単純ヘルペスウイルス1型を持つマウス表皮の ex vivo 感染

要約

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

要約

そのヒト宿主を入力するには、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）は、粘膜表面、皮膚、または角膜の障壁を克服しなければなりません。 HSV-1の目標は、最初の入力時にケラチノサイトおよび神経細胞の潜伏感染が続いている上皮における一次感染を確立します。再活性化した後、ウイル​​スは皮膚の小胞または粘膜潰瘍として現れる皮膚粘膜のサイトで明らかになることができます。 HSV-1は、皮膚や粘膜に侵入し、到達したか、その受容体は、あまり理解されていません。細胞レベルでの上皮組織へのHSV-1の侵入経路を調べるために、我々は、皮膚中の原発性および再発性感染症の部位を表すマウス表皮の ex vivo感染モデルを、確立しました。アッセイは、マウスの皮膚の準備が含まれています。表皮は、ディスパーゼII処理により真皮から分離されています。ウイルス含有培地に表皮シートを浮遊した後、組織が固定され、感染による種々の時間の感染後に視覚化することができますHSV-1前初期タンパク質ICP0に対する抗体を感染させた細胞を染色します。 ICP0発現細胞は、1.5時間の感染後に既に基底ケラチノサイト層で観察することができます。より長い感染時間で、感染した細胞は、感染は、基底ケラチノサイトに限定されないことを示す、基底上層において検出されるが、ウイルスが組織内の他の層に広がります。様々なマウスモデルの表皮シートを使用して、感染のプロトコールは、組織内へのHSV-1の侵入に寄与する細胞成分の関与を決定することができます。さらに、アッセイは、初期エントリ段階、細胞から細胞への広がりおよびウイルス産生を妨害する組織で阻害剤を試験するのに適しています。ここでは、詳細にex vivoでの感染プロトコルを記述し、ネクチン1またはHVEM欠損マウスを用いて、我々の結果を提示します。

概要

単純ヘルペスウイルス（HSV）は、生命を脅かす感染症に軽度の合併症のない皮膚粘膜病変から、ヒトでの疾患の範囲を引き起こす可能性があります。 HSV 1型（HSV-1）が支配的に可能性が高い生殖器感染症^{を引き起こす1} HSV 2型（HSV-2）、一方、口腔顔面感染症および脳炎に関連しています。 HSVは、培養中の細胞に入り、感染を開始し、ウイルス子孫を生産する方法を理解する上で重要な進展があるが、我々は細胞レベル²での組織へのウイルスの侵入経路（複数可）について少し知っています。 HSV皮膚または感染、マウス、ウサギ、モルモット、粘膜の研究のための動物モデルとして使用されています。皮膚感染は皮内注射によって、またはウイルスの存在下で肌を掻くことによって設立され、病気の発症は、ウイルス産生と相関していました。これらの方法は、疾患の病因の様々な側面を理解することを助け、及び抗ウイルス薬を評価するために使用されます。 TISSUでHSV感染を研究するために、Eレベルは、器官型ヒト皮膚モデルが適用されています。感染率は、これらのいかだ培養で制限されているように、感染症、ウイルスの拡散および抗ウイルス成分の影響を調査した研究の限られた数しか^3-6を公開されています。

無傷の上皮におけるHSV-1感染の間に役割を果たしている細胞の決定を特徴づけるために、我々は、マウスの表皮⁷のex vivo感染研究のためのプロトコルを確立しました。皮膚は、新生児からか、成体マウスの尾から調製しました。 HSV-1は、ウイルス含有培地中に浸漬した完全な皮膚サンプルを、感染することができませんでしたので、私たちは、ディスパーゼII処理によって真皮から表皮を分離しました。ウイルス含有培地上で表皮シートの浮上した後、感染した細胞を様々な時間感染後^（PI）7に表皮基底層に可視化することができます。ウイルス複製Aの​​前に、個々の細胞における感染の開始を可視化しますNDウイルス産生は、我々は、HSV-1感染中に発現最初のタンパク質のうちの1つである感染した細胞の蛋白質0（ICP0）に対する抗体で染色しました。 ICP0の細胞内局在は、初期感染時に明確な相を通過します。 ICP0は、ウイルス遺伝子発現の初期段階の間に、核病巣に存在するが、細胞質へのICP0の再局在は、感染⁸の次の段階を示しています。

