Il Coniglio Blood-shunt modello per lo studio di acuta e sequele tardive di emorragia subaracnoidea: Aspetti tecnici

Riepilogo

The experimental intracranial pressure-controlled blood shunt subarachnoid hemorrhage (SAH) model in the rabbit combines the standard procedures — subclavian artery cannulation and transcutaneous cisterna magna puncture, which enables close mimicking of human pathophysiological conditions after SAH. We present step-by-step instructions and discuss key surgical points for successful experimental SAH creation.

Abstract

Lesione cerebrale precoce e ritardata vasospasmo cerebrale entrambi contribuiscono a risultati sfavorevoli dopo emorragia subaracnoidea (SAH). Modelli animali riproducibili e controllabili che simulano entrambe le condizioni sono al momento raro. Pertanto, sono necessari nuovi modelli, al fine di mimare condizioni fisiopatologiche umani derivanti da SAH.

Questo rapporto descrive le sfumature tecniche di un sangue-shunt modello SAH coniglio che consente il controllo della pressione intracerebrale (ICP). Un shunt extracorporea è posto tra il sistema arterioso e lo spazio subaracnoideo, che consente esaminatore indipendente SAH in un cranio chiuso. Step-by-step istruzioni procedurali e le attrezzature necessarie sono descritte, così come considerazioni tecniche per produrre il modello con mortalità minima e morbilità. Dettagli importanti necessarie per la riuscita creazione chirurgica di questo modello SAH coniglio robusto, semplice e coerente ICP-controllato sono descritti.

Introduzione

Emorragia subaracnoidea aneurismatica (SAH) è uno dei più in pericolo di vita condizioni neuropatologici, spesso portando a danni neurologici permanenti o la morte ^1. Precedenti ricerche si è concentrata sul vasospasmo cerebrale ritardata (DCVS) come l'eziologia primaria di deficit neurologici associati con SAH ^2. Tuttavia, generalmente i poveri risultati clinici di pazienti affetti da emorragia subaracnoidea dopo il trattamento del vasospasmo ha portato ad un ampliamento del centro di ricerca per includere gli effetti della lesione cerebrale precoce (EBI) dopo SAH ^3. Maggiore comprensione del significato di entrambi EBI e DCVS nel contribuire a poveri risultati clinici dopo SAH è essenziale per lo sviluppo di più efficaci strategie terapeutiche.

Fino ad oggi, singola e doppia iniezione di sangue autologo nella cisterna magna è stato il metodo standard per l'induzione SAH per lo studio di DCVS ^2-6. Anche se comunemente usato in studi precedenti,questo modello molto probabilmente non riprodurre le modifiche principali neuropatologici associati SAH indotto EBI ^7. Al contrario, la perforazione endovascolare è noto per produrre gravi alterazioni fisiopatologiche acute che in parte imitano i sintomi di EBI ^7.

La relazione descrive un modello di coniglio romanzo SAH progettato per consentire indagine sia EBI e DCVS, consentendo caratterizzazione più accurata della patologia SAH indotta _^8-10. Con la tecnica descritta, modello standard cisterna magna è adattato collegando il sistema arterioso dell'arteria succlavia e la cisterna magna tramite uno shunt extracorporea. Il flusso di sangue è quindi legata alla fisiologia del coniglio e guidato dalla differenza di pressione tra il sangue arterioso e la pressione intracranica. L'emorragia si arresta quando la pressione intracerebrale (ICP) è uguale pressione diastolica e il sangue nel sistema shunt coagula. Utilizzando l'host & #8217; s fisiologia riduce SAH induzione esaminatore-dipendenti, portando ad un modello più coerente di SAH che produce in modo affidabile sia EBI e DCVS fenotipi ^3,8-10.

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Protocollo

Tre mesi di età femminile conigli New Zealand che pesano 2,5-3,5 kg sono stati utilizzati per questa procedura. Lo studio è stato eseguito in conformità con il National Institutes of linee guida sanitarie per la cura e l'uso di animali da esperimento e con l'approvazione del Comitato del Cantone di Berna, Svizzera (approvazione N ° 105/13) Animal Care. Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite in condizioni sterili presso l'Istituto Sperimentale Chirurgica del Dipartimento di Ricerca Clinica presso l'Università di Berna Hospital di Berna, in Svizzera. Un anestesista veterinario monitorato gli animali durante l'intervento chirurgico e durante il recupero.

