO _2、のPaO _2、重炭酸塩、塩基過剰、およびSO _2、ⅱ）侵襲動脈血を分析）をiに3方コックを接続します圧力測定装置、およびiii）シャント装置。
2. ABGステータスの血液サンプルを（パコ₂のPaO _2）を収集し、連続的にアナログアナログ出力インタフェースを介して、標準的な心血管及び呼吸パラメータ（血圧、心拍、ECG、呼吸数および呼吸終期CO _2）と転送データを監視デジタル·コンバータ/データロガーとストア。
   注：圧力が前と各セッションの後に心臓レベルでゼロにされ、シリーズが始まる前に、アナログ/デジタル変換器とデータロギングシステムの圧力校正は一回行われます。

3ベースラインデジタルサブトラクション血管造影

1. 血管造影を校正するために、両方の下顎角にわたって外部サイジング装置（小球）を配置します。
   注：これは、ベースラインの事後測定値の正確な比較を可能にし、血管径をフォローアップ。
2. 逆行内aでデジタルサブトラクション血管造影（DSA）を実行非イオン性イオパミドールのrterialボーラス注入カニューレを挿入し動脈を通る（0.6ミリリットル/ kgで、2秒、5ミリリットル/秒）、後者の閉塞を防止するために、生理食塩水ボーラス注射の直後にカニューレをフラッシュ。
3. 5°、左前方の斜めの位置に迅速なシーケンシャル血管造影記録を使用して、椎骨システムの画像（14秒7イメージ）を取得します。
4. 局所麻酔薬（リドカイン1％、最大で6ミリグラム/ kg）で右総大腿動脈の周りの領域を潜入。小さな鼠径皮膚切開を行います。可視化のための顕微鏡を用いて、総大腿動脈を解剖し、露出端の周りの近位および遠位合字（4-0 polyfilament縫合）で固定します。
5. 動脈切開後、5-Fシースと大腿動脈にカニューレを挿入。生理食塩水でシースのサイドポートをフラッシュします。
6. X線透視下でシースを通して腕頭動脈内に5-Fカテーテルを進める。目にガイドワイヤを進めるその後、ロードマップを作成します。電子椎骨システム。ステップ3.2で説明したように、DSAのための非イオン性イオパミドール（0.6ミリリットル/ kgで、2秒での5ミリリットル/秒）のボーラスを注入。

腹臥位に4回転

1. ベースラインDSAに続いて、仰臥位から​​腹臥位にウサギを再配置する。動脈内のカテーテルの位置を操作したり、再配置しないように注意してください。
2. ダウン頭を重視、30°の角度でヘッドホルダーヘッドを置きます。

5。大槽穿刺

1. 1分ごとに、ポビドンヨード3回で頭と首の上の皮膚を消毒し、滅菌シーツ手術領域をカバーしています。
2. 事前の皮膚切開や筋肉のずれなく経皮大槽内に22 Gのx 40ミリメートル小児脊髄アクセス針を挿入します。
3. 動物が完全に骨の外後頭隆起に沿って針を滑り落ちる前に、つま先のピンチ応答の欠如を確実にすることによって麻酔していることを確認してくださいギャップが検出されるまで;それ以上の針をプッシュしないでください。
4. 少数分間20°の角度で下方に傾斜したウサギの頭部に脳脊髄液の自発的な滴下を観察することによって、針の正確な位置を確認してください。

頭蓋内圧と脳血流のモニタリング6。インストール

1. 正中線皮膚や帽状切開した後、小さな手術用リトラクターを挿入します。
2. 嗅球とneuromonitoringデバイスを配置するための二国間の前頭場合の上、外側頭蓋骨のランドマーク（ 図^1）9、 すなわちに従って頭蓋骨の正面部分の高速マイクロドリルを使用して、3ラウンドの骨切り術（直径2mm）を作る必要に応じて。次のようにバーホールの配置の座標を決定するために、ミリメートルスケールの定規を使用します。midpupillaryラインの頭蓋内圧（ICP）の監視、正中矢状線から1〜2ミリメートル;実質内レーザードップラープローブ4〜5ミリメートルの前方およびブレグマの側方（ 図1）。
3. 硬膜を視覚化し、細心の止血を行います。そのタンポナーデ作用により骨止血用の骨ろうを使用し、硬膜のバイポーラ凝固を使用してローカル止血を行う。
4. 実質内頭蓋内圧（ICP）2ミリメートルの深さまで右嗅球にヒントを監視し、キャリブレーションを配置します。
5. 外部クランプ·システムを使用して2レーザードップラーフローメトリ細い針プローブを置き、左右の前頭半球の両方が脳脊髄液との干渉を避けるために、正中線で、脳室系、 すなわちに横に対応したバーホールに挿入してください。 2.5mmの深さまで針プローブを配置します。
6. neuromonitoringプローブを配置した後、頭蓋の流体密封を維持するために骨ろうの厚いプラグのすべてのバリ穴をシール。
7. 平均動脈血圧のベースラインパラメータを測定（MAP）、ICPおよびマルチパラメータモニタと4チャンネルレーザードップラー組織血灌流モニターを使用して脳血流量（CBF）。