我々は、感染の間に、様々な細胞因子の潜在的な役割をテストするために別のマウスモデルから表皮シートの ex vivo感染アッセイを使用していました。アクチンダイナミクスの重要な調節因子としてのRac1の影響に対処するために、我々は、RAC1遺伝子⁹のケラチノサイト特異的欠失を有するマウスの表皮を感染させました。このモデルは、表皮角化細胞層におけるHSV-1感染の効率に欠損のRac1の影響を研究するために私達を可能にしました。再対照同腹子の感染表皮との比較Rac1の不在は、表皮の基底層⁷における感染の開始に影響を及ぼさないことを示し、有意差はvealedありません。さらに、マウスモデルの使用は、私たちは細胞の受容体は、表皮内への進入を媒介する対処することができました。 HSV-1とネクチン1またはHVEM欠損マウスのいずれかから感染表皮シートは、組織への最初のウイルスの侵入を強くネクチン1 ¹⁰の存在に依存することを明らかにしました。さらに、我々の結果は、HVEMはまた、ネクチン1 ¹⁰未満の効率が、マウスの表皮における受容体として働くことができることを実証しています。

表皮層における感染細胞の空間分布に対処するために、我々は、組織切片および表皮ホールマウント（ 図1）にICP0発現を可視化します。完全な皮膚の凍結切片では、何のICP0発現細胞は、（ 図1）検出されません。対照的に、表皮シートの凍結切片は、細胞質を実証すでに3時間のPI（ 図1）での基底層でICP0式。後の時点で、基底層直上の層に拡散するウイルスを可視化することができます。基底層中の感染細胞の空間分布は、容易に表皮ホールマウント（ 図1）に従うことができます。 100 PFU /細胞でのHSV-1の感染の際に、毛包間表皮における基底ケラチノサイトの約50％が最も感染した細胞が核ICP0を表現するこの時点で1.5時間のパイでICP0の発現を示します。初期遺伝子発現の後の段階を示す細胞質へICP0の再局在は、3時間のPI（ 図1）で、ほぼすべての細胞に存在します。 ex vivoで HSV-1感染時に感染した細胞を可視化これらのモードは、阻害剤のまたは組織中のウイルスの侵入と拡散上/削除変異した細胞成分の効果を研究するための強力なアッセイを提供します。

プロトコル

倫理ステートメント。

屠殺した動物からの表皮シートの製造はLandesamtエリーゼナチュール、環世界とVerbraucherschutz、ノルトライン=ヴェストファーレン（ドイツ）のガイドの勧告に厳密に従って実施されます。研究はLANUV NRW（番号8.84-02.05.20.13.018）によって承認されました。

楽器と培養培地の調製

1. グルタミンジペプチド、10％FCS、100 IU / mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシン（以下「DMEM」と称する）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/高グルコースに表皮シートを養います。
2. 表皮シートの製造のために、慎重に加熱したPBSでディスパーゼII粉末（5 mg / mlの）を溶解（最大37℃）。 0.22μmのフィルターを通して溶液を濾過し、治療のためにそれを直接使用しています。
3. 表皮全体の製造は^{13をマウント}するために、バフを遮断準備0.5％の粉乳、冷水魚皮から0.25％のゼラチン及びTBS中0.5％のTriton X-100とER。物質は、回転ミキサー上で室温で少なくとも2時間混合物をインキュベートすることによって溶解させます。また、洗浄用緩衝液としてPBS中の0.2％のTween 20を準備します。固定のために、3.4％、PBS中4％ホルムアルデヒドを準備します。
4. 凍結切片の免疫染色のために、PBS中の5％正常ヤギ血清および0.2％Tween 20でブロッキングバッファーを準備します。固定のため、PBS中の0.5％ホルムアルデヒドを準備します。

