В Vivo и экс Vivo подходы к изучению рака яичников метастатического колонизации Млечного Местная структур в брюшной жировой

Резюме

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Аннотация

Высококачественная серозный рак яичников (HGSC), причиной распространенных перитонеального метастазов, по-прежнему имеет чрезвычайно плохой прогноз; меньше, чем 30% женщин живы через 5 лет после постановки диагноза. Сальник является предпочтительным местом формирования HGSC метастазов. Несмотря на клиническое значение этого микросреды, вклад сальника жировой ткани яичников прогрессии рака остается недостаточно изученной. Сальника жировой необычна тем, что она содержит структуры, известные как белесые пятна, которые состоят из B, T, и NK-клеток, макрофагов и клеток-предшественников, окружающих плотные гнезда сосудов. Белесые пятна играют ключевую роль в физиологических функций сальника, которые необходимы для перитонеального гомеостаза. Мы показали, что белесые пятна также способствовать рака яичников метастатического колонизации перитонеального жировой, ключевой шаг в развитии перитонеальных метастазов. Здесь мы опишем подходы мы разработали, чтобы оценить и количественно белесые пятна в заitoneal жировой и изучать их функциональное вклад в яичников клеток рака метастатического колонизации сальника тканей и в естественных условиях и экс естественных условиях. Эти подходы к обобщению дополнительные модели мыши и клеточные линии, что позволяет изучение формирования метастазов рака яичников от первоначального локализации клеток в молочных местная структур к развитию распространенных перитонеального метастазов.

Введение

В отличие от большинства солидных опухолей, метастазов из высококачественной серозного рака яичников (HGSC) ограничены в брюшную полость ^1. Таким образом, эффективные методы лечения перитонеального потенциально может контролировать или искоренить HGSC. В настоящее время стандарт терапевтический подход хирургического циторедукции в комбинации с химиотерапией ^1-3. К сожалению, подавляющее большинство пациентов испытывают и поддаваться осложнений рецидива заболевания. Эти мрачные статистические данные показывают, необходимость в улучшении понимания метастатического колонизации, процесс, посредством которого раковые клетки локализуются в, использовать и размножаться в тканях хозяина, чтобы сформировать метастазы ^2.

Сальник является предпочтительным рано сайт HGSC метастазов ^4-7. В отличие от других перитонеального жировой, сальниковой жировой ткани содержит необычные иммунные структуры, известные как белесые пятна, которые содержат B, T, и NK-клеток и макрофагов, которые играют ключевую роль в перитонеальных homeosТАСИС ^8,9. В дополнение к их физиологических функций, мы обнаружили, что белесые пятна играют активную роль в метастатическим раком яичников колонизации ^4. В экспериментальных метастазов анализов, SKOV3ip.1, CaOV3 и HeyA8 (человека) и ID8 (мышиного; C57BL / 6) клеток рака яичников быстро домой, чтобы белесые пятна, предполагая, что клетки движутся к секретируемого хемотаксиса фактора. Интересно, что раковые клетки не заселяют перитонеальный жировой хватает белесые пятна (то есть, гонадных и матки жир) ^4.

Для того, чтобы определить механизмы, регулирующие молочный пятна колонизации, мы оптимизировали модели ксенотрансплантатов, которые позволяют допрос клеточных и молекулярных событий в течение времени, конечно метастатического колонизации ^4. Конкретный преимущество подходов, описанных в настоящем документе, его акцент на архитектуре и функции тканей, что позволяет пользователям проверять гипотезы в полностью интегрирована в естественных условиях и бывших естественных модели мetastatic колонизация ^4,10. Сравнивая локализации раковых клеток и рост в перитонеальных жировых депо, которые либо содержат или отсутствие белесые пятна, исследователи могут проверить относительный вклад (ы) адипоцитов и клеток в молочных пятен на жилье и прогрессивного роста клеток рака яичников в физиологически соответствующих тканей.

протокол

Все мыши были размещены, поддерживается и эвтаназии в соответствии с Уходу за животными и использование комитета (IACUC) руководящих принципов и под контролем Университета Чикаго ресурсного центра животных.