7。シャント誘導

1. 血液で満たされた圧力モニタリング管を介して以前にカテーテルを挿入鎖骨下動脈に、大槽内、脊髄アクセス針を接続します。血圧測定のための採血ポートに三方活栓を使用する。
   NOTE：SAHの重症度は、血液の量に依存し、ほぼ脳収穫^5,11時のくも膜下凝血塊の広大によって推定することができる。
2. 継続的SAH後少なくとも20分まで前に6分〜1Hzのサンプリングレートで、MAP、HR、心電図、呼吸数や呼吸終期CO _2を監視します。
3. 動物が完全に鎖骨下動脈と大槽圧力gradieによるSAHを誘導するために間にシャント接続を開く前に足指のピンチ応答の欠如を確実にすることによって麻酔していることを確認してくださいNT。
   NOTE：（ たとえば 、ICPの所望のレベル）に制御SAHは、任意の時点でシャントを閉じることによって達成することができる。
4. 約15分の期間中に定常状態の値を記録する。
5. ICPはそのピークに達した後、ICPは、ベースライン値に近い定常状態に戻るまで、所定の位置に脊椎アクセス針を保持します。 ICP高原以上10秒間維持されるか、またはICPは自然に減少した場合、シャントを閉じます。された場合
6. 、（連続的な出血カテーテル操作が高い罹患率と死亡率と関連し、感染率が増加しているため、鎖骨下カテーテルを含む）すべてのカテーテルを取り外し、骨ろうでバー​​ホールを差し込み、CBF細針プローブおよびICPプローブを削除した厳格な創傷洗浄を行う硫酸ネオマイシンと皮膚を縫合。

8。術後管理

1. 手順は約2時間持続する。原因ケタミンおよびキシラジン、アニマの回復時間の半減期に約1時間 - lはかなり短いです。動物は、回復時の加熱ランプの下で保持されます。追加の流体が供給されない。この最初の術後の回復期の間、ブプレノルフィン0.02ミリグラム/ kg皮下24時間毎に8時間適用されます。
2. 次の72時間にわたって効果的な鎮痛のための動物の毛を剃り、首領域において12.5μgの/時間を解放する経皮フェンタニルマトリックスパッチを適用します。
3. それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人の動物を放置しないでください。
4. 完全に回復するまで、他の動物の会社で手術を受けた動物を返さないでください。

9。3日目でDCVSを評価するために、デジタルサブトラクション血管造影をフォロー

1. 前述したように、ステップ1.1〜3.6を実行してください。
2. ナトリウムthiopenthalの動脈内ボーラス注射（40 mgの/ kg）を（ペントタール、Ospedalia AG、Hünenberg、スイス）により動物を安楽死させる。例組織学およびimmunohistでochemistry必要とされる100センチのH ₂ Oの灌流圧でRTで心臓内灌流固定を行う

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結果

SAHのウサギ血液シャントモデルは、このレポートに記載されて負傷した後、早ければ24時間として、海馬（ 図2A、B）、基底皮質（ 図2A、B）及び脳血管系（ 図2C）でEBIを生成し、特性を示している血液分布（ 図^2D）8。また、モデルはSAH誘導後3日目（ 図^{3）10 日}にDCVS重度の度に中程度をトリガします?...

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ディスカッション

シャントモデルは、急性SAH ^3,8,10後にヒトにおいて観察されたものと同様の病理を生成する。それはEBIは、悪化させるの維持、さらにはDCVS ^12をトリガし、そのようなこのモデルはSAH後のEBIとDCVS相互作用を含む初期および後期DCVSフェーズ、の両方を調査するのに役立つ可能性があることが示唆されている。具体的には、DSA ^13、コンピュータ断層撮影血管造影^14、

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Operation microscope	Zeiss, Jena, Germany		Zeiss, OPMI-MD surgical microscope
Surgical equipment	B. Braun, Germany		Forceps medical no. 5; vessel scissors 8 cm; microclip 4 mm
Respirator	Hugo Sachs
Hair clipper	3M Surgical Clipper		Starter Kit 9667A
Body warm plate	FHC
Blood gas analyzer	Radiometer, Copenhagen, Denmark	ABL 725
Cardiac monitoring	Camino Multi-Parameter Monitor, Integra, Plainsboro, NJ, US	AP-05
Software analysis	BIOPAC Systems, Inc., Goleta, CA, USA		Biopac MP100 and acqKnowledge software,version 3.8.1
Software analysis	ImagePro Discovery, MediaCybernetics, Silver Spring, MD, USA		Image-Pro Plus version
Angiography apparatus	DFP 2000 A-Toshiba	MIIXR0001EAA
ICP monitor	Camino Laboratories, San Diego, CA, USA		ICP monitor, Model 110-4B
Blood flow monitor	Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK		CAL KIT microsphere solution
Laser-Doppler flowmetry fine needle probes	Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK		MNP110XP, 0.48 mm diameter
Pressure tube	B. Braun, Germay		PE 1.0 mm × 2.0 mm
Anesthesia monitor	GE Medical Systems, Switzerland		Datex S5 Monitor
Material
20 G vascular catheter	Smiths Medical		Jelco i.v. catheter, REF 4057
5.5 F three-lumen central venous catheter	Connectors, Tagelswangen, Switzerland		Silicone catheter STH-C040
22 G x 40 mm needle	Emergo Group Inc., Netherlands
High-speed microdrill	Stryker, Solothurn, Switzerland	5400-15
Bone wax	Ethicon, Johnson & Johnson,NJ, USA	ETHW31G
Bipolar forceps	Aesculap, Inc., PA, US	US349SP
Ketamin			Any generic product
Xylazine			Any generic product
Buprenorphine			Any generic product
Fentanyl			Any generic product
Transdermal fentanyl matrix patches			Any generic product
Lidocaine 1%			Any generic product
4% papaverin HCl			Any generic product
Neomycin sulfate	Research Organics Inc., OH, USA		Any generic product
Povidone-iodine			Any generic product
0.9% sodium chloride			Any generic product
Iopamidol	Abott Laboratories, IL, USA		Any generic product
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP824G
5-0 non absorbable suture	Ethicon Inc., USA	8618G
4-0 polyfilament sutures	Ethicon Inc., USA	VCP284G