赤血球凝集の動的な調査のための制御されたマイクロ流体環境

要約

プロトコルは、画像処理技術に基づいて、詳細に制御され、一定の剪断速度の下で赤血球（RBC）の凝集体を定量化するための実験手順を記載しています。このプロトコルの目的は、制御されたマイクロ流体環境で対応するせん断速度に赤血球凝集体のサイズを関連付けることです。

要約

血液は、非ニュートン生体液として、血液レオロジーの分野における多くの研究の焦点を表します。血液成分は、血漿中に懸濁された赤血球、白血球及び血小板を含みます。によるRBCの存在量（血液量の40％〜45％）に、彼らの行動は、特に微小循環の血液のレオロジー挙動を決定します。非常に低いせん断速度で、RBCが組み立てに見られている、フォームの実体は、血液の非ニュートン挙動を引き起こす、凝集体と呼ばれます。これは、微小循環における血液レオロジーを把握するために、凝集体形成の条件を理解することが重要です。ここで説明するプロトコルは、画像処理に基づいて、一定のせん断速度下で定量的に微小循環におけるRBC凝集体を決定するための実験手順について詳しく説明します。この目的のために、RBC-懸濁液は120×60μmのポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロチャネル中で試験され、分析されます。 RBC-懸濁液は、耳鼻咽喉科であります血液層内の線速度プロファイルを得るので、一定の剪断速度の広い範囲を達成するために、第2の流体を使用して雨が降りました。 RBC凝集は、高速カメラを用いて可視化しながら剪断速度は、マイクロ粒子画像流速（μPIV）システムを使用して決定されます。 RBC凝集体の捕捉されたビデオは、画像強度に基づいて、集合のサイズを決定するために画像処理技術を用いて分析されます。

概要

赤血球（RBC）は、血液のレオロジー挙動を決定する上で重要な役割を果たしています。彼らは、ほぼ単独でin vitroおよびin vivoでの血液の特定の性質を担当しています。生理的条件下では、赤血球は、血液量の40％〜45％を占めます。微小循環において、赤血球は、より小さな血管径とプラズマスキミング効果¹の血液量の20％までを占めます。微小循環における血漿低減のこの現象は、フォーレウス効果として知られています。低剪断速度では、赤血球は、したがって、血液の非ニュートン挙動に寄与し、一緒にブリッジと「連銭」または凝集体と呼ばれる一次元又は三次元構造を形成することができます。しかし、RBC凝集のメカニズムは完全に理解されていません。二つの理論は、RBCの凝集をモデル化するために存在する：細胞理論の橋渡しを起因高分子²の架橋及び力attracへ浸透勾配³に起因する分子の枯渇によって引き起こさ化理論。

典型的には、ヒトの血液のために、凝集体は、1〜10秒^-1までの範囲の非常に低いせん断速度⁴で形成されます。この範囲を超えると、RBCが脱凝集し、血管内に別々に流れる傾向にあります。

凝集体形成の条件を理解することは、血液のレオロジー挙動を定義するという点で血液レオロジーの分野に非常に重要です。これらの凝集体は、多くの場合、macrocirculationレベル（> 300μmの直径^）5で見られています。このスケールでは、血液は、ニュートン流体と均一な混合物と見なされます。しかし、これらの凝集体はほとんど毛細管レベル（直径4-10μm）の中に見られないと、通常、糖尿病⁶や肥満などの病的状態の指標です。 RBC凝集を変えることができる他の病的状態は、炎症性または感染状態を含み、高血圧やアテローム性動脈硬化症、遺伝性疾患および慢性疾患⁷などの心血管疾患。したがって、赤血球凝集メカニズムを理解し、（これらの凝集体の大きさや流れの状態との間の関係を定義することによって）、これらのエンティティを分析して、血液のmicrorheological行動の理解につながるので、臨床応用にそれを関連付けることができます。

