生体内および生体外では腹膜脂肪にミルキースポット構造の卵巣がん転移性コロニー形成を研究するためのアプローチで

要約

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

要約

ハイグレード漿液性卵巣癌（HGSC）、広範な腹膜転移の原因は、非常に予後不良を持ち続けています。女性の30％未満では診断後5年生存しています。大網はHGSCの転移形成の好ましい部位です。この微小環境の臨床的重要性にもかかわらず、卵巣癌の進行への大網脂肪組織の寄与はunderstudiedまま。それは血管系の高密度の巣の周囲の乳白色B、TおよびNK細胞で構成されているスポット、マクロファージ、および前駆細胞として知られている構造が含まれているという点で、大網脂肪は珍しいです。ミルキースポットが腹膜ホメオスタシスのために必要とされる大網の生理学的機能に重要な役割を果たしています。私たちは、乳白色のスポットはまた腹膜脂肪の卵巣癌転移植民地化、腹膜転移の発生における重要なステップを促進することが示されています。ここでは、我々が当たりで乳白色スポットを評価し、定量化するために開発されたアプローチを説明itoneal脂肪およびin vivoおよびex vivoの両方大網組織の卵巣癌細胞の転移性のコロニー形成への機能的貢献を研究しています。これらのアプローチは、このように広範な腹膜転移の開発に乳白色のスポット構造への細胞の初期の局在から卵巣癌の転移形成の研究を可能にする、追加のマウスモデルおよび細胞株に一般化しています。

概要

ほとんどの固形腫瘍とは異なり、高品位漿液性卵巣癌（HGSC）からの転移は、腹膜腔¹に制限されています。このように、効果的な腹膜療法は、潜在的に制御またはHGSCを根絶可能性があります。現在、標準的な治療アプローチは、化学療法^1-3と組み合わせる外科的細胞減少です。残念ながら、患者の大多数は経験し、疾患再発の合併症に屈します。これらの憂鬱な統計は、転移性コロニー形成の改善された理解の必要性を示し、プロセスは、それによって癌細胞を利用する、および転移^{2を形成するために、}宿主組織内で増殖する局在化。

大網はHGSC転移^4-7の好ましい初期のサイトです。他の腹膜脂肪とは異なり、大網脂肪組織は、腹膜homeosにおいて重要な役割を果たしB、TおよびNK細胞およびマクロファージを含む乳白色のスポットとして知られる異常な免疫構造を含みますtasis ^8,9。その生理学的機能に加えて、我々は、乳白色スポットが卵巣がん、転移性植民⁴において積極的な役割を果たしていることがわかりました。実験的転移アッセイにおいて、SKOV3ip.1、CaOV3、及びHeyA8（ヒト）およびID8（マウス、C57BL / 6）迅速にホーム乳白色スポットへ卵巣癌細胞、細胞が分泌走化性因子に向かって移動していることを示唆しています。興味深いことに、癌細胞は乳白色スポット（ すなわち、生殖腺および子宮脂肪^{）4を欠く}腹膜脂肪を植民地化しません。

乳白色スポットコロニー形成を調節する機構を同定するために、我々は、転移性コロニー形成の⁴時間にわたって細胞および分子事象の尋問を可能にする異種移植片モデルを最適化しました。本明細書中に記載の方法の具体的な利点は、完全に生体内で統合されており、M の ex vivoモデルで、ユーザーが仮説をテストすることができ、組織構造と機能を重視、ですetastatic植民地化^4,10。乳白色スポットを含むか、または欠けているいずれかの腹膜脂肪デポで癌細胞の局在化と成長を比較することにより、研究者は、宿泊施設と、生理学的に関連する組織における卵巣癌細胞の進行性の成長に乳白色の斑内の脂肪細胞と細胞の相対的な寄与（複数可）をテストすることができます。

プロトコル

全てのマウスは、制度動物実験委員会（IACUC）のガイドラインに、シカゴ動物資源センターの大学の監督の下で応じて、収容され維持し、安楽死させました。

実験的研究のための準備1.動物

1. 動物が輸送及び取扱いの潜在的な生理学的影響から回復するために、新しい住宅や環境に順応できるようにします。
   注意：以下のような手法は、マウスのすべての市販の株にも適用可能です。実験に使用する動物の数は、試験デザインに依存しており、統計学者からの相談に行ってください。