1. Подготовка Животные для экспериментальных исследований

1. Разрешить животных, чтобы акклиматизироваться к новым корпусом и окружающей среды, чтобы оправиться от потенциальных физиологических эффектов транспортировки и обработки.
   Примечание: следующая методика применима для всех коммерчески доступных линий мышей. Количество животных, которые будут использоваться для эксперимента зависит от дизайна исследования и должно быть сделано с консультации с статистиком.

2. Выявление и изоляция перитонеального жировых депо.

1. Эвтаназии животных через _СО 2 передозировки и вторичного физического метода, чтобы подтвердить смерть.
2. Как уборочных брюшины жировых депо составляет внутреннюю извлечение органов (вторичный метод), мАке срединный разрез близко к паховой сосочков через брюшную стенку в подвергать внутренние органы (рис 1а).
3. Для сальниковой жира (OM), подвергать сальниковой / поджелудочной комплекс путем расширения селезенки из брюшной полости щипцами (рис 1c). Отпустите сальник из поджелудочной железы и селезенки, внимательно обрезки все соединения тканей. Убедитесь, что все оставшиеся ткани поджелудочной железы вырезали ^4.
4. Для гонадных жиров (GF), использовать пинцет, чтобы поднять гонадная жир, окружающий яичники и акциз от резки соединений ткани (1А верхнего Рог T) ^4.
5. Для матки жиров (UF), использовать пинцет, чтобы поднять матки жир, окружающий рога матки и акциз от резки ткани соединений (рис 1А нижний ^{правый)} 4.
6. Для брыжеечных жир (MF), вырезать соединение между тонкой кишки и привратника. Используйте пинцет, чтобы твердо сцепление свободный конецтонком кишечнике, и медленно "корки", что от брыжеечной жира. Отпустите брыжеечной жир из брыжеечной корня с помощью ножницы рассекает (1А нижний левый) ^4.
7. Для Splenoportal жир (SF), снять дистальный конец селезенки с помощью щипцов, чтобы обнажить тонкую жирную полосу ткани, соединяющий воротах селезенки поджелудочной железы. Вырежьте splenoportal жир сначала выпуская его из поджелудочной железы, а затем тщательно анализируя его из селезенки (рис 1B) ^4.

3. Млечный Пятно Идентификация Используя Giemsa окрашивания

1. Акцизный omenta (обратитесь к шагу 2.3) от мышей C57BL / 6 и зафиксировать в 5% -ном нейтральном забуференном формалине при 4 ° С в течение 16 ч (O / N).
2. Для парафин фиксированной ткани, выбрать форму, подходящую для размера ткани. Налейте расплавленного парафина с парафиновым резервуара заполнить форму. Откройте кассету и с помощью теплой длябелых грибов, передавать ткани в форму.
   1. Тщательно ориентироваться тканей во время парафин для производства продольные разрезы. Поместите надписью кассету тканей над формования и прессы твердо на месте. Дайте форме остыть, по крайней мере 30 мин.
3. Вырезать серийных срезов (толщиной 4 мкм) из фиксированных формалином парафиновых (FFPE) ткани блока. Поставьте предварительно очищенные слайд по разделам, как лента ткани отрывается парафинового блока.
4. Серийно раздел весь сальник; собирать и окрашивать каждый третий раздел Гимза (см 3.6). Разрешить стекло с секциях высохнуть на воздухе, предпочтительно О / Н при комнатной температуре. Сушеные слайды готовы для фиксации. Пятно первый раздел гематоксилином и эозином для сравнений Гимза окрашенных слайдов.
5. Deparaffinize слайды двумя последовательными 5 мин инкубации в ксилолы. Увлажняет слайды двух последовательных инкубации в следующем: 100% этанола, 95% этанола, и, наконец, нажмите ватер.
   1. Примите соответствующие меры предосторожности, чтобы избежать слайды из сушки. Выполните все шаги при комнатной температуре.
6. Полностью погрузить слайды в банку Коплин, содержащей 5% раствор Giemsa (вес / объем полученного в водопроводной воде) и инкубируют в течение 4 мин при комнатной температуре. Промыть слайды в водопроводной воде в течение 60 сек, воздух сухой и крепление с помощью крепежных покровного средства массовой информации.
7. Изображение окрашенные слайды, используя сканер слайдов Всего и процесс с производителем программного обеспечения. Количественно молочный объем место в Гимза окрашенных сальника разделы, используя ImageJ программного обеспечения ^4.

