髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

要約

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

要約

イントラ胸腺T細胞の発達は、様々な間質細胞、 すなわち、非T細胞から構成される複雑な三次元網目構造を必要とします。胸腺細胞は、末梢に先立ってエクスポートに、順次義務のチェックポイントを通過しながら、高度に調整された時間的、空間的順序でT細胞受容体レパートリーの生成と選択に続いて、すなわち、T細胞系列のコミットメントを、この足場を横断します。この足場を形成する2つの主要な居住細胞型（cTECs）皮質及び髄質胸腺上皮細胞（mTECs）です。 mTECsの重要な特徴は、多数の組織限定抗原のいわゆる無差別式です。これらの組織制限抗原は、それぞれ、自己寛容を生じ、mTECsまたは胸腺樹状細胞によって直接的または間接的に胸腺細胞の未成熟するために提示されます。

cTECsとmTECsの発生経路と機能をエミュレートし、in vitroでの適切なモデルは、現在、LACですキング。適切な実験モデルの欠如は、例えば、まだ不十分な細胞および分子レベルで理解されて無差別遺伝子発現の分析を妨げました。我々は、単離されたmTECs ex vivoで培養するために3Dの器官共培養モデルを適応しました。このモデルは、もともとインビトロでの皮膚同等物を生成するような方法で、ケラチノサイトを培養するために考案されました。 、CD80 ^{こんにちは} 、アイレ陽性mTECs、RANKLへの（ii）の反応性、およびFoxN1の（iii）の持続的な式に（I）の増殖およびCD80 ^LO、アイレ陰性の分化：3DモデルはMTEC生物学の重要な機能的特徴を保存しますアイレとCD80 ^{こんにちは} mTECsで組織限定遺伝子。

概要

残りの2％を一括胸腺間質（ すなわち、上皮細胞、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、線維芽細胞、内皮細胞）を構成する種々の細胞で構成されていながら、開発胸腺細胞は、胸腺の約98％を占めています。外側皮質上皮細胞（cTECs）は、骨髄、多能プレT細胞におけるT細胞系譜の誘導と自己MHCのポジティブ選択からプロT細胞の移民を調達未熟胸腺細胞を制限しました。内側の髄質胸腺上皮細胞（mTECs）はいずれかの誘導陰性選択またはT調節細胞系譜へのそれらの偏差による自己ペプチド/ MHC複合体のための高親和性TCRを有するもの胸腺細胞の寛容の誘導に関与しています。中央寛容誘導のコンテキストでは、mTECsは、彼らがこのように周辺自己ミラーリング組織限定自己抗原（TRAS）の広いスペクトルを表現するという点でユニークです。この現象は、無差別遺伝子発現（PGE）と呼ばれています^1,2。

様々な短期の2D培養システムは、必ず最初の2日^3-6内PGEおよびMHCクラスII、FoxN1とアイレのような重要な調節分子の喪失をもたらしたように、この魅力的な細胞型の最新の研究は、ex vivoで単離された細胞に依存しています。これは、特定の成分および胸腺の無傷の3次元網目構造の特徴は、2次元モデルで欠落した、しかし不明でした。再凝集胸腺器官培養（RTOC）は無傷の胸腺の微小環境⁷に、他方では、これまでのところ唯一の3D一方で、T細胞の発達の研究を可能にするシステム、および間質細胞生物学でした。しかし、RTOCsは一定の制限がある、 すなわち、それらは既に、細胞の複合混合物を含む、胎児間質細胞の入力を必要とし、5〜10日の最大の培養期間に耐えます。

体外培養系における還元主義の欠如は、の研究を妨げていますT細胞の発達と胸腺器官形成のいくつかの側面はなく、少なくとも分子PGEの調節およびmTECsの発生生物学との関係。

皮膚および胸腺の上皮細胞の構造化された組織の近接関連性のために、我々は、in vitroでケラチノサイトの分化をエミュレートするため、真皮等価物を作成するために独自に開発された3D器官培養（OTC）のシステムを選択しました。 OTCシステムは、ケラチノサイトが^8,9を播種し、その上にフィブリンゲル中に閉じ込められている真皮線維芽細胞を重層不活性足場マトリックスで構成されています。ここでは、精製されたmTECsでケラチノサイトを置き換えます。このモデルの基本的な機能を維持しながら、私たちは、特定のパラメータを最適化します。