2.同定および腹膜脂肪デポの単離。

1. 死を確認するために、CO ₂過剰摂取と二物理的方法を介して、動物を安楽死させます。
2. 収穫腹膜脂肪デポとして内部臓器摘出（二法）、MAを構成しますKE内臓（ 図1A）を露出するために腹膜壁を通して鼠径乳頭に近い正中切開。
3. 大網脂肪（OM）は、鉗子（ 図1C）で腹腔から脾臓を拡張することで、大網/膵臓複合体を公開します。密接にすべての組織の接続をトリミングすることによって膵臓と脾臓から大網を解除してください。残りの膵臓組織は^、4を切除していることを確認します。
4. 生殖腺脂肪（GF）の場合は、組織の接続（ 図1Aの上部RIGHトン^）4を切断することにより、卵巣と消費税を取り巻く生殖腺脂肪を持ち上げるために鉗子を使用しています。
5. 子宮脂肪（UF）は、組織の接続を切断することによって子宮角と消費税を取り巻く子宮脂肪持ち上げるために鉗子を使用します（ 図1Aを右下^）4。
6. 腸間膜脂肪（MF）は、小腸と幽門との間の接合部をカット。の自由端をしっかりとグリップに鉗子を使用してください小腸、およびそれ離れ腸間膜脂肪からゆっくりと「皮」。 （ 左下図1A）解剖ハサミを使用して、腸間膜根から腸間膜脂肪をリリース^4。
7. Splenoportalファット（SF）は、膵臓に脾臓の門を接続する組織の薄い脂肪バンドを公開するために鉗子を使用して、脾臓の遠位端を持ち上げます。最初の膵臓からそれを解放した後、慎重に脾臓（ 図^1B）4からそれを解剖することによって消費税splenoportal脂肪を。

ギムザ染色を使用3.ミルキースポットの同定

1. 消費税​​のomentumの複数形は、C57BL / 6マウスから16時間（O / N）のために4℃で5％中性緩衝ホルマリンで固定し（2.3ステップを参照してください）​​。
2. 固定組織をパラフィン包埋のために、組織の大きさに適した金型を選択します。金型を埋めるためにパラフィン容器から溶融パラフィンを注ぎます。カセットを開き、温かい使用してCEPS、金型内に組織を移します。
   1. 慎重縦断面を生成するためにパラフィン包埋中の組織を向けます。しっかりと所定の位置に成形、プレスの上にラベルされた組織カセットを置きます。金型は、少なくとも30分間冷却してください。
3. ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織ブロックから（厚さ4μm）連続切片をカットします。組織のリボンがパラフィンブロックから離れるようセクションの下で予備洗浄スライドを置きます。
4. シリアルセクション全体大網。収集し、ギムザ染色（3.6を参照）ごとに第3の部分を染色します。 RTでO / N好ましくは、空気乾燥するセクションで、スライドガラスを許可します。乾燥したスライドは固定のために準備ができています。ギムザ染色スライドとの比較のためにヘマトキシリン​​およびエオシンのための最初のセクションを染色。
5. キシレンで2つの連続した​​5分間のインキュベーションによってスライドを脱パラフィン。以下に2つの連続インキュベーションによってスライドを再水和：100％エタノール、95％エタノール、そして最後にWAをタップター。
   1. 乾燥からスライドを避けるために適切な予防措置を講じてください。 RTですべての手順を実行します。
6. 完全に5％ギムザ溶液を含むコプリンジャーにスライドを浸漬し、室温で4分間インキュベートする（水道水で調製したW / V）。空気乾燥、60秒間スライドを水道水ですすぎ、取り付けメディアを使用してカバーガラスでマウントします。
7. イメージメーカーのソフトウェアを使用して全スライドスキャナとプロセスを用いて染色したスライド。 ImageJソフトウェア^{4を使用して、}ギムザ染色した大網のセクションで乳白色のスポット量を定量化します。

