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要約

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

要約

カルシニューリン阻害剤タクロリムスは、米国の固形臓器移植後の免疫抑制ほとんどの治療プロトコルの基礎となるものです。タクロリムスは、狭い治療指数薬であり、そのようなものとして、その全血トラフ濃度に基づく治療薬モニタリングおよび用量調節を必要とします。家庭治療薬と遵守の監視を容易にするために、乾燥した血液スポットのコレクションは魅力的な概念です。フィンガースティックの後、患者は自宅でろ紙上の血液滴を収集します。血液が乾燥した後、それは、タクロリムスは、単純な手動のタンパク質沈殿工程およびオンラインカラム抽出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析（HPLC-MS / MS）を用いて定量された分析研究室に郵送されます。

タクロリムスの分析のために、6 mmのディスクは、血液スポットの飽和中央から打ち抜かれます。血液スポットは、弾丸ブレンダーaを使用して均質化され、ND次いでタンパク質は、内部標準D 2、13 C-タクロリムスを含むメタノール/ 0.2 MのZnSO 4で沈殿させます。ボルテックス及び遠心分離後、上清100μlをオンライン抽出カラムに注入し、5 mlの0.1ギ酸/アセトニトリル/分（7：3、V：V）で洗浄し、1分間。以降、切替弁が活性化され、分析物は、分析カラム上にバックフラッシュ（0.1％ギ酸/アセトニトリル勾配を用いて分離されます）。タクロリムスは、タンデム質量分析計を用いて、正の反応マルチモード（MRM）で定量化されます。

アッセイは、1〜50 ng / mlでの直線です。アッセイ間の変動（3.6％-6.1％）と精度（91.7パーセント-101.6％）20日間にわたって評価として受け入れ基準を満たしています。平均抽出回収は95.5％です。キャリーオーバー、マトリックス干渉とマトリックス効果該当はありません。タクロリムスは、室温で1週間4℃で乾燥した血液スポット中で安定です。で抽出したサンプルオートサンプラーは、少なくとも72時間4℃で安定しています。

概要

タクロリムスは、マクロライド構造8（ 図1）を持つ強力なimmonosuppressant 1-7です。 653グラム/ L、エタノール： - シスのためにCN結合のトランス異性それを逆相高速液体クロマトグラフィーによって分離することができる液9中の2つの回転異性体を形成する（HPLC）は、タクロリムスは、アルコール（メタノール中の親油性と可溶性である355 G / L）、ハロゲン化炭化水素（クロロホルム：573グラム/ L）およびエーテル。 9分子は、任意の発色団を含んでいないし、その紫外線吸収極大が192 nmである0.0047グラム/ L）タクロリムスの行為カルシニューリンの阻害を介して：0.1グラム/ Lおよび水（pHは3：それは（ヘキサン脂肪族炭化水素に難溶性です。 。その作用機序は、参考文献10,11に概説されている。これは、現在、米国において12固形臓器移植患者の80％以上に使用されています。

タクロリムスの治療指数はconsidereですdは13狭くします。また、タクロリムスの投与量と血中濃度との相関が悪く、薬物動態変数14,15あります。移植患者におけるタクロリムスの投与をガイドするための治療薬モニタリングは、したがって、一般的な臨床実践16-20です。目標は、事前定義された治療範囲内タクロリムスの血中濃度を維持することです。治療の窓を超える濃度が過剰免疫抑制、癌や、腎毒性、神経毒性、高血圧、および糖尿病などの毒性のリスクを増加させながら、治療範囲以下のタクロリムスの血中濃度は、慢性または急性同種免疫反応の活性の増加をもたらす可能性があります。タクロリムスの高い薬物動態個体内変動は、移植臓器と患者の生存21,22の両方に有害である可能性があります。タクロリムスの薬物動態の個体間変動は、主にCYP3A5の遺伝子多型、個体内の理由によって引き起こされている間可変性は、薬物-薬物、疾患、薬物および食品薬物相互作用は、14,15、含まれるが、これらに限定されません。また、免疫抑制治療薬レジメンの遵守の欠如が要因と移植片喪失の23,24の主な理由です。

これらの考慮事項は、頻繁に家の治療薬やタクロリムス全血濃度の遵守の監視は、患者が常に所望の治療ウィンドウ内タクロリムスエクスポージャーを持っていることを確認することが有益であり得ることを示唆しています。しかし、それは現在の臨床実践15であるように、より頻繁な治療薬モニタリングの物流コストは法外です。理由の一つは、患者が瀉血専門医が描画に必要な静脈血のサンプルを持って見る必要があることです。乾燥血液スポットは最近、魅力的なコンセプト25-28として浮上しています。簡単な指の後、患者は特別なろ紙カードに血液滴を収集し、血液スポットの後にdを有するスティックリート、患者が現在服用してもよいことタクロリムス及び他の免疫抑制剤の分析のための中央検査室に郵送することができます。これは、そのような乾燥血液スポット（血液の一般的に20μl）を25,29-43のような非常に少量の血液量のタクロリムスおよび他の免疫抑制剤の定 ​​量化のための高感度かつ特異的LC-MS / MSアッセイの開発が可能となっています。別の利点は、乾燥血液スポットとして低侵襲性、低容量のサンプル収集戦略が大きく小さな子供28中の治療薬のモニタリングおよび薬物動態学的研究を促進することです。

タクロリムスは、通常、静脈のEDTA全血15で測定されます。理由は、タクロリムスは、広範囲の血液細胞に分配することと臨床研究は、臨床イベント15,18のプラズマに比べて血液中のタクロリムストラフ濃度との間のより良好な相関関係を報告しているということです。比較では、TAの分析乾燥血液スポットにおけるcrolimusを濾紙マトリックスと混合される毛細管血に基づいています。これは、タクロリムスおよびLC-MS / MS分析での潜在的な干渉の可溶化の点で課題を提示。ここでは、高流量のオンラインコラムサンプルクリーンアップの手順とLC-MS / MS分析と組み合わせて、箇条書きのブレンダーを用いて乾燥血液スポットの均質化に基づいて設立され、確認されたアッセイを提示します。今日のように、このアッセイは成功し、臨床試験における遵守を監視するための以上5000タクロリムス乾燥血液スポットサンプルの定量に使用されています。

プロトコル

健康な個体からの匿名化血液サンプルは、コロラド大学病院（オーロラ、コロラド州）からのものでした。検証研究のためだけでなく、キャリブレータおよび品質管理サンプルの調製のための非識別血液バンクサンプルの使用は、コロラド多施設内倫理委員会（COMIRB、オーロラ、コロラド州）によって「免除」と考えられました。