マウスの皮膚から表皮シートの作製

1. 感染研究のための新生児背中の皮膚からの表皮の調製
   1. 解剖皿に断頭マウス（生後1〜3日）を配置し、四肢と完全な胴体から皮膚の効率的な除去を可能にする胴体に近い尾をカット。四肢の除去中に、直径が可能な限り小さくカットを維持しようとします。
   2. 湾曲した微細な鉗子Aと胴体を修正優しく胴体から皮膚を分離するために、バックに沿って尾側する頭蓋から皮膚の下に鈍い先端のはさみを動かすND。背面に沿って皮膚をスリット。
   3. FACS分析、ケラチノサイトまたはRNAの準備を単離するために、胴体をオフにプッシュする組織と鈍い先端のはさみを修正するために鉗子を使用して、胴体から完全に皮をはがし。凍結切片またはホールマウントの調製のために背中の皮膚の部分だけを取ります。
   4. 約10×10mmの1-2個にメスで背部皮膚をみじん切りに。 〜1ミリリットル滅菌PBSで6ウェルプレートの1ウェルに作品を配置。真皮側が下を向いていることを確認します。
   5. 1.5ミリリットルのディスパーゼIIでPBSを交換してください（5 mg / mlのPBS）と（ホールマウント用）、37℃で、またはO / N 4℃で30分間のいずれかでインキュベートします。 PBSで3回洗浄します。静かに表皮を持ち上げるために、基礎となる真皮および他の鉗子を修正するために、1つの鉗子を使用して、完全なシートとして表皮を除去します。このステップEASを作るために双眼鏡を使用して、Y。下部にその基底側を含むDMEMに表皮シートを転送します。感染実験のためにすぐにシートを使用してください。
      注：主にFACS分析、ケラチノサイトまたはRNAの準備を単離するための新生児の皮膚からの表皮の準備を使用してください。理由は、その脆弱性のため、凍結切片またはホールマウントのための感染シートの製造は、あまり適していません。
2. 感染研究のための大人の尾の皮膚から表皮の調製
   1. 頚椎脱臼により1〜3ヶ月の年齢でマウスを安楽死させます。背中の長い埋め込み毛包が無傷の表皮シートの分離を妨げるので、代わりに背中の皮膚の尾を取ります。屠殺したマウスから尾をカットし、メスで長さ方向にスリット。
   2. 骨から皮をはがしし、約5×5mmの小片にメスでそ​​れを切ります。 1つのウェルに4枚まで入れて、2.1.5で説明したようにディスパーゼII中でのインキュベーションを進めます
      注：使用大人太極拳リットルの皮膚は、凍結切片またはホールマウントを調製しました。あるいはすぐに使用する、尾部は、かなりの感染効率を損なうことなく記憶または4℃で約24時間、輸送することができます。尾部は、4​​8時間まで維持される場合、表皮シートがほとんどHSV-1に感染したことはできませんでした。
3. FACS分析のために表皮の解離
   注：FACS分析による表面タンパク質の発現の検出は、細胞表面と目的のタンパク質を損なわない適切な細胞分離技術を必要とします。
   1. RTで15分間、1.5ミリリットル/ウェルの組換えトリプシンに基づく細胞解離溶液に、37℃で15分間基底側を6ウェルプレート中の新生表皮シートをインキュベートします。
   2. 3ミリリットルのDMEMを追加することにより、インキュベーションを停止します。ケラチノサイトが溶解を得るように穏やかに6ウェルプレートに表皮を移動させるように湾曲した微細なピンセットを使用して、ケラチノサイトを解離します。細胞懸濁液を収集し、このステップを3回繰り返します常に新鮮なDMEMを使用。
      注：この解離手法は、ケラチノサイトの表面にネクチン1を検出することが適当です。
   3. あるいは、RTで15分間、37℃で15分間、酵素を含まない細胞解離溶液に表皮シート（CDS）をインキュベートします。優しく上下CDSをピペットでケラチノサイトをフラッシュするために、室温でさらに15分間インキュベートします。
   4. 細胞懸濁液を収集し、新鮮なDMEMを使用して、フラッシング工程を3回繰り返します。
      注：この解離がHVEMの表面発現を検出するのに適しています。 CDS溶液の欠点は、より少ない細胞が、組換えトリプシンに基づく細胞解離溶液よりも解離することです。表面発現に加えて、ICP0式として、核または細胞質発現は、組換えトリプシン基づく細胞解離溶液で感染表皮シートの解離後にFACSによって分析することができます。
4. ケラチノサイトまたはexを単離するための表皮の解離道のRNA
   1. 1.5ミリリットル/ウェルの組換えトリプシン基づく細胞解離溶液を含んでいる皿の底部に向かって基底側で6ウェルプレートに新生児表皮シートを置きます。 RTで30分間インキュベートします。 3ミリリットルのDMEMを加え、穏やかに皿に表皮を移動するために、湾曲細かい鉗子を使用して、ケラチノサイトを解離。
   2. 細胞懸濁液を収集し、新鮮なDMEMを使用して、この手順を3回繰り返します。この細胞懸濁液は、RNAを抽出したり、文化の一次マウスケラチノサイトにするために使用します。