RBC凝集物は、ヘマトクリット値（血液中の赤血球の体積）、剪断速度、血管径、RBC膜の剛性および懸濁培地組成^8-10のようないくつかの要因によって変更することができます。したがって、制御された条件は、効果的にRBC凝集体を分析するために必要とされます。いくつかの方法は、血液の動作に関連する情報を提供しています静的アグリゲーション測定（集計インデックス）を提供することにより、凝集体形成を解析することができます。これらの方法は、とりわけ、赤血球沈降速度を含みます方法^11、光透過法^12、光反射法¹³と低剪断粘度法^14。

いくつかの研究は、RBC凝集を研究し、制御された流れ条件^15-17における凝集の程度を決定することを試みました。しかし、これらの研究は、間接的に凝集の程度についての情報だけでなく、地元の粘度を提供する顕微鏡血液画像に基づいて測定された剪断システム内の占有スペースの比率を決定することにより、赤血球凝集体の大きさを調べます。

そこで、直接制御し、一定のせん断速度下で、動的に、RBCは、微小循環に集約定量化するための新しい手順を提示します。 RBC懸濁物は、したがって、血液層にせん断流を作り出すリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を、（ 図1に示されるように）二重Y字型マイクロチャネルに、同伴されます。この血液層定数シア以内R率を得ることができます。 RBC懸濁物は、異なるヘマトクリット値（H）レベル（5％、10％及び15％）で異なる剪断速度（2-11秒^-1）下で試験されます。血流速度および剪断速度は、フローは、高速カメラを用いて可視化されている間、マイクロ粒子画像流速（μPIV）システムを使用して決定されます。得られた結果は、赤血球を検出し、凝集体のサイズを決定するために、画像強度に基づいて、MATLABコードで処理されます。

プロトコル

血液は、オタワ大学（H11-13-06）の倫理委員会の承認を得て、健康な個体から収集されます。

1.マイクロチャネルの作製

マイクロチャネルは、標準的なフォトリソグラフィ法¹⁸に基づいて製造されています。

1. コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して、マイクロチャネルの幾何学的形状を設計し、透明性のフォトマスクの設定を印刷します。これらは、製造工程中に光路を決定するので、これらのマスクは重要です。この場合には、マイクロチャネルの寸法は、厚さ120ミクロン、深さ60ミクロン、長さ7ミリメートルです。
2. クリーンルームでは、スピンコートは、エポキシ系負所望のマイクロチャネルの深さ（60μm）を得るために30秒間2000rpmでシリコンウェハ上にフォトレジスト。
3. 70秒間ウェハ650ミリジュール/ cm ²でUVランプの下でフォトマスクを公開します。唯一の透明な領域を露出させることを確認しUV光へのフォトマスク。透明領域の曝露は、フォトレジストの硬化をもたらす鎖の重合を可能にします。 - フォトレジストの過剰を削除する開発者に、シリコン片を浸し。
4. ポリジメチルシロキサン（PDMS）の溶液を作成するために1：金型が製造されると、10の比率で、シリコン系エラストマーと硬化剤を混合します。脱気真空チャンバ内にPDMS溶液を入れてください。金型にそれを注ぎ、マイクロチャネルを作成するために90分間60℃に加熱します。その後90秒間酸素プラズマボンディングを用いてガラススライドに個々のチャネルを結合。
   NOTE：PDMSの脱ガス処理は、混合プロセスによって生じる気泡を除去するために行われます。
5. マイクロチャネルの寸法が成功テストのために許可されていることを確認。このプロトコルでは、マイクロチャネルは、120×60μmの長方形の断面を有します。対照的に、平均RBCは8μmで2ミクロンの厚さの直径を有します。ザreforeは、マイクロチャネルの幅は、適切な凝集を観察し、正確な速度プロファイルを決定するのに十分です。