参照とソリューションの作製

  1. タクロリムスと内部標準のD 2を購入し、材料リストに記載されているベンダから13 C-タクロリムス。
    1. タクロリムス1 mg / mlの濃度とD 2のために10μg/ mlの、13 C-タクロリムスの濃度で純粋なメタノール中のストック溶液を準備します。三つの独立した重みに基づいて、標準物質のストック溶液を作ります。小分けストック溶液とストア-70℃以下です。
  2. タンパク質を沈殿させるために溶液を調製します（：、3 V：7 v）を、水にメタノール/ 0.2 MのZnSO 4を使用して、タクロリムスを抽出します。この溶液は、内部標準D 2、2.5 ngの/ mlの濃度の13 C-タクロリムスを含有し、ブランク試料の抽出を除くすべてのサンプル（1.3.3を参照）の抽出のために使用されます。
    1. 各抽出日に新鮮にこのタンパク質沈殿溶液を調製し、12時間で溶液の有効期限を設定します。
  3. 検量線および品質管理（QC）サンプルの作製
    1. 純メタノールを使用したスト​​ック溶液の適切な希釈を行うことにより、タクロリムスのス​​トック溶液を調製します。
    2. 、キャリブレータおよび品質管理サンプルの調製EDTA全血の中に適切に希釈されたストック溶液20μlをスパイクするために、20分およびアリコートのための細胞の血液成分へのタクロリムスの均一な分布を可能にするために、水浴中で穏やかに振盪下、37℃でインキュベート1.5ミリリットルポリープへ円錐形の底部を有するr​​opyleneチューブとスナップオンふた。有機溶剤の相対量が5％を超えないことを確認してください。
    3. スポットピペットを使用してフィルタカード上の各円の中央にスパイクの全血50μlの。
    4. 3時間室温でのフィルタカードの血液スポットを乾燥させます。
    5. 1、2.5、5、10、25、および50 ngの/ mlのタクロリムスの濃度で人間のEDTA全血中タクロリムス校正標準を準備します。内部標準D 2、13 C-タクロリムス（「ゼロサンプル」）を含むタンパク質沈殿溶液と較正基準のような抽出のためのブランク試料を準備します。
    6. 0、2、4、20、40 ngの/ mlの濃度のヒトEDTA全血にQCサンプルを準備します。ブランク試料を準備します。内部標準D 2を含む沈殿を用いて抽出されたQCサンプルとは対照的に、13 C-タクロリムス、ないタンパク質沈殿溶液とこのブランクサンプルを抽出します内部標準D 2、13 C-タクロリムス（「ブランク試料」）を含みません。
  4. 臨床サンプルの採取
    1. 43,44で説明したように乾燥した血液スポットを収集します。

2.タクロリムスの抽出乾燥血液スポットサンプル

  1. 視覚的に許容可能なサンプルの品質とボリューム45を確実にするために、乾燥血液スポットを検査します。
  2. 6 mmの穴パンチとフィルタカード上の血液スポットのパンチ中心。
    注：パンチの品質を秤量することによってモニターすることができます。パンチ飽和フィルターディスクは、0.09ミリグラム（：4.83- 5.14 mgであり、N = 12の範囲）±平均5.02ミリグラムで重量を量ります。
  3. 円錐形の底部及びスナップオン蓋付き1.5ミリリットルポリプロピレンチューブに置きディスク。
  4. 各チューブに20〜30箇条書きを追加します。
  5. 各チューブにタンパク質沈殿溶液（2.5 ngの/ mlの内部標準とV：0.2 MのZnSO 4、7：3、Vメタノール）の500μlのを追加します。 EXTRについてブランクサンプルの動作は、内部標準なしでタンパク質沈殿溶液を使用しています。
  6. （「10」を設定し、最高速度）1分間の弾丸ブレンダーでディスクを均質化します。
  7. 10分間（「10」を設定し、最高速度）マルチチューブボルテックスに室温でサンプルを振ります。
  8. 10分間16,000×gで4℃で遠心分離サンプル。
  9. 300μlのインサートを備えたガラス製HPLCバイアルに上清を移します。前スリットテフロンシールを使用してください。
    注：抽出したサンプルは、-20℃以下でLC-MS / MS分析まで保存することができます。

3. LC-MS / MS分析

  1. C8カートリッジ抽出カラム上に負荷抽出されたサンプルの上清100μlを、図7を用いて洗浄する：水中の0.1％ギ酸の比率3：1分間5 ml /分の流量でアセトニトリル。切替弁の接続は、 図2に示されており、勾配は、 表1の抽出ポンプによって実行されます栄。
  2. 以下、分析カラム上に、プレカラムからの検体のバックフラッシュの結果、切替弁を作動させます。
  3. 65°Cまでのカラムサーモスタットを設定します。
  4. 表1に示す流量と勾配を用いて分析カラムから分析物を溶出します。
  5. ターボエレクトロスプレーイオン化源を介してタンデム質量分析計に分析カラムを接続します。 表2に記載の質量分析装置の主要なパラメータを調整します。
  6. 複数の反応モード（MRM）中の正イオン（[M +のNa] +）を検出します 。定量化のために、次のイオンの移行を使用して：タ ​​クロリムス：m / z（質量/電荷）= 616.2→826.6とD 2、13 C-タクロリムスた：m / z = 829.6→619.2。
    注：総実行時間は4.6分です。