4. Распространение и подготовка яичников раковых клеток для В естественных условиях и бывших естественных условиях Исследования

1. Предварительно теплые 15 мл среды для роста клеток на 37 ° С в термостате. Подготовка соответствующего размера культуре ткани колбу (например, 75 см ^{площадь} 2 поверхности) по маркировке с именем клеточной линии, номер пассажа, дату и лица, составившего замороженные акции, и датаи человек, который тает / покрытие клетки.
   Примечание: В исследованиях метастазов например детальная информация имеет решающее значение, так как дата замораживания вниз и числом пассажей может повлиять на метастатический фенотип.
2. Использование стерильной среде биологической безопасности, капот пипетки 10 мл среды в колбе для культивирования Т-75. Снимите флакон клеток из системы жидкого азота и проверьте, чтобы подтвердить тип клеток. Оттепель только один флакон клеток, в то время, нагревая в 37 ° C тепла ванне.
3. Использование стерильных, пипетка 1x10 ⁶ талой клетки в культуре колбу. Колбу помещают в инкубатор, чтобы позволить клеткам прикрепляться. Осторожно покачайте фляжку с образованием однородной суспензии клеток.
   1. Поместите колбу в инкубаторе тканевых культур и поддерживать при температуре 37 ° С в 5% СО ₂ окружающей среды. Разрешить клетки придерживаться O / N.
4. Аспирируйте СМИ, и заменить свежим подогретого СМИ роста. Колбу помещают в инкубатор и всеOW клеткам расти. Монитор роста ежедневно визуальным осмотром клеток каждые 2-3 дня использованием инвертированного микроскопа. Используйте стандартные методы культивирования клеток к прохождению клеток при достижении 70-80% слияния.
   Примечание: Для экспериментальные анализы сбора клеток в 70% слияния, чтобы обеспечить, что клетки активно пролиферирующих.
5. Аспирируйте культуральную среду и промыть 10 мл стерильной фосфатным буферным раствором (PBS). Аспирируйте PBS и добавить 0,25% трипсин / ЭДТА (от 2 до 3 мл на 75 см ² площади в поверхности) и инкубировать 5 мин при 37 ° С. Визуально подтверждают, что клетки были отключены, и добавляют равный объем среды для роста, и осторожно пипеткой клетки вверх и вниз, чтобы получить суспензию отдельных клеток.
   Примечание: Очень важно, что питательная среда содержит сыворотку, как это инактивирует трипсин. Подготовьте по крайней мере, от 2 до 4 раз больше клеток, чем количество, необходимое для данного эксперимента, чтобы компенсировать потерю клеток в процессе последующих этапов
6. Определить процент жизнеспособных клеток вподвеска с помощью трипанового синего анализе с использованием гемацитометра или автоматизированный счетчик клеток.
   Примечание: Здесь следует использовать только клеточные препараты, в которых ≥ 96% клеток жизнеспособными.
7. Передача клеточной суспензии из колбы в 50 мл коническую пробирку. Пелле клеток путем центрифугирования 5 мин при 1100 мкг при 4 ^{° С.}
8. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в PBS до концентрации 2х10 ⁶ клеток на мл.

5. Внутрибрюшинное инъекции клеток

Примечание: В наших экспериментах мыши обрабатываются в ламинарном потоке воздуха или биобезопасности кабинета в нашем барьера объекта для того, чтобы ограничить риск воздействия патогена, Для того, чтобы продемонстрировать эту технику ясно, что процедуры в сопровождающей видео проводились в лаборатории, утвержденной для животных работы. Данный метод не требует, чтобы животные под наркозом. Под утвержденных протоколов, выполнить эту Techniqие на живых животных. Используйте соответствующие штаммы мышей в данном исследовании. Например: используйте иммунитетом, бестимусных голых мышей для изучения человеческой раковой клетки яичников (SKOV3ip.1 и HeyA8) колонизация; использовать иммунокомпетентных мышей C57BL / 6 для изучения мыши клеток рака яичников (ID8) колонизации.