1 Preparazione degli animali, posizionamento e succlavia Cannulazione

1. Indurre anestesia generale nel coniglio con iniezione intramuscolare di ketamina (30 mg / kg; Ketalar, 50 mg / ml) e xilazina (6 mg / kg; Xylapan 20 mg / ml) e la profondità di controllo dell'anestesia controllando la risposta del coniglio nocivi stimoione (ad esempio, un pizzico tep). Vedere 1.7 in caso di risposta positiva.
2. Abbassare le palpebre inferiori di entrambi gli occhi e applicare una piccola quantità di pomata per le palpebre per prevenire la secchezza e l'ulteriore irritazione.
3. Cateterizzarla la vena orecchio laterale con un Gbutterfly venflon 20 (20 G catetere vascolare), fissare con nastro adesivo, e connettersi a un sacchetto di gravità contenente 0,9% di cloruro di sodio (500 ml / 24 hr) e ketamina (40 mg / kg / ora) / xilazina (4 mg / kg / ora) per endovenosa continua (iv) l'anestesia. Somministrare analgesici supplementari ogni 15 min iv (Fentanyl, 1 mcg / kg). Nota: Evitare anestetici volatili del gas, che è associato con una diminuzione CPP, aumentando CBF, e la diminuzione del tasso metabolico cerebrale di ossigeno ¹¹ anestetici endovenosi offrono più caratteristiche ideali per Neuroanestesia preservando CBF e vasocostrizione cerebrale, ^12, che è di importanza superiore quando si studia cerebrale. vasospasmo. Inoltre, anche se la mortalità è aumentata in SPONTaneously respirazione animali, essa può meglio imitare la situazione umana di SAH acuta.
4. Fornire ossigeno (1 - 2 L / min) tramite una maschera respiratoria che permette di anidride carbonica di fine espirazione _(EtCO2) monitoraggio.
5. Installare un elettrocardiogramma a 3 canali (ECG) .Montare tre elettrodi sottocutanei in una disposizione triangolare sul lato ventrale del coniglio; in particolare, posizionare un elettrodo sulla regione mediotoracico destra (con distanza dal campo sterile rasata per l'arteria succlavia incannulamento) e due elettrodi nel basso addome distribuiti su entrambi gli arti.
6. Monitorare la profondità dell'anestesia ogni 15 minuti durante l'intervento seguendo frequenza respiratoria, frequenza cardiaca (HR) controllato dal segnale ECG, e la reazione alla stimolazione nociva.
7. In caso di risposta positiva alla stimolazione nocicettiva (pizzico tep), adeguare la profondità dell'anestesia da ketamina bolo (6 mg / kg) e xilazina ev in bolo (0,05 mg / kg) ev e / o un bolo analgesia supplementare con Fentanyl (1 mcg / kg) iv
8. Fissare il coniglio in posizione supina su una piastra riscaldante corpo, inclinando la testa di 20 ° verso il basso e ruotando leggermente controlateralmente al lato su cui sarà esposta l'arteria succlavia.
9. applicare unguento occhio e preparare l'area per un intervento chirurgico con la rasatura dei capelli sopra il muscolo pettorale destro intorno al terzo medio della clavicola, e sopra il cranio frontal-, parietal- e occipitale, il collo, e sul diritto arteria femorale comune.
10. Disinfettare la pelle per 3 minuti con un ampio spettro di antisettico, ad es., Povidone-iodio.
11. Coprire il coniglio con teli sterili. Eseguire tutte le altre procedure in condizioni sterili e spesso applicano il 4% papaverina HCl e soluzione antibiotica (neomicina solfato 5 mg / ml) per via topica per prevenire il vasospasmo arterioso dalla manipolazione nave e infezioni locali.
12. Infiltrati il ​​muscolo pettorale con anestetici locali (lidocaina 1% massimo 6 mg / kg). Fare un incisione cutanea parasternale e preparare ilmuscolo pettorale. Utilizzando il microscopio, sezionare l'arteria succlavia e fissare con una prossimale e distale legature (4-0 suture polifilamento) intorno l'estremità esposta. Mantenere una legatura vicino al controllo prossimale in posizione per fissare il catetere e legare il vaso distale.
13. Eseguire un arteriotomia nella parete dell'arteria succlavia incidendo la arteria con un microscissor curvo e cannulate succlavia retrograda con un piccolo intravasale rubinetto a 3 vie. Fissare il catetere doppio nodo legatura verso la legatura distale al fine di impedire la torsione arteriosa o piegatura della parte prossimale dell'arteria e di evitare la fuoriuscita slittamento o massiccio.

2. Pressione del sangue e monitoraggio arterioso Sangue Gas

1. Collegare il 3-way rubinetto di arresto per i) la cannula intravasale di gas del sangue arterioso (ABG) analisi, pH, _{PaCO2, PaO2,} il bicarbonato, l'eccesso di base, e SO _2, ii) il sangue arterioso invasivapressione dispositivo di misurazione, e iii) il dispositivo shunt.
2. Raccogliere campioni di sangue per lo stato ABG _(PaCO2, PAO ₂₎ e monitorare costantemente parametri standard cardiovascolari e respiratorie (pressione sanguigna, HR, ECG, frequenza respiratoria e di fine espirazione di CO ₂₎ e di trasferimento dei dati tramite l'interfaccia di uscita analogica ad un analogico- convertitore digitale / registratore di dati e memorizzare.
   NOTA: Le pressioni saranno azzerati a livello del cuore prima e dopo ogni sessione, e la calibrazione pressione analogico / digitale-convertitore e sistema di registrazione dei dati sarà fatto una volta prima che la serie si avvia.

3 Baseline Digital sottrazione angiografia

1. Inserire un dispositivo di dimensionamento esterno (piccola sfera) su entrambi gli angoli mandibolari per calibrare l'angiografia.
   NOTA: Questo permette di confronto esatto delle misurazioni post-hoc di basale e follow-up diametro del vaso.
2. Eseguire la sottrazione angiografia digitale (DSA) da retrograda intra-abolo rterial di non ionico Iopamidolo (0,6 ml / kg, 5 ml / sec per 2 sec) attraverso l'arteria cannulata e lavare immediatamente la cannula dopo l'iniezione del bolo di soluzione fisiologica per evitare occlusione di quest'ultimo.
3. Ottenere immagini (7 immagini a 14 sec) del sistema vertebrobasilare utilizzando una rapida registrazione angiografia sequenziale in posizione obliqua 5 ° sinistro anteriore.
4. Infiltrati l'area intorno alla destra arteria femorale comune con anestetici locali (lidocaina 1%, massimo 6 mg / kg). Fai una piccola incisione cutanea inguinale. Utilizzando il microscopio per la visualizzazione, sezionare l'arteria femorale comune e fissare con una prossimale e distale legature (4-0 suture polifilamento) intorno l'estremità esposta.
5. Dopo arteriotomia, incannulare l'arteria femorale con una guaina 5-F. Lavare l'attacco laterale della guaina con soluzione fisiologica.
6. Avanzare un catetere 5-F nell'arteria brachiocefalica attraverso la guaina sotto fluoroscopia. Creare una mappa stradale, poi avanzare un filo guida di the sistema vertebro-basilare. Iniettare un bolo di non ionico Iopamidolo (0,6 ml / kg, 5 ml / sec a 2 sec) per DSA come descritto al punto 3.2.

4. rotazione alla posizione prona

1. Dopo basale DSA, riposizionare il coniglio da posizione supina a quella prona. Fare attenzione a non manipolare o spostare la posizione dei cateteri intra-arteriose.
2. Posizionare la testa in un testa-porta ad un angolo di 30 °, orientato a testa in giù.

5. Cisterna Magna Puncture

1. Disinfettare la pelle sopra la testa e il collo con Povidone-iodio 3 volte per 1 minuto ciascuna, e coprire l'area chirurgica con teli sterili.
2. Inserire un 22 G x 40 mm pediatrica ago accesso spinale transcutanea nella cisterna magna, senza alcuna incisione cutanea preventiva o spostamento muscolare.
3. Verificare che l'animale è completamente anestetizzato garantendo una mancanza di risposta toe-pinch prima di far scorrere l'ago verso il basso lungo la osseo protuberanza occipitale esternafinché non viene rilevato un gap; non spingere ulteriormente l'ago.
4. Verificare il corretto posizionamento dell'ago osservando sgocciolatura spontanea del liquido cerebrospinale con la testa di coniglio inclinato verso il basso con un angolo di 20 ° per pochi minuti.

