Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

Zusammenfassung

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Zusammenfassung

Um seine menschlichen Wirt eingeben, müssen Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) die Barriere von Schleimhäuten, Haut oder Hornhaut zu überwinden. HSV-1 Ziele Keratinozyten während der anfänglichen Eingabe und stellt eine Primärinfektion im Epithel, die durch latente Infektion von Neuronen folgt. Nach Reaktivierung können Viren deutlich an Schleimhaut Websites, die als Hautbläschen oder Schleimhautgeschwüre angezeigt zu werden. Wie HSV-1 dringt in Haut oder Schleimhaut und erreicht seine Rezeptoren ist wenig bekannt. Um die Invasion Route der HSV-1 in epidermale Gewebe auf zellulärer Ebene zu untersuchen, haben wir ein ex vivo-Infektionsmodell von murinen Epidermis, die den Ort der primären und rezidivierenden Infektion in der Haut darstellt. Der Test umfasst die Vorbereitung der Mäusehaut. Die Epidermis von der Dermis durch Dispase II Behandlung getrennt. Nach dem Aufschwimmen der epidermalen Schichten auf virushaltige Medium wird das Gewebe fixiert und Infektion kann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion durch visualisiertFärbung infizierter Zellen mit einem Antikörper gegen HSV-1-immediate early protein ICP0. ICP0-exprimierenden Zellen kann in der basalen Keratinozyten-Schicht bereits bei 1,5 Stunden nach der Infektion beobachtet werden. Mit längeren Zeiten der Infektion werden infizierte Zellen in Suprabasalschichten nachgewiesen, was anzeigt, dass die Infektion nicht auf die basalen Keratinozyten beschränkt, sondern das Virus verbreitet sich auf andere Schichten in dem Gewebe. Verwendung epidermalen Schichten von verschiedenen Mausmodellen erlaubt die Infizierungsprotokoll Bestimmung der Beteiligung von zellulären Komponenten, die zu HSV-1-Invasion im Gewebe beitragen. Darüber hinaus ist der Test geeignet, um Inhibitoren in Gewebe, das mit den ersten Eintrag Schritte stören, Zell-zu-Zell-Ausbreitung und die Virusproduktion zu testen. Hier beschreiben wir die ex vivo Infektion Protokoll im Detail und mit Nectin-1- oder HVEM-defizienten Mäusen präsentieren unsere Ergebnisse.

Einleitung

Herpes-simplex-Virus (HSV) können eine Reihe von Erkrankungen bei Menschen von leichten unkompliziert mukokutane Läsionen zu lebensbedrohlichen Infektionen. HSV Typ 1 (HSV-1) wird überwiegend mit orofazialen Infektionen und Enzephalitis assoziiert, während HSV Typ 2 (HSV-2) eher verursacht Genitalinfektionen ^1. Zwar gibt es deutliche Fortschritte im Verständnis, wie HSV tritt in Zellen in Kultur initiiert und produziert Infektion Virusnachkommen, wissen wir wenig über das virale Invasion Weg (e) in das Gewebe auf zellulärer Ebene ^2. Bei Studien von HSV Haut- oder Schleimhautinfektionen, Mäuse, haben Kaninchen und Meerschweinchen als Tiermodelle verwendet. Hautinfektion wurde durch intradermale Injektion oder durch Kratzen der Haut in Gegenwart von Virus etabliert und die Entwicklung der Krankheit wurde mit der Virusproduktion korreliert. Diese Verfahren beigetragen, verschiedene Aspekte der Pathogenese der Erkrankung zu verstehen, und werden verwendet, um antivirale Medikamente zu bewerten. Um HSV-Infektion am tissu studierene Ebene organotypischen Modelle der menschlichen Haut angewendet wurden. Als die Infektionsrate in diesen Floßkulturen beschränkt ist, nur eine begrenzte Anzahl von Studien, die Infektion, die Virusausbreitung und die Auswirkungen der antiviralen Komponenten veröffentlicht ^3-6.