4.定量

  1. 各実験について、1.3.5で製造したキャリブレーターに基づいて検量線を作成し、各分析の実行に含めます。
    1. 質量分析計ソフトウェアを使用して、分析物（ピーク面積[検体] /ピーク面積[内部標準]）の応答係数対名目濃度をプロットすることにより検量線を作成します。
    2. 1 / Xの重み付けと組み合わせて二次フィットを用いてキャリブレータを取り付けます。
  2. 乾燥血液スポットにおける量タクロリムスタクロリムス抽出のMRMクロマトグラムにおける内部標準のピークを統合することができます。タクロリムスの応答係数（ピーク面積[検体] /ピーク面積[内部標準]）を計算し、質量分析ソフトウェアを使用して検量線と比較します。

5.検証手続

  1. 検出（LLOD）及び定量化（LLOQ）の下限値の下限。
    1. 検出（LLOD）の下限として1：4のピーク対雑音比で最低のタクロリムス濃度を考えてみましょう。定量化（LLOQ）の下限を定義します。等しいか、または名目濃度に等しいか、またはより良好な20％の精度（変動係数）から±20％の偏差よりも良好な精度で較正曲線の最低濃度です。
  2. 内および間日間の精度と精度。
    1. 2 ng / mlで（QC1）、4 ng / mlで（QC2）、20 ng / mlで（QC3）および40 ng / mlで（QC4）の4濃度レベルで正確さと精度をテストします。
    2. フィルタカード、エキスの乾燥、人間のEDTA全血に各バリデーション日にQCサンプルを用意し、上記のように分析します。
    3. QC濃度レベルごとに6つのサンプルでイントラデイの正確さと精度を決定します。
    4. 20日間の間日間の正確さと精度を評価します。 4サンプルを毎日各QCレベルを測定します。
    5. 毎日のQCサンプルと一緒に2つの較正曲線を分析します。
    6. 名目上の濃度の％（濃度レベルごとに6つのサンプルは、5.2.2を参照してください）​​などのイントラデイ精度を計算します。 Calcの分散係数（CV％）としてulate精度。
    7. それは名目濃度の115％に許容限界に85％を下回る場合には許容可能なイントラデイ精度を考えてみましょう。それは15％のCV（変動係数）と同等かそれ以上の場合、許容できるならばイントラデイの精度を考慮してください。
    8. 20検証日間にわたって分析各QC濃度レベルの平均としてインター日間の正確さと精度を計算します。
    9. それは名目濃度の115％に許容限界に85％低下した場合に許容できるインター日間の精度を意味することを検討してください。それは15％のCV（変動係数）と同等かそれ以上の場合、許容できる場合インター日間の精度を考慮してください。
  3. マトリックス干渉の排除。
    1. マトリクス信号によって引き起こされることがある干渉を排除するために、空白の乾燥血液スポット（8異なる個体、好ましくは4人の男性と4人の女性）を分析。
    2. 視覚イオンクロマトグラムを検査します。もし保持時間内にピークタクロリムスのウィンドウがLLOQでタクロリムスでスパイク統合し、ブランク試料におけるタクロリムスピークのものと曲線下その面積を比較し、検出されました。ブランク試料中のピークの面積は、LLOQでタクロリムスのものの15％を超えることが想定されていません。
  4. イオン抑制/イオン強化。
    1. 共溶出マトリクス成 ​​分によるイオン抑制/イオン強化の潜在的な干渉を評価するために45を説明するようにポストカラム注入プロトコルを使用してください。
    2. 10μL/分の速度でメタノール（30：70、v / v）のポストカラム：0.1％ギ酸に溶解した10μg/ mlの濃度のタクロリムスを注入。
      1. 分析カラムと質量分析計のエレクトロスプレー源との間にTピースを経由してシリンジポンプを接続します。