6 Installazione di pressione intracranica e cerebrale monitoraggio del flusso sanguigno

1. Dopo la pelle linea mediana e galea incisione, inserire un piccolo divaricatore chirurgico.
2. Fai tre turno osteotomie (2 mm di diametro) con un microdrill ad alta velocità nella parte frontale del cranio secondo i punti di riferimento cranio esterne (Figura 1) ^9, vale a dire, il bulbo olfattivo e frontale bilaterale per il posizionamento di un dispositivo neuromonitoring se necessario. Usare un righello scala millimetrata per determinare le coordinate di bava posizionamento del foro come segue: pressione intracranica (ICP) di monitoraggio in linea midpupillary, 1-2 mm dalla linea sagittale mediano; intraparenchimali sonde laser-Dopplerquattro a cinque mm anteriormente e lateralmente al bregma (Figura 1).
3. Visualizza la dura madre, ed eseguire l'emostasi meticolosa: usare la cera ossea per l'emostasi ossea in virtù della sua azione tamponamento ed eseguire l'emostasi locale utilizzando la coagulazione bipolare della dura.
4. Posizionare il intraparenchimale pressione intracranica (ICP) tip monitor nel bulbo olfattivo di destra ad una profondità di 2 mm e quindi calibrare.
5. Bel posto sonde ad ago i due laser-Doppler flussimetria con un sistema di bloccaggio esterno e inserirli nei fori corrispondenti bave sia gli emisferi destro e sinistro frontali laterali al sistema ventricolare, cioè, sulla linea mediana per evitare interferenze con il liquido cerebrospinale. Posizionare una sonda ad ago a una profondità di 2,5 mm.
6. Dopo il posizionamento delle sonde neuromonitoring, sigillare tutti i fori bave con uno spesso tappo di cera ossea al fine di mantenere il cranio tenuta di fluido.
7. Misurare i parametri di base della pressione arteriosa media (MAP), ICP e il flusso ematico cerebrale (CBF) utilizzando un monitor multiparametrico e tessuti laser-Doppler Monitor perfusione sanguigna a quattro canali.

7 Shunt induzione

1. Collegare l'ago di accesso vertebrale nella cisterna magna per l'arteria succlavia in precedenza cateterismo attraverso tubi monitoraggio della pressione sanguigna-riempita. Utilizzare il rubinetto a 3 vie per la misurazione della pressione arteriosa e come porta di prelievo di sangue.
   NOTA: La gravità di SAH dipende dalla quantità di sangue, e può essere approssimativamente stimato l'ampiezza di coaguli subaracnoidea al momento del raccolto cervello ^5,11.
2. Monitorare costantemente MAP, HR, ECG, frequenza respiratoria e di fine espirazione di CO ₂ ad una frequenza di campionamento di 1 Hz da 6 min prima fino a almeno 20 min dopo SAH.
3. Verificare che l'animale è completamente anestetizzato garantendo una mancanza di risposta pizzico punta prima di aprire il collegamento shunt tra l'arteria succlavia e la cisterna magna per indurre SAH dal Tem pressionent.
   NOTA: Un SAH controllato può essere ottenuto chiudendo lo shunt in qualsiasi punto di tempo (ad esempio, ad un livello desiderato di ICP.).
4. Registrare i valori di stato stazionario per un periodo di tempo di circa 15 min.
5. Dopo ICP raggiunge il suo picco, tenere l'ago di accesso spinale in vigore fino ICP ritorna a uno stato stazionario vicino ai valori basali. Se l'altopiano ICP viene mantenuta per più di 10 secondi o se ICP diminuisce spontaneamente, chiudere lo shunt.
6. Rimuovere CBF sonde fine-ago e sonda ICP, tappare buchi bave con la cera ossea, rimuovere tutti i cateteri (compresi catetere succlavia, dal momento che la manipolazione del catetere con emorragia consecutiva è associata ad alta morbilità e mortalità, e aumenta il tasso di infezione), effettuare una rigorosa irrigazione ferita con solfato di neomicina e suturare la pelle.

8 Gestione postoperatoria

1. La procedura dura circa 2 ore. A causa delle emivite di ketamina e xilazina, il tempo di recupero di animal è abbastanza breve - circa 1 ora. Gli animali sono tenuti sotto una lampada riscaldante durante il recupero. Non sono forniti altri liquidi. Durante questa prima fase di recupero post-operatorio, si applicano buprenorfina 0,02 mg / kg sc ogni 8 ore per 24 ore.
2. Applicare le patch fentanil transdermico a matrice rilasciando 12,5 mcg / ora nella regione del collo rasato degli animali per l'analgesia efficace nei prossimi 72 hr.
3. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
4. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico in compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.