採用店頭モデルmTECsでは、増殖分化を受け、MTECのアイデンティティとPGEを維持し、このように密接にインビボ mTECs開発の模倣 ^{10。このテクニカルノートでは、胸腺OTCsの段階的なセットアップを可能にする詳細なプロトコルを提供します。}

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プロトコル

本研究では、Regierungspräsidiumカールスルーエの倫理委員会によって承認されています。すべての動物は、ドイツ癌研究センター（DKFZ）で特定の病原体を含まない条件下で飼育しました。生後1~7日に至るまで、すべての培養実験の仔マウスのために使用しました。

胸腺からmTECsの1の単離

注：以前に¹滅菌条件下で説明したように、次のように次の消化工程はいくつかの変更を加えて実施しました。

1. 仔マウスを刎ねると胸腺を削除します。 RPMI（5％FCSを含む）1640培地を含むペトリプレートに氷上で胸腺を置きます。
2. 〜5〜30ミリリットルRPMI培地で丸底チューブに細かい、小さな作品や場所に胸腺をカットし、穏やかに室温で10分間、磁石を用いて撹拌します。
3. その後、主に胸腺細胞を含む上清をデカントし、collagenaの1ラウンドで残りの組織を順次ダイジェスト37℃で25分ごとに、コラゲナーゼ/ディスパーゼ（0.2 mg / mlの1.2 U / mlの最終濃度）、続いて37℃でそれぞれ（0.2 mg / mlとし、最終concentartion 57 U / ml）で15分間SEタイプIV、胸腺まで磁気撹拌しながら水浴中でCは完全に消化されます。三つの胸腺への2つあたり1ミリリットルの酵素を使用してください。
4. パスツールピペットで一度、7-10分の組織を攪拌します。コラゲナーゼ/ディスパーゼの画分をプールし、70ミクロンガーゼでろ過します。
5. 磁気細胞ソーティング（MACS）によりmTECsを豊か。以前¹¹に記載され、 図1に示すように、磁気セルソーティングによってmTECsの精製を行います。
   注：（1で使用し、G8.8：100希釈）および抗EpCAMバイオ：抗CD80-PE（100希釈16-10A1、1で使用します）mTECsの磁気選別のために、我々は、以下の抗体を使用した^12。 MACSを使用して未成熟および成熟mTECsは次のように定義された： ^-のEpCAM ⁺ CD80 ^-及びCD45 ^- CD45 CD80 ⁺ respectivはエリー。
6. 以下に説明するようにMACS精製後（未熟mTECsの純度= 83.1±6.3％と成熟mTECs = 79.23±3.42パーセント）は、（2.3節）器官培養物にmTECsをシード。
7. 以下の抗体を用いて、CD45 MACS枯渇後（100ミクロンノズルを使用して）FACSによるあるいは、ソートmTECs：抗CD45-PerCPを（30-F11、1で使用：100希釈）、抗Ly51-FITC（6C3、1で使用：100希釈）、抗EpCAM-Alexa647（G8.8、1で使用：500希釈）および抗CD80-PE（16-10A1、1で使用：100希釈）。 （4日目）：ヨウ化プロピジウム（5,000 1）を使用して、死細胞を除外します。それぞれのEpCAM ⁺ CD80 ^{+ -} CD45 ^{- -} Ly51 ^-のEpCAM ⁺ CD80 ^-およびPI ^- CD45 ^- Ly51 PI：FACSを使用して、未成熟および成熟mTECsは、次のように定義されました。

2. 3D器官共培養（OTCs）

注：keratinocytの器官培養のための3D-真皮構築物先に説明したように^9,13 ESを調製しました。すべてのステップで、細胞を37℃、5％CO ₂でインキュベートしました。次のようにmTECsを使用してOTCsはわずかな変更を加えて調製しました。

1. ヒト線維芽細胞の調製
   注：以前に⁹説明したように、ヒト皮膚線維芽細胞は、脱epidermised真皮の外植片培養物から得られました。
   1. 簡潔には、ヒトの皮膚（〜5cmの長さ）のストリップを切断し、サーモリシン、4℃でO / N（10mMのヘペス（pH7.4）で生理食塩水中の0.5mg / ml）で処理します。
   2. その後、ピンセットを用いて真皮から表皮を分離します。
   3. 細かく10センチメートルペトリ皿に小片、所定の位置に真皮をカットし、無菌気流下で1〜2時間乾燥させます。 DMEM、20％FBSを含むと定期的に外植片を補います。
   4. 外に成長している線維芽細胞を分割すると、コンフルエント植片は、さらに詐欺のためにプレートに付着し続けることを確認して、0.1％トリプシンを使用して（通常は約3週間）伸長のsecutiveラウンド。
   5. ¹⁴それらを、10％FBSを含むDMEMで最大3回、同じ外植片からの線維芽細胞を展開し、クライオ保ちます。各実験シリーズの線維芽細胞の同じバッチを使用してください。
      注：線維芽細胞は、真皮同等物のセットアップのために照射されませんでした。
2. 足場の調製
   1. 正確に12ウェルフィルターインサートに適合するように鋭利な11ミリメートルの直径の金属パンチャーを使用して、よく画定円に0.4〜0.6ミリメートルの厚さのビスコース、不織繊維材料（Excelシートを支える製品の詳細を）カット。その後、足場として、12ウェルフィルターインサート（ポリエステル毛管細孔膜、3μmの孔サイズ）に配置します。滅菌12ウェルプレートに、完全なフィルタ設定を置きます。
   2. フィブリノーゲンおよびトロンビ​​ンの組み合わせからなる手術のためにフィブリン糊キットを使用してフィブリンゲルを準備します。フィブリノーゲンならびに8 mg / mlで、10のキットのトロンビン成分を事前に希釈それぞれ単位/ ml、。以下のように12ウェルプレートの1ウェル進行。
      1. Ca ^₂₊およびMg _2+、pH7.0のせずに、100μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて100μlのフィブリノーゲン（8ミリグラム/ ml）を希釈します。 27万線維芽細胞を含む100μlのFCSで100μlのトロンビン（10単位/ ml）を希釈します。
      2. を2mg / mlのフィブリノーゲンおよび2.5単位/ mlのトロンビンの最終濃度で、その結果、（1混合物1）200μlのフィブリノゲンを追加している、足場上に細胞ミックス線維芽細胞を含むトロンビンの200μLを分注します。よく混ぜ、穏やかにピペッティング（1日目）によって足場の全域に​​わたって均等に分配します。
         注：37℃で30分後、線維芽細胞を囲む血餅が完全に足場の内部空間を充填し、滑らかな上面を形成し、形成されているであろう。
3. mTECsとの共培養
   1. 前培養のために、器官培養を沈めますメディアの変化と、10％FBS、50μg/ mlのL-アスコルビン酸および1 ngの/ mlのTGF-β1を含むDMEM 4-5日間一日おきに。
   2. MTEC播種の日に、RFAD媒体によってメディアを交換します（1：1 DMEM + DMEM / F12）を、10％FBSを、10 ^-10 M、コレラ毒素、0.4 mg / mlのヒドロコルチゾン、50μg/ mlのL-アスコルビン酸、したがって、線維芽細胞によって分泌されるセリンプロテアーゼによって早熟線維素溶解を防止するRANKリガンド（を0.1μg/ ml）および500単位/ mlのアプロチニン、。
   3. 7-8時間後、セットアップ共培養を、線維芽細胞の足場の上にウェル当たり100μlの容量で25万mTECs（完全mTECs、またはCD80 ^LOおよびCD80 ^{こんにちは}サブセットのいずれか）を播種することにより。ノイバウアー室（4日目）を用いて細胞数を計測します。
      注：胸腺3D器官培養物を空気持ち上げられる皮膚OTCsとは異なり、メディア内に浸漬されているすべての回で。
   4. 24時間のインキュベーションの後、今containi（ステップ2.3.2）上記のような培地で培養（総培地交換）を供給アプロチニン、250単位/ ml（5日目）の減少量をngの。
   5. mTECsの増殖活性を評価するために、培養の終了前4時間OTCsにEDU（6.7μM/ mlの、 すなわち、10μM/ウェル）を追加します。各培養標本のか流れによって2つのセクションでいずれかのカウントK14 ⁺ EDU ⁺細胞による、mTECsの増殖指数を決定ケラチン14の共染色と組み合わせたエドゥイメージングキットに記載されているように店頭凍結切片の染色を行いますフローサイトメトリー（EDU 1.7節ではなくのLy51-FITCが1でCDR1-PB ^15を使用し、フローサイトメトリー：100希釈し、2.3.6.4）。
   6. 共培養の4-7日後、RNA分離、凍結切片またはFACS分析（日8-11）のためOTCs、処理を終了します。
      1. ウェルインサートのフィルターから足場/真皮同等物を分離し、ピンセットを用いて培養を終了します。
      2. クライオセクショニングについては、OCT化合物で全体OTCを埋め込むとLiで凍結クライオセクショニング前に頭の良い窒素蒸気。使用するまで-20℃でクライオスタットとストアを使用して、5-7ミクロンの厚さのOTCのセクションを準備します。凍結切片OTCsの免疫組織化学（AF64 1で使用：1,000希釈）抗ケラチン14を使用してください：抗体、および抗ビメンチン（100希釈GP53、1で使用します）。それぞれの二次抗体を用いた間接免疫組織化学染色を行います。
      3. RNA単離のために、溶液2 mlのRNaseフリーのチューブのスクリューキャップで（フェノール及びチオシアン酸グアニジンを含む）を変性1ミリリットルを追加します。メスで小片に全体OTCをカットし、変性溶液を含むチューブに追加します。機械的には、（サンプルは、この時点の後に-80℃で保存することができる）2分間氷上の間に配置し、6.0の速度で30秒間回FASTPREP器具でOTCsを細断処理しました。 -80℃で凍結した場合は、氷上で解凍。 4℃で10分間、11,500-13,000 rpmでチューブを遠心。 RTおよびFで5分間インキュベートし、新しいチューブに上清を移し製造業者によって記載されるように酸性チオシアン酸グアニジニウム - フェノール - クロロホルム抽出を用いollow RNA単離プロトコール。
      4. FACS分析のために、足場を取り外し、フィブリン/線維芽細胞/ MTECゲルから膜を分離します。メスで細かく切断し、ゲルを〜20分間、または完全に磁気撹拌しながら水浴中で37℃にてコラゲナーゼ/ディスパーゼ2mlで消化されるまで、FACSチューブにそれを消化します。一度5分パスツールピペットを有する酵素液を攪拌します。完全消化した後、70μmのフィルターを通して細胞懸濁液をフィルタリングします。 1.7に記載のように抗体を用いて、単一細胞懸濁液を染色し、フローサイトメトリーによって分析します。

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結果

私たちは、もともとケラチノサイト⁹ のインビトロ長期培養のために開発された3D器官の共培養モデル（3D OTC）を採用しました。 MACS富化mTECsは（MACS濃縮スキーム図1参照）フィブリンゲルおよび封入された線維芽細胞からなる足場に播種しました。線維芽細胞は、 インビトロで mTECsをサポートする必須の細胞外マトリックス（ECM）を提供します。 MTECsは（OTC?...

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ディスカッション

RTOCsと並んで、3D OTCsはTEC分化およびPGEのメンテナンス/誘導他（I）と比較した（ 表1）「単純化された3Dの文化」を使用しての面ではるかに優れていたことで-線維芽細胞を、単独で足場なし。二次元システムを用いて-のTEC ¹⁰と線維芽細胞/フィーダー細胞を共培養し、TECのクローンの開発が、PGEが失われた式（III）3T3-J2細胞、（IV）マトリゲルまたは（V）ECM成分（未発表?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 mice	Charles River WIGA
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
CD45 Microbeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301
Anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)	Ref. 12
CD80-PE antibody	BD Pharmingen	553769
CD45-PerCP antibody	BD Pharmingen	557235
Ly51-FITC antibody	BD Pharmingen	553160
CDR1-Pacific Blue	Ref. 15
Keratin 14 antibody	Covance	PRB-155P
Vimentin antibody	Progen	GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Molecular Probes (Invitrogen GmbH)	A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Invitrogen	C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10425
12-well filter inserts (thincerts)	Greiner bio-one	657631
12-well plate	Greiner	665180-01
Jettex 2005/45	ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
PBS	Serva	47302.03
DMEM	Lonza	BE12-604F
DMEM/F12	Lonza	BE12-719F
HEPES	Gibco	15630-049
FBS Gold	GE Healthcare	A11-151
Aprotinin (Trasylol)	Bayer	4032037
Cholera toxin	Biomol	G117
Hydrocortisone	Seromed (Biochrom)	K3520
L-ascorbic acid	Sigma	A4034
TGF-ß1	Invitrogen	PHG9214
RANKL	R&D systems	462-TR-010
Thermolysin	Sigma Aldrich	T-7902
OCT Compound	TissueTek	4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)	Invitrogen	10296028
FastPrep FP120	Thermo Scientific
Collagenase Type IV	CellSystems	LS004189	0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase)	CellSystems	LS002104	0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I	Roche	11 284 932 001	25 µg/ml final conc.