HSV-1と表皮シートの3感染

1. 500μlのDMEM以上にHSV-1 WT株17 ¹¹の溶液を調製し、表皮シートはフローティングされたウイルス液で培地を交換してください。この時点は、0時間¹²として定義される。37℃で24ウェルプレートの1ウェルに表皮シートの感染を行っ。ウイルス力価の計算は、推定された数に基づいています表皮シート（5×5 mmのシートあたり約2×10 ^5細胞 ）あたりの基底層での細胞。
2. HSV-1で約100プラーク形成単位（P​​FU）/細胞で感染し、1時間のパイでDMEMによるウイルス含有培地を交換
   注：新生児の皮膚から表皮シートの場合、シートはインキュベーション中に解離し始めることに注意してください。

感染した細胞の可視化4.

1. 表皮ホールマウント¹³
   1. RTまたはOで2時間/ N 4℃のいずれかの3.4％ホルムアルデヒドで表皮シートを修正。 PBSで2回洗浄し、0.5％粉乳、冷水魚皮、室温¹⁴で1時間、TBS中の0.5％のTriton X-100 0.25％ゼラチンでブロックします。
   2. ^{15を室温で}ブロッキング緩衝液中で1:60に希釈したマウス抗ICP0（モノクローナル抗体11060）とシートO / Nインキュベートします。中間径フィラメントネットワークを可視化するために、ウサギポリクローナルと同時にインキュベート抗マウスケラチン14（100ng / mlの）。
   3. 室温で4時間の間に、PBS-0.2％Tween 20で4〜5回洗浄します。 AF488結合抗マウスIgG（1 / mlの）、AF555結合抗ウサギIgG（1 / mlの）、およびDAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）（100 ngのでO / Nインキュベート/ ml）を、室温でブロッキング緩衝液中。
   4. 室温で4時間、PBS-0.2％Tween 20で洗浄します。試料スライドの上にその基底側マウントの表皮シート、蛍光マウンティング培地中に埋め込んで、カバーガラスでカバーしています。
2. 表皮凍結切片
   1. 成人表皮シートを室温で20分間、PBS中の4％ホルムアルデヒドで固定し、PBSで2回洗浄しました。液体窒素中の培地と凍結凍結組織で固定シートを埋め込みます。クライオミクロトームで8-10ミクロンのセクションをカット。
   2. RTで10分間PBS中0.5％ホルムアルデヒドで再びセクションを修正、PBSで2回洗浄し、5％正常ヤギ血清でブロックし、0.2％Tween 20をPBS中で室温で30分間、次いで、Mで60分間染色ウーズ抗ICP0（モノクローナル抗体^{11060）15は、}ブロッキング緩衝液で3回洗浄し、続いて、ブロッキング緩衝液中で1:60に希釈しました。
   3. その後、RTで45分間ブロッキング緩衝液中にAF488結合抗マウスIgG（1μg/ ml）およびDAPI（100ng / mlの）でインキュベートし、3回洗浄します。蛍光マウンティング培地中のセクションを埋め込み、カバーガラスでカバーしています。

結果

この方法の課題は、HSV-1は、基底層から浸透することが可能に表皮シートを調製することです。重要なステップは、マウスの系統に応じて、適合させる必要があり、ディスパーゼII処理によって真皮から表皮を分離することです。ディスパーゼIIの濃度は、2.5から5 mg / mlの、そして20〜45分間のインキュベーション時間の範囲であることができます。中間フィラメントタンパク質のケラチン14の?...

ディスカッション

C57BL / 6から、成人の皮膚の表皮シートは、HSV-1に感染している場合で約100 PFU /細胞より低いウイルス用量が少なく、感染細胞と相関し、遅いながら、私たちは、毛包間表皮内の基底層のほぼ全ての細胞に感染を観察感染の進行。一般的には、毛包には、感染した細胞の可変数を示します。開発毛包の内側を覆うかなり小さいケラチノサイトのほとんどが感染している間、大人の毛包の唯一の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX	Life Technologies	31966047	needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder	Roche	4942078001	has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution	Sigma	C5914	needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution	Life Technologies	12563-029	needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin	Bio-Rad	142-2832	needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765	needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)	Covance	PRB-155P	used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-11029	used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-21429	used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml)	Sigma	36670	used to counterstain the nucleus