9 Follow-up digitale sottrazione angiografia per valutare DCVS al Day 3

1. Eseguire i passaggi 1,1-3,6 come descritto sopra.
2. Euthanize gli animali per iniezione intra-arteriosa bolo di thiopenthal sodio (40 mg / kg) (Pentothal, Ospedalia AG, Hünenberg, Svizzera). Nei casi in cui istologia e immunohistochemistry è necessario, effettuare una perfusione-fissazione intracardiaco a temperatura ambiente ad una pressione di perfusione 100 cm H ₂ O.

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Risultati

Il modello di shunt sangue di coniglio di SAH descritto in questo rapporto produce EBI nell'ippocampo (Figura 2A, B), la corteccia basale (Figura 2A, B), e la vascolarizzazione cerebrale (Figura 2C) già a partire 24 ore dopo l'infortunio e mostra una caratteristica distribuzione del sangue (Figura 2D) ^8. Inoltre, il modello attiva da moderata a grave gradi di DCVS in tre giorni dopo SAH induzione (Figura 3)

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Discussione

Il modello di shunt produce patologia simile a quello osservato negli esseri umani dopo SAH acuta ^3,8,10. E 'stato suggerito che EBI può esacerbare, mantenere e persino scatenare DCVS ^12, e come tale questo modello può essere di aiuto nelle indagini sia nella fase DCVS precoce e tardiva, tra cui EBI e DCVS interazioni seguenti SAH. In particolare, ripetibile in vivo DCVS tecniche di monitoraggio, compresi i DSA ^13, tomografia computerizzata angiografia ^14, e Dop...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Operation microscope	Zeiss, Jena, Germany		Zeiss, OPMI-MD surgical microscope
Surgical equipment	B. Braun, Germany		Forceps medical no. 5; vessel scissors 8 cm; microclip 4 mm
Respirator	Hugo Sachs
Hair clipper	3M Surgical Clipper		Starter Kit 9667A
Body warm plate	FHC
Blood gas analyzer	Radiometer, Copenhagen, Denmark	ABL 725
Cardiac monitoring	Camino Multi-Parameter Monitor, Integra, Plainsboro, NJ, US	AP-05
Software analysis	BIOPAC Systems, Inc., Goleta, CA, USA		Biopac MP100 and acqKnowledge software,version 3.8.1
Software analysis	ImagePro Discovery, MediaCybernetics, Silver Spring, MD, USA		Image-Pro Plus version
Angiography apparatus	DFP 2000 A-Toshiba	MIIXR0001EAA
ICP monitor	Camino Laboratories, San Diego, CA, USA		ICP monitor, Model 110-4B
Blood flow monitor	Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK		CAL KIT microsphere solution
Laser-Doppler flowmetry fine needle probes	Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK		MNP110XP, 0.48 mm diameter
Pressure tube	B. Braun, Germay		PE 1.0 mm × 2.0 mm
Anesthesia monitor	GE Medical Systems, Switzerland		Datex S5 Monitor
Material
20 G vascular catheter	Smiths Medical		Jelco i.v. catheter, REF 4057
5.5 F three-lumen central venous catheter	Connectors, Tagelswangen, Switzerland		Silicone catheter STH-C040
22 G x 40 mm needle	Emergo Group Inc., Netherlands
High-speed microdrill	Stryker, Solothurn, Switzerland	5400-15
Bone wax	Ethicon, Johnson & Johnson,NJ, USA	ETHW31G
Bipolar forceps	Aesculap, Inc., PA, US	US349SP
Ketamin			Any generic product
Xylazine			Any generic product
Buprenorphine			Any generic product
Fentanyl			Any generic product
Transdermal fentanyl matrix patches			Any generic product
Lidocaine 1%			Any generic product
4% papaverin HCl			Any generic product
Neomycin sulfate	Research Organics Inc., OH, USA		Any generic product
Povidone-iodine			Any generic product
0.9% sodium chloride			Any generic product
Iopamidol	Abott Laboratories, IL, USA		Any generic product
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP824G
5-0 non absorbable suture	Ethicon Inc., USA	8618G
4-0 polyfilament sutures	Ethicon Inc., USA	VCP284G