1. Нагрузка 500 мкл суспензии отдельных клеток в шприц и поставить в стерильной ограничен 25 G иглы. Это снижает клеточную сдвиг до инъекции.
2. Выберите мышь вверх по шиворот и удерживайте хвост, используя ладонь и указательный палец и закрепите левую заднюю ногу между кольцом и мизинца (когда мышь сдержанной с левой стороны).
   Примечание: Чтобы избежать травмирующее психологическое органов брюшной полости, сдерживать мышь хорошо, так что он не может двигаться во время инъекции.
3. Представьте себе линию поперек живота чуть выше колен, и найдите точку на правой стороне животного, недалеко от средней линии. Точка входа в краниально к медиальной и слегкапоследнего соска.
   Примечание: Вставка иглу на правой стороне мыши избегает слепой кишки и снижает риск прокола кишечника ^11.
4. Вставьте иглу в нижней боковой области живота мышей, чтобы глубине примерно 0,5 см. Потяните на поршень, чтобы подтвердить, что игла не проникла в кровеносный сосуд или другие органы брюшины.
   1. Если какая-либо жидкость отсасывают отбросить шприц (и образец) ^11. Зеленовато-коричневый или желтый аспирации указывает проникновение иглы в кишечник или мочевой пузырь, соответственно.
5. Вводите пробу с помощью медленно, постоянное давление. Вывод иглу и вернуть мышь в клетку. Не надевайте шприц перед утилизацией в контейнер для острых предметов.
6. Жертва мышей через _СО 2 удушья и жизненной изъятия органов в определенных временных точках после инъекции.

6. Млечный место колонизация В естественных условиях

1. Количественно онние раковых клеток локализации в белесые пятна с помощью проточной цитометрии
   1. Изолировать перитонеальные тучные склады от мышей (как описано в шаге 2.3 - 2.7) вводили флуоресцентно помеченные раковые клетки и непосредственные места ткани в ледяном PBS.
      1. Для данного метода, вес матча все жировая ткани жирные к сальника. Передача ткани, чтобы отделить 5 мл пробирки, содержащие 1,5 мл бессывороточной среды DMEM и 0,1% (вес / объем) бычьего сывороточного альбумина. Бассейн ткани, полученные из трех независимых мышей, чтобы обеспечить достаточный выход клеток для проточной цитометрии.
   2. Mince тканей с использованием хирургических ножниц и добавить 1,5 мл бессывороточной среды DMEM, содержащей 0,4% (вес / объем) коллагеназы И. Инкубируйте суспензии ткани при 37 ° С в течение 30 мин с перемешиванием вращения.
      1. В качестве необязательной стадии, дополнительно отделить от ткани жевания. В этом случае, передача ткани коллагеназы суспензии в microstomacher мешок, жевать в течение 10 мин на низкой, вращая ориентациюмешков через 5 мин.
   3. Образцы фильтруют через фильтр из нейлона меш (60 мкм) пор, чтобы удалить большую мусора. Собирают клетки центрифугированием при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить фракцию супернатанта.
   4. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл PBS в сочетании с 900 мкл буфера для лизиса АСК и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин. Центрифуга клетки при 250 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант.
      1. Ресуспендируют осадок клеток в 250 мкл ледяной PBS. Фильтр образцы через нейлоновую сетку пор 60 мкм, чтобы обеспечить суспензии отдельных клеток. Промыть фильтр с 250 мкл охлажденного льдом PBS.
   5. Количественного определения количества флуоресцентно меченых клеток в популяции с использованием проточного цитометра, оснащенного 561 нм желто-зеленого лазера и 585 нм / 15 нм полосовой фильтр. Установите ворота для tdTomato-позитивных клеток на основе анализа родительских клеток и / или соответствующих отрицательных контролей ^4.
2. Количественное микроскопические и макроскопические метастазы
   1. В экспериментальной желаемой конечной точки (ов), изолировать и сразу же поставить тканей в соответствующей фиксирующей сред. Исправление больших образцов, таких как интактным половой железы, матки и брыжеечных жировых депо в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 48 ч при 4 ° С. Fix меньшие образцы (сальника и splenoportal жира, а также ткани эквиваленты матки и брыжейки жира) в 5% -ном нейтральном формалине с буфером при 4 ° С в течение 2-16 ч.
      1. Кроме того, оснастки заморозить ткани, помещая их в морозильной среде, такой как OCT, и упасть в соответствующем количестве жидкого азота.
   2. Передача не фиксируется на ткани 70% этанола и хранят при температуре 4 ° С до встраивания в парафин. Вставить и процесс ткани, как описано в 3.2 и 3.3.
      1. Использование Н & Е окрашенных раздел оценить тканей на наличие или отсутствие метастазов микроскопических (т.е. кластеры 50 клеток). Подтвердите тон наличие микроскопических метастазов по методу вторичного таких как пятна IHC для цитокератина 8/18 обнаружить клеток рака яичников.