2.血液の準備

1. 倫理委員会の承認を得た後、健康なボランティアドナーから血液を採取します。採血管に存在するエチレンジアミン四酢酸（EDTA）と血（血液4ml中7.2ミリグラムのEDTA）を扱います。
   注：EDTAは、血液凝固を回避するために使用されます。
2. 血液成分を分離するために、1400×gで（3,000 rpm）で血液サンプルを10分間3回遠心。遠心分離の結果、三つの異なる層を観察します。
   注：3層（管の底にある）RBC層、バフィーコート（RBC層の上に位置白血球及び血小板からなる）と、（他のすべての上に位置するプラズマ層であります成分）。
   1. 最初の遠心分離後、血液ピペットを用いて血漿を収集します。任意のCを回避バフィーコートでontact。
   2. 収集し、10％に希釈した漂白剤で容器内にバフィーコートを処分。
   3. 残りのRBC層と管のそれぞれにpH7.4のPBSの3ミリリットルを追加し、遠心分離機の適切なバランスを確保します。ゆっくり10分間1400×gで（3,000 rpm）で再びチューブと遠心分離機を混ぜます。
      注：これらは細胞接着を変更する可能性があるのでPBS溶液は、任意のマグネシウムやカルシウムが含まれていないことを確認してください。
   4. 2回目の遠心分離後にチューブにPBSを処分し、存在する場合、残りのバフィーコートを除去します。繰り返して、きれいな赤血球を生成する第三の遠心分離のために2.2.3と2.2.4を繰り返します。
3. 対応する（5％、10％及び15％のRBC懸濁物を得るために1 mlチューブにプラズマできれいな赤血球（0.95 0.9 0.85 ml）を必要量（0.05 0.1 0.15 ml）を混合します）ヘマトクリット。微量でヘマトクリットを確認してください。

3.流体の準備

二重Y-マイクロチャンネル内の2つの流体を導入します。

1. 蛍光トレーサー粒子溶液を60μl添加し（1％固体、D _粒子 = 0。86ミクロンは、λは= 542 nmの_腹筋 1ミリリットルRBC-サスペンションチューブへ= 612 nmおよびλ _放射 ）。
   注：蛍光トレーサー粒子（内部染めポリスチレン粒子）は、マイクロチャネル内の流れの速度を測定するために使用されます。レーザー光（λ= 542 nm）での対応する波長に曝露されたときにこれらの粒子は、蛍光を発します。
2. pH7.4のPBS溶液を調製し、PBS溶液1mlで同じ蛍光トレーサー粒子溶液60μlを添加します。

4.集約サイズ測定

1. マイクロチャネル内の流体（RBC-懸濁液とPBS）を挿入するには、25μlの100μlに二枚のガラスの注射器を使用しています。この意志システムのコンプライアンスを減少させるのに役立ちます。エントリー穴をフィッティングチューブとコネクタを介して注射器にマイクロチャネルを接続します。流体容器と注射器との間に存在する圧力差を用いて、ガラスシリンジを埋めます。気泡がシステムに存在しないことを確認してください。別の方法としては、マイクロチャンネル内で両方の流体を駆動するために、圧力制御システムを使用しています。
2. ハイスピー​​ドカメラとμPIVシステムに接続された倒立顕微鏡のステージ上にマイクロ流路を配置します。プログラム所望の流量（PBSのためのQ = 8μL/時の流量をengendering血液ため例えば、Q = 2μL/時）のシリンジポンプ。
   注：唯一のシリンジポンプが使用されています。二つの異なる内径を有する、二つの異なるガラスシリンジを使用して、Y-マイクロチャネルの各ブランチに入る流量を変化させることが可能です。
3. に示すように、異なるエントリ·ブランチから、異なる流量でそれぞれ二重Y-マイクロチャンネル内で両方の流体を挿入図1。異なるせん断速度をテストするために、ポンプの流量を変更します。これは、2つの分岐^19（ 図2、図3）との間で同じ適切な比率（この場合は4）を維持します。流れは測定値を取得する前に定常状態に到達するのを待つ：視覚的に円滑な流れのための高速カメラの画像を検査します。
   注：血液比は、層内の線形速度プロファイルを得るために重要です。
4. ハイスピー​​ドカメラを使用して、赤血球を可視化します。流体の流れの画像を制御し、記録し、保存するために、カメラをコンピュータに接続します。二つの流体の流れが定常状態に到達すると、録音を開始します。
   1. より良い処理結果を得るために複数の画像を取得します。凝集体の鮮明な画像に最適なカメラの露光時間を決定します。
      注：この場合のカメラの露光時間は0.5ミリ秒でした。各フレーム間の時間間隔の選択は、カメラのフレームレート及びtでの流量に基づいています彼は、マイクロチャネル。この手順で処理された各フレーム間の時間は60ミリ秒でした。したがって、秒当たり18フレームを記録することが可能なカメラで十分です。
      注：誤った測定結果につながる可能性がある、チューブ、シリンジに血液沈降を避けてください。
5. 次のように画質を改善する画像処理技術（ここではMATLABプログラム）を用いて、（ 図4に示す）が画素強度に基づいて、各画像に凝集体を検出します。
   1. 画像は、フレーム毎に良好な画像品質を得るために、ヒストグラム等化法を用いてコントラスト向上。
   2. グレースケール画像は、二値画像に変換します。この目的のために、各ピクセルの変換を指示すること、0〜1の範囲の閾値を設定します。閾値よりも大きい値を持つ画素が白画素として検出され、一方、閾値以下の画像の任意の画素は、黒画素として検出されます。
   3. 塗りつぶしより良い結果を得るために1つの集約内のギャップに対応する孔（存在し、必要に応じて）。
   4. 隣接するセルが凝集体として関連しているように、二値画像における隣接白画素を決定することによって細胞を検出します。
   5. 検出された別の集合体にラベルを付け、より良い視覚化のために、赤、緑、青（RGB）画像に二値画像に変換します。画像処理技術の有効性を確認し、 図5に示すように、すべてのセルは、考慮されることを確実にするために対応する処理画像のそれぞれにオリジナルフレームを組み合わせる。実行手順4.5.1、4.5.2、4.5.3キャプチャされたすべてのフレームのために、4.5.4および4.5.5。
   6. 検出された画素の数に基づいて、フレーム内で検出された各集合体の面積を計算します。使用するレンズの倍率に基づいて、較正レチクルを使用して、変換係数を計算し、ミクロン²に結果を変換します。それぞれで検出された集合体サイズを平均化フレーム、その後はRBC-懸濁液の各記録の平均凝集体サイズを得るために、すべてのフレームの結果を平均します。
   7. 各検出された集合体の中にRBCの代表推定数を決定するために1つのRBCの面積を計算します。 図6に示すように、これらの結果を用いて、（各集計内のセルの推定数によって表される）集計のサイズの関数として各集計内のRBCの割合の分布を計算します。
      NOTE：RBC凝集体を測定するために、ImageJソフトウェアは、各フレームに同じタスクを実行する（代わりにMATLABの）使用することができます。

5.流体の速度とせん断速度測定

流体の速度、ひいてはμPIVシステムを使用して、せん断速度を決定します。

1. データは、高速カメラを用いて取得された後、μPIVシステムに使用される二重パルスカメラに切り替えます。画像の交流のためのイメージングソフトウェアを使用して速度場の決意のフローと画像処理のquisition。
2. レーザーをオンにする前に、レーザーのクラスに応じて、必要なすべての予防措置をとります。その後、システムは、カメラとレーザーの電源をオンにします。
3. 使用するレンズの倍率に基づいてカメラのキャリブレーション。この目的のために、顕微鏡下で10ミクロン精度のマイクロスケールを使用して、画像内の1画素のサイズを設定します。
4. レーザーを起動して、両方の流体中の粒子を可視化します。流れの中で最速の粒子に着目して、マイクロチャネルの中央面を見つける（ すなわち、最も速い粒子は明るいはずです）。
5. 粒子の適切な移動を確実にするために、DT（2つの連続するフレーム間の時間間隔）を設定します。最速の粒子は、両画像間の約5〜10ピクセルを移動する必要があります。
6. フローの記録を開始します。 5ミリ秒間隔で、画像の100ペアを取得するためのソフトウェアを設定します。すべてのDIFのために、手順5.4、5.5および5.6を実行しますferent RBC-懸濁液と異なる剪断速度のために。
   注：方法論の詳細はピッツとフェネシュ²⁰の研究で示されています。
7. イメージングソフトウェアとの相互相関法を使用して取得された録音を処理します。
   注：これは、（流体の流れと、ユーザが選択した時間間隔に基づいて）所定の大きさの小さなウィンドウに一対の画像を離散化で構成されて呼ばれる相関ウィンドウと各ウィンドウ内の粒子の変位を以下に示します。
   1. 取得された画像は、優れたデータ処理のために（バックグラウンド減算、「ベースクリッピング^」21または^22,23の重複画像を含む）の前処理を必要とする場合、最初に決定します。
   2. そして、相関窓の大きさや形状、ならびにの重複画像の割合を選択します。詳細な研究は、血液のための最適なパラメータと画像前処理技術を決定するために、ピッツら ²⁴によって実行されました異なるチャネル構成に流れます。 100画像のペアと速度の二乗平均平方根（RMS）誤差から算出した平均速度場として結果を表現します。
8. 図7に示すように処理されたデータから、チャネル出口での速度プロファイルを抽出し、より良いプロファイルは、空間内の速度場を平均化します。
   注：速度プロファイルを構成するバーは、チャネルの幅を基準に選択された相関ウィンドウサイズに対応しています。速度のRMS誤差はまた、実験的な速度推定の誤差を示す、 図7に示されています。
9. すべての測定および処理が実行された後、レーザーをオフにし、。ソフトウェア、カメラ、ステージを移動し、コンピュータやレーザー：システムのすべてのコンポーネントをシャットダウンします。
10. 剪断速度を計算するには、最初に検出し、高速カメラの記録に基づいて、マイクロ流路内の血液の厚さを推定します。この目的のために、すべての平均特定の記録のフレームは、ビデオの背景画像を取得します。 （5％、10％、15％ヘマトクリットで懸濁とき10μL/ hrで流れるRBC懸濁物については、図8に示すように）血液層を区切り。対応する血液層の厚さのために速度値を取得し、血液層の厚さによって、速度値を除算することにより、剪断速度を計算します。

結果

ヒトの赤血球が5％、10％、15％ヘマトクリットで懸濁し、10μL/ hrで流れるために二重Y-マイクロチャネル内の2つの流体の流れの例を図2に示されている。 図3は、時集合サイズの差を示していますチャネル内の流れは、10％のヘマトクリット5μL/時間に10μL/時から減少されます。ヘマトクリットおよびせん断速度を変化させたときに凝集体の大きさの定性的な概念を与え...

ディスカッション

本発明の方法論を使用して、異なる流れ条件及びヘマトクリット下定性的および定量RBC凝集体を分析することが可能です。成功したテストと集計検出のためには、マイクロチャネルの入口に二つの流体の間の適切な速度比を決定するために重要です。この比は、速度プロファイル¹⁹準線形である最適な血液層の厚さを得ることは非常に重要です。

成功したテスト?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist	MicroChem Corp.
SU8-50 developer	MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
PE-50 series Plasma system	Plasma Etch	PE-50 series
Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	FisherSci	B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F
Poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 ml)	FisherSci	R800
Aggregometer	RheoMeditech	Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µl)	Hamilton	80965
Tubing (Tygon)	FisherSci	AAA00001
High speed camera (Basler)	Graftek Imaging Inc.	basler acA2000-340km	A camera capable of recording 18 frames per second could be used.
Double pulsed camera	LaVision	Imager Intense
Microscope MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)	Chemyx Inc. and Harvard Apparatus	Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software	LaVision	Davis