インビボおよびエクスビボ研究のための卵巣癌細胞の4伝播と準備

1. 熱浴で37℃に細胞成長培地のプレウォーム15 mlです。凍結ストックを調製した細胞ライン、通路番号、日付と人の名前、および日付で標識することにより、適切なサイズの組織培養フラスコ（例えば^、75cm 2の表面積）を準備そして、細胞をプレーティング/融解している人。
   注意：ダウン凍結および継代数の日は、転移性の表現型に影響を与えることができるように転移の研究では、このような詳細な情報は、非常に重要です。
2. 生物学的安全フード、ピペットT-75培養フラスコに培地10mlの無菌環境を使用して。液体窒素システムからの細胞のバイアルを取り外し、電池の種類を確認するために、ラベルを確認してください。 37℃の加熱浴中で加温することにより、一度にセルの一つのバイアルを解凍します。
3. 無菌技術を用いて、ピペット1×10 ^6の培養フラスコに細胞を解凍しました。細胞が付着できるようにするためにインキュベーターにフラスコを置きます。静かに均一な細胞懸濁液を形成するために、前後にフラスコを揺すります。
   1. 場所の組織培養インキュベーター中でフラスコを5％CO ₂環境において37℃で維持します。細胞は、O / Nを接着することを許可します。
4. 吸引するメディアは、新鮮な予熱した増殖培地と交換してください。インキュベーターにフラスコを置き、すべてのOW細胞が成長します。倒立顕微鏡を用いて2〜3日おきに目視検査により毎日細胞増殖を監視します。 70〜80％コンフルエンスに達したときに継代細胞への標準的な細胞培養技術を使用してください。
   注意：実験的なアッセイは、細胞が活発に増殖していることを確認するために、70％コンフルエンスで細胞を回収するために。
5. 培地を吸引除去し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlですすいでください。吸引し、PBSおよび0.25％トリプシン/ ^EDTA（75cm 2の表面積のために2〜3 ml）を追加し、37ºCで5分間インキュベートします。視覚細胞が切り離されていることを確認し、単一細胞懸濁液を得るために、上下同じ成長培地の体積、ゆっくりピペットセルを追加。
   注：それは、トリプシンを不活性化するように増殖培地は、血清を含有することが重要です。後続のステップの間に細胞の損失を補うために所定の実験のために必要な数よりも4倍以上のセルに少なくとも2-準備
6. 中の生存細胞の割合を決定します血球計または自動細胞カウンターを用いて、トリパンブルー排除アッセイを介したサスペンション。
   注：ここでは、細胞のみの≥96％が生存している細胞調製物を使用しています。
7. 50mlコニカルチューブにフラスコから細胞懸濁液を転送します。 ⁴ O℃で、1100×gで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化
8. 上清を吸引除去し、1ml当たり2×10 ⁶細胞の濃度になるようにPBSで細胞ペレットを再懸濁します。

細胞の5腹腔内注射

注：我々の実験では、マウスを病原体暴露のリスクを制限するために、私たちのバリア施設内の層流や安全キャビネット内で処理され、明らかにこの技術を実証するために、付属のビデオの手順は、承認された実験室で実施しました動物の仕事のため。この特定の技術は、麻酔下に動物を必要としません。承認されたプロトコルの下では、このtechniqを行います生きた動物のUE。この研究のために、マウスの適切な菌株を使用してください。たとえば、次のようにヒト卵巣癌細胞（SKOV3ip.1、およびHeyA8）コロニー形成の研究のために、免疫不全、無胸腺ヌードマウスを使用します。マウス卵巣癌細胞の研究のための免疫担当C57BL / 6マウス（ID8）コロニー形成を使用しています。

1. 滅菌キャップした25 G針を入れたシリンジにロードし、単一細胞懸濁液の500μlのをと。これは、注射の前に、細胞せん断を低減します。
2. 首筋によってマウスをピックアップし、手のひらと人差し指を使用して尾を保持し、リングと（マウスを左手で拘束されている）小指の間に左後肢を修正。
   注意：トラウマ腹部臓器を回避するために、それは注入中に動かないようによくマウスを抑えます。
3. ちょうど膝の上の腹部全体のラインを想像して、動物の右側のポイントを見つけて、正中線に近接しています。エントリのポイントは、頭蓋へとわずかに内側であります最後の乳首の。
   注：マウスの右側に針を挿入すると盲腸を回避し、腸^11を穿刺のリスクを低減します。
4. 約0.5センチメートルの深さに、マウスの腹部の下側方の領域に針を挿入します。針が血管または他の腹膜器官に浸透していないことを確認するために、プランジャーを後方に引いて。
   1. 任意の流体を吸引されている場合は、シリンジ（サンプル^{）11を捨てます} 。 - 緑がかった茶色や黄色の吸引は、それぞれ、腸や膀胱に針貫通を示します。
5. 遅い、安定した圧力を使用してサンプルを注入します。針を撤回し、そのケージにマウスを返します。シャープコンテナで処分する前に注射器をおさらいしないでください。
6. 特定の時間にポイントが注射後、CO _2窒息と重要な臓器摘出を経由してマウスを生け贄に捧げます。

生体6.ミルキースポット植民地化

1. Quantitaフローサイトメトリーを使用して乳白色のスポットへの癌細胞の局在化
   1. マウスから腹膜脂肪デポを分離する（ステップ2.3で説明したように - 2.7）蛍光氷冷PBS中の癌細胞と即時場所の組織をタグ付けで注入しました。
      1. この特定の技術については、重量試合大網へのすべての脂肪、脂肪組織。転写組織を無血清DMEM 1.5mlの0.1％（w / v）のウシ血清アルブミンを含有する5 mlチューブを分離します。プール組織は、フローサイトメトリーのための細胞の十分な収率を確保するために、3つの独立したマウスから採取しました。
   2. 外科用ハサミを使用して追加ミンチ組織（w / v）のコラゲナーゼIで回転混合しながら30分間37℃で組織懸濁液をインキュベートし、0.4％を含有する無血清DMEM 1.5mlの。
      1. オプションのステップとして、さらに咀嚼することによって、組織の関連付けを解除します。この場合、向きを回転させ、低オン10分間咀嚼、microstomacherバッグに組織コラゲナーゼサスペンションを転送5分後に袋の。
   3. ナイロンメッシュフィルター（60ミクロンの孔）を介して、フィルタのサンプルが大きな破片を除去します。 4℃で5分間、250×gの遠心分離により細胞を回収し、上清画分を捨てます。
   4. ACK溶解緩衝液900μLと混合し、1分間室温でインキュベートし、100μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁します。 250×gで遠心し、細胞を5分間、上清を捨てます。
      1. 氷冷PBS250μlの中で細胞ペレットを再懸濁します。単一細胞懸濁液を確実にするために、60ミクロンの孔のナイロンメッシュを通してサンプルをフィルタリングします。氷冷PBSの250μlのフィルターを洗浄します。
   5. 561 nmの黄緑色レーザーおよび585 nmの/ 15nmのバンドパスフィルターを備えたフローサイトメーターを使用して集団内の蛍光タグ付けされた細胞の数を定量します。親細胞および/ ​​または適切なネガティブコントロール⁴の分析に基づいてtdTomato陽性細胞のためのゲートを設定します。
2. 微視的および巨視的な転移の定量
   1. 希望の実験の終点（s）で、分離し、直ちに適切な固定メディアで組織を置きます。無傷性腺、子宮、および4℃で48時間、10％中性緩衝ホルマリンで腸間膜脂肪デポなどのより大きなサンプルを修正しました。 2-16時間4℃で5％中性緩衝ホルマリン中で小さいサンプル（大網とsplenoportal脂肪だけでなく、子宮及び腸間膜脂肪の組織相当）を修正しました。
      1. また、スナップ10月などの凍結培地でそれらを配置することによって、組織を凍結し、液体窒素の適切な量にドロップします。
   2. パラフィンに包埋するまで4℃で70％エタノールおよびストアに固定された組織を転送します。埋め込みと3.2と3.3で説明したようにプロセス組織。
      1. 微視的転移の有無について組織を評価するために、H＆E染色切片を使用する（ すなわち 、50個の細胞のクラスター）。トンを確認彼このようなサイトケラチン8/18のためのIHC染色などの二次法による微細な転移の存在は、卵巣癌細胞を検出することができます。

7.ミルキースポット植民エクスビボ

1. 基本的なex vivoで大網器官培養条件の確立
   1. 20％FCSを含むDME / F12培地の500μLを含む12ウェル組織培養プレートの1つのウェル内の単一培養プレートインサートと所定の位置にそれぞれ大網を置きます。 24〜48時間、および/ ​​または追加の時点で5％CO ₂環境下で37℃での器官培養を維持します。各条件（例えば、メディアタイプ/時点）のための3つの独立したomentumの複数形（三重サンプル）を使用します。
   2. 組織の完全性を評価することができるH＆E切片に壊死した脂肪細胞に対する健康カウントステップ3に記載のように修正し、プロセスサンプル、実験的なエンドポイントでの組織の整合性を確認するために。から〜120セルの最小5生物学的サンプルは^、10現在生きている組織の割合を策定する必要があります。
   3. 20％FCSをDME / F12培地を500μlを含む24ウェルプレートの別々のウェルにおける組織機能、場所omentumの複数形（N = 3）を測定しました。 omentumの複数形は、24時間、5％CO ₂環境において37℃で培地を調整し、その後、IL-6 ELISAアッセイ¹⁰で使用するための250μLを除去することを可能にします。
2. SKOV3ip.1-GFP細胞とマウスの大網の ex vivo共培養
   1. 成長し、1ml当たり2×10 ⁶細胞の濃度でセクション4および再懸濁で説明したように、蛍光タグ付けされた細胞を調製。
   2. 組織接着剤の〜6μlを培養インサートの膜に適用し、空気乾燥にそれを可能にします。余分な接着剤を除去するために、滅菌水で2回膜を洗ってください。空気が層流フードの下で膜を乾燥させます。
   3. 慎重omentumの複数形を切除し、接着剤を塗布したMEMBに添付滅菌ピンセットを使用してRANE。組織は、従来のメディアを追加する1分間膜に付着することを許可します。各培養インサート内の各大網の上に細胞懸濁液を500μlを追加します。 DME / F-12 ¹⁰ 2.5 mlのトランスウェルチャンバーの周りの領域を埋めます。
   4. 5％CO ₂環境において37℃で6時間、細胞懸濁液をインキュベートomentumの複数形。慎重に除去し、PBSの〜10mlでomentumの複数形を洗います。適切な蛍光イメージング^システム 10を用いた蛍光癌細胞の病巣を可視化します。

結果

腹膜脂肪デポの同定と組織学的検査

総解剖学的解剖は、腹膜脂肪（ 図1A）の5つの主要な情報源の4の同定を可能にします。上部中央から時計回りに移動すると、次のとおりです。大網（OM;概説）子宮角に取り付けられて胃と脾臓の上に位置して、左卵巣を囲む生殖腺脂肪（GF）（OV）、子宮脂肪（UF）（UH）そして、腸間膜（MY）は、小腸（SI）に?...

ディスカッション

播種細胞を標的とする治療法の開発は、腹膜疾患の発症に重要な最初のステップは 、転移性コロニー形成のメカニズムの理解が必要です。我々は、大網の固有の組織組成とアーキテクチャは、卵巣癌、転移性コロニー形成を促進する方法を識別するために使用することができるアプローチを報告し、これらの問題に対処します。我々のアプローチの特徴的な機能は以下のとおりです。...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Tools	Fine Science Tools	NA
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% Formalin	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Trypsin	Gibco	25200-056
PBS	Corning	21-040-CV	Without calcium and Magnesium
26 gauge needle	BD	329652
BSA	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	LS004196
Stomacher	Seward Labsystems	Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag	Stomacher Lab Systems	BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Millicell culture plate insert	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	354240