7. Млечный пятна Колонизация Ex Vivo

1. Создание основных бывших естественных условиях культивирования сальника органов
   1. Место каждого сальника в одном вставки пластины культуры и место в одну лунку планшета для культуры ткани двенадцать лунку, содержащую 500 мкл DME / F12 среды, содержащей 20% FCS. Поддержание культуры органов при 37 ° С в 5% _СО 2 окружающей среды в течение 24 ч 48 и / или дополнительных временных точках. Используйте три независимых omenta (три образца) для каждого условия (например, тип носителя / время точки).
   2. Для подтверждения целостности тканей в экспериментальных конечных точек, исправить и технологические образцы, как описано в шаге 3. Подсчет здоровым против некротических адипоцитов на H & E разделов могут оценить целостность тканей. Минимум ~ 120 клетки5 биологические образцы требуется сформулировать процент живой ткани настоящего ^10.
   3. Для измерения функции ткани, место omenta (N = 3) в отдельных лунках 24-луночного планшета, содержащую 500 мкл DME / F12 с 20 средах% FCS. Разрешить omenta в состояние СМИ в 37 ° С в 5% _СО 2 окружающей среды в течение 24 ч, а затем удалить 250 мкл для использования в IL-6 ELISA анализе ^10.
2. Экс естественных совместное культивирование сальника мыши с SKOV3ip.1-GFP клеток
   1. Расти и подготовить флуоресцентно помеченные клетки, как описано в разделе 4 и ресуспендируют в концентрации 2 × 10 ⁶ клеток на мл.
   2. Применение ~ 6 мкл тканевого адгезива на мембране культуры вставки и позволяют ему высохнуть на воздухе. Промыть мембрану дважды стерильной водой для удаления излишнего клея. Воздух сухой мембраны под капотом ламинарного.
   3. Тщательно акцизного omenta и приложите его к покрытой адгезивом MembRane с помощью стерильного пинцета. Дайте ткани прилипать к мембране в течение 1 мин перед добавлением носителя. Добавить 500 мкл клеточной суспензии в верхней части каждой сальника в каждой культуре вставки. Заполните область вокруг Transwell камеры с 2,5 мл DME / F-12 ^10.
   4. Инкубируйте omenta с клеточной суспензии в течение 6 ч при 37 ° С в 5% _СО 2 среде. Осторожно снимите и вымойте omenta с ~ 10 мл PBS. Представьте флуоресцентный очаги раковых клеток с помощью соответствующего флуоресцентного системы визуализации ^10.

Результаты

Идентификация и гистологического исследования перитонеального жировых депо

Полная анатомическая рассечение позволяет идентифицировать четыре из пяти основных источников перитонеального жира (рис 1А). Грузоперевозки по часовой стрелке от верхнего ?...

Обсуждение

Разработка терапии для целевой ячейки, распространяемых требует механическое понимание метастатического колонизации, критический первый шаг в развитии перитонеального болезни. Для решения этих проблем мы фиксировали подходы, которые могут быть использованы для различить,...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Tools	Fine Science Tools	NA
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% Formalin	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Trypsin	Gibco	25200-056
PBS	Corning	21-040-CV	Without calcium and Magnesium
26 gauge needle	BD	329652
BSA	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	LS004196
Stomacher	Seward Labsystems	Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag	Stomacher Lab Systems	BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Millicell culture plate insert	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	354240