      2. タクロリムスのためのMRMトランジションのMS / MSシグナル強度を監視し、その内部標準（のm / z = 616.2とのm / z = 829.6→619.2→826.6）extracの注射後テッドのブランクサンプル（N =異なる個体から8サンプル）。
        注意：イオン抑制が信号とイオン増強ピークのディップが発生している間イオン抑制/イオン強化がない場合には検体の注入によって引き起こされる連続信号は、ブランクマトリックスの注入によって影響されるべきではありません。
  5. 持ち越す。
    1. 最高キャリブレーター後に抽出ブランク試料を分析することにより、潜在的なキャリーオーバーを評価する（50 ngの/ mlの、N = 6）。
    2. 視覚イオンクロマトグラムを検査します。タクロリムスの保持時間ウィンドウ内のピークが検出された場合、LLOQでタクロリムスをスパイクブランクサンプル中のタクロリムスのピークのものと曲線の下のそれらの領域を統合し、比較します。ブランク試料中のピークの面積は、LLOQでタクロリムスのものの15％を超えることが想定されていません。
  6. 抽出回収。
    1. QC SAMの抽出後の検体の信号を比較することにより、回収を決定しますブランクの乾燥血液スポットのものとすべての4つの濃度レベルでples（N =濃度につき6）は、抽出後のタクロリムスの対応する量でスパイク。
    2. 4のQCのセット（：2、4、20、40 ngの/ mlの濃度レベル）を準備します。
    3. ろ紙のカードに空白のEDTA全血50μlのをスポッティングし、2時間乾燥させることにより、「回復試験サンプル」に対応する他の4セットを準備します。
    4. 以下、QCとブランク」回収試験サンプル」の両方のために、はさみでフィルタカードの全体の血液スポットを切り出し、円錐状の底部とのスナップ式の蓋付きポリプロピレンチューブに生じたディスクを配置します。
    5. すべてのサンプルを抽出します。
    6. ガラスHPLCバイアルに上清（400μl）を転送します。
    7. 2、4、20、および40 ng / mlで（200、400、2000、4000 ngの/ mlのタクロリムスストックゾルの4μLの濃度に到達するまでの空白」が抽出回収試験サンプル」にタクロリムス原液を追加上清400μlにutions）。
    8. LC-MS / MS分析の後、QC試料及び対応する濃度の「回収試験試料」の両方の信号を比較する（抽出/信号サンプルを抽出X 100の後にスパイクする前に、回復％=信号サンプルをスパイク）。
  7. 希釈の整合性。
    1. サンプルを使用して希釈の整合性を確立ng / mlで500、250および100での検体でスパイク。
    2. 抽出後、タンパク質沈殿溶液を用いて、サンプル希釈（1:10、n = 3の濃度レベルにつき）。
    3. 名目濃度からの偏差を計算します。 85％の範囲内の公称許容できるの-115％減の結果を考慮してください。
  8. 安定性。
    1. すべての4つの濃度レベルでQCサンプルを使用して安定性を調査した（n =濃度あたり4）異なる時点で、異なる貯蔵条件下で分析しました。
    2. 公称値で保存した後の結果を比較してください。 Rを考えてみましょう85％の範囲内の公称許容できるの-115％減esults。
    3. 4℃、-20℃で1ヶ月間、-80℃で1ヶ月に1週間、室温で1週間のサンプルの安定性を確立します。
    4. 3サイクルにわたってテスト凍結融解安定性（-20℃）。試験は、4℃に調節サーモスタットオートサンプラーにサンプルを配置することによって、サンプル及びオートサンプラー安定性を抽出しました。 72時間後にサンプルを注入します。

結果

サンプルは定量下限と患者試料にスパイクブランク試料の代表的なイオンクロマトグラムは、 図3に示されています。

検量線

検出の下限値は、0.5 mlのNG /であり、定量化の下限はng / mlで1.0でした。より高い濃度は、通常の状況下では、診療所に到達されそうにないとして50ngの/ mlの最高キャリブレーターとして選ばれました。

ディスカッション

上述のように、乾燥血液スポットに基づいて、タクロリムスの治療薬及び遵守監視の概念は魅力的であるが、一般的に静脈EDTA全血サンプル中のタクロリムスのLC-MS / MS分析に関連するものを超えた分析課題があります。これらには、マトリックスは、ここで使用されるフ​​ィルタカード材料と低血液量（20μL）のコットンリンターの材料に浸漬毛細血管全血であるという事実が、これらに限...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
TacrolimusU.S. Pharmacopeial Convention1642802
D2,13C-TacrolimusToronto Research Chemicals Inc.F370002
Red blood cellsUniversity of Colorado HospitalW20091305500 V
PlasmaUniversity of Colorado HospitalW2017130556300Q
Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9%Sigma-Aldrich439126-4 L
Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificA955-4
Isopropanol 99.9%, HPLCFisher ScientificBP2632-4
Methanol Optima LC/MSThermo Fisher ScientificA452-4
Water Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificW6-4
Formic acidThermo Fisher ScientificA118P-500
Phosphate-buffered saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Zinc sulfateThermo Fisher ScientificZ68-500
0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008649
1.5 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-682-550
10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008651
10 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 10XLS3
100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008653
100 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 100
1,000 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2940
2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008650
2 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-681-258
20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008652
20 μl pipet tips with filter, sterileGeneMateP-1237-20
200 μl pipet tips with filterMultimax2938T
200 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2936J
50 ml Falcon tubeBD Falcon352070
300 μl inserts for HPLC vialsPhenomenexARO-9973-13
Balance PR2002Mettler Toledo1117050723
Balances AX205 Delta RangeMettler Toledo1119343379
Bullet Blender HomogenizerNext AdvanceBBX24
Centrifuge Biofuge FrescoHeraeus290395
Disposable WipesPDIQ55172
Glass v ials, 4 mlThermo Fisher Scientific14-955-334
Glass vials, 20 mlThermo Fisher ScientificB7800-20
Gloves, nitrileTitan Brand Gloves44-100S
HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clearPhenomenexARO- 9921-13
Lids for HPLC vialsPhenomenexARO- 8952-13-B
Needle, 18 G 1.5Precision Glide305196
Rack for Eppendorf tubesThermo Fisher Scientific03-448-11
Rack for HPLC VialsThermo Fisher Scientific05-541-29
Steel beads 0.9 – 2 mmNext AdvanceSSB14B
Storage boxes for freezers / refrigeratorsThermo Fisher Scientific03-395-464
Standard multi-tube vortexerVWR Scientific Products658816-115
Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PKGE Whatman 2016-05
AutosamplerCTC PAL PAL.HTCABIx1
Binary pump, Agilent 1260 InfinityAgilent Technologies1260 G1312B
Binary pump, Agilent 1290 InfinityAgilent Technologies1290 G4220A
Micro vacuum degasser, Agilent 1260Agilent Technologies1260 G13798
Column oven,  Agilent 1290 with 2 position Agilent Technologies1290 G1216C
Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valveAgilent Technologies1290 G1316C
HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mmPhenomenex820950-926
HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mmPhenomenex993967-906
Tandem Mass Spectrometer
API5000 MS/MS with TurboIonspray sourceAB Sciex4364257
Mass spectrometry softwareAB SciexAnalyst 1.5.1

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