Um zelluläre Determinanten, die während der HSV-1-Infektion in der intakten Epithels eine Rolle spielen, zu charakterisieren, haben wir ein Protokoll für die Ex-vivo-Infektionsstudien von murinen Epidermis ^7. Haut von Neugeborenen oder von den Schwänzen von erwachsenen Mäusen hergestellt. Da HSV-1 kann er die vollständige Hautproben, die in virushaltige Medium eingetaucht wurden nicht infizieren, die Epidermis von der Dermis getrennt wir durch Behandlung Dispase II. Nach dem Schwimmen der epidermalen Schichten auf virushaltige Medium kann infizierte Zellen in der epidermalen Basalschicht zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion (pi) ⁷ visualisiert werden. Um die Einleitung der Infektion in einzelnen Zellen vor der viralen Replikation eine Visualisierungnd Virusproduktion, gebeizt wir mit einem Antikörper gegen die infizierten Zellprotein 0 (ICP0), die eine der ersten Proteine ​​während der HSV-1-Infektion exprimiert wird. Die zelluläre Lokalisation von ICP0 durchläuft verschiedene Phasen während der frühen Infektion. Während ICP0 ist in Kern Foci vorliegenden während einer frühen Phase der viralen Genexpression, Relokalisierung ICP0 zum Zytoplasma zeigt eine spätere Phase der Infektion ^8.

Wir nutzten die Ex-vivo-Infektionsassay der epidermalen Schichten aus verschiedenen Mausmodellen, um die mögliche Rolle der verschiedenen zellulären Faktoren während der Infektion zu testen. Um die Auswirkungen von Rac1 als Schlüsselregulator der Aktindynamik adressieren, infizierten wir die Epidermis von Mäusen mit einem Keratinozyt-spezifische Deletion des Gens rac1 ^9. Dieses Modell erlaubt es, die Auswirkungen der mangel Rac1 auf den Wirkungsgrad der HSV-1-Infektion in epidermalen Keratinozyten Schichten zu studieren. Der Vergleich zu infizierten Epidermis der Steuerwurfwiedervealed keinen signifikanten Unterschied, was anzeigt, dass die Abwesenheit von Rac1 hatte keine Wirkung auf die Einleitung der Infektion in der Basalschicht der Epidermis ^7. Die Verwendung weiterer Mausmodellen konnten wir Adresse, die zellulären Rezeptoren vermitteln den Eintritt in die Epidermis. Infizieren epidermalen Schichten entweder Nectin-1- oder HVEM-defizienten Mäusen mit HSV-1 zeigte, dass das anfängliche Eindringen des Virus in Gewebe hängt stark von der Gegenwart von Nectin-1 ^10. Darüber hinaus sind unsere Ergebnisse zeigen, dass HVEM auch als Rezeptor in murine Epidermis weniger effizient zu bedienen, auch wenn als Nectin-1 ^10.

Um die räumliche Verteilung der infizierten Zellen in den Schichten der Epidermis zu adressieren visualisieren wir ICP0 Expression in Gewebeschnitten und epidermalen Gesamtpräparate (Abbildung 1). In Kryoschnitten von kompletten Haut, werden keine ICP0-exprimierenden Zellen detektiert (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu Kryoschnitte der epidermalen Schichten zeigen zytoplasmatischenICP0 Ausdruck in der basalen Schicht bereits nach 3 Stunden pi (Abbildung 1). Zu späteren Zeitpunkten, virale Verbreitung in Schichten suprabasale visualisiert werden. Die räumliche Verteilung der infizierten Zellen in der Basalschicht leicht in epidermalen Gesamtpräparate (Figur 1) folgen. Bei der Infektion mit HSV-1 mit 100 PFU / Zelle wurden etwa 50% der basalen Keratinozyten in der Epidermis zeigen interfollikuläre ICP0 Expression bei 1,5 hr pi Zu diesem Zeitpunkt die meisten infizierten Zellen exprimieren Kern ICP0. Die Relokalisierung ICP0 in das Cytoplasma, das einen späteren Stadium der frühen Genexpression ist in nahezu allen Zellen in 3 h pi (Figur 1) vorhanden ist. Diese Modi auf ex vivo HSV-1-Infektion zu visualisieren infizierten Zellen über eine starke Assay zur Bestimmung der Wirkung von Inhibitoren oder gelöschter / mutierten zellulären Komponenten auf die virale Eintritt und die Ausbreitung im Gewebe zu untersuchen.

Protokoll

Ethik-Anweisung.

Die Herstellung von epidermalen Schichten von geopferten Tiere erfolgt in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Führer von Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen (Deutschland) durchgeführt. Die Studie wurde von LANUV NRW (Anzahl 8.84-02.05.20.13.018) zugelassen.

1. Vorbereitung der Instrumente und Kultur Medien

1. Kulti epidermalen Schichten in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) / Hoch Glucose enthaltenden Glutamindipeptid, 10% FCS, 100 IE / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (nachstehend als "DMEM" bezeichnet).
2. Zur Herstellung von epidermalen Schichten sorgfältig aufzulösen Dispase II-Pulver (5 mg / ml) in PBS erhitzt (bis zu 37 ° C). Die Lösung wird durch ein 0,22 um Filter und ihn direkt für die Behandlung.
3. Für die Herstellung der gesamten epidermalen Halterungen ^13, bereiten blockiert Buffer mit 0,5% Milchpulver, 0,25% Gelatine aus Kaltwasserfischen Haut und 0,5% Triton X-100 in TBS. Substanzen ermöglichen, durch Inkubieren des Gemisches für mindestens 2 h bei RT auf einem Rotationsmischer aufzulösen. Bereiten auch 0,2% Tween 20 in PBS als Waschpuffer. Zur Fixierung vorzubereiten 3,4% und 4% Formaldehyd in PBS.
4. Für die Immunfärbung von Gefrierschnitten, bereiten Blockierungspuffer mit 5% normalem Ziegenserum und 0,2% Tween 20 in PBS. Zur Fixierung, bereiten 0,5% Formaldehyd in PBS.

2. Herstellung der epidermalen Schichten von Mäusehaut

1. Vorbereitung der Epidermis von Neugeborenen Rückenhaut für Infektionsstudien
   1. Legen Sie eine enthauptete Maus (1 bis 3 Tage nach der Geburt) in eine Dissektion Gericht und abgeschnitten Extremitäten und der Schwanz in der Nähe des Oberkörper, um eine effiziente Entfernung der Haut von der komplette Oberkörper zu ermöglichen. Während der Entfernung der Extremitäten, versuchen, die Einschnitte so klein wie möglich im Durchmesser zu halten.
   2. Befestigen Sie den Oberkörper mit gekrümmten feinen Pinzette einnd sanft bewegen stumpfe Spitze Schere unter der Haut von kranial nach kaudal entlang der Rückseite, um die Haut vom Rumpf zu trennen. Slit die Haut entlang der Rückseite.
   3. Für die FACS-Analyse, Isolierung von Keratinozyten oder die Zubereitung von RNA, ziehen Sie die komplette Haut vor den Oberkörper mit einer Pinzette, um das Gewebe und die stumpfe Spitze Schere zu beheben, um den Oberkörper abstoßen. Für die Herstellung von Gefrierschnitten oder ganzen Halterungen nehmen Sie nur Teile der Rückenhaut.
   4. Hacken Sie die Rückenhaut mit einem Skalpell in 1-2 Stücke von ca. 10 x 10 mm. Setzen Sie die Stücke in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit ~ 1 ml sterilem PBS. Stellen Sie sicher, dass die dermale Seite der Bodenflächen.
   5. Ersetzen PBS mit 1,5 ml Dispase II (5 mg / ml PBS) und Inkubation für entweder 30 min bei 37 ° C (für Gesamtpräparate) oder O / N bei 4 ° C. Mit PBS waschen 3 Mal. Entfernen Sie vorsichtig die Epidermis als intaktes Blatt mit einer Pinzette, um die darunter liegenden Dermis und die anderen Pinzette zu beheben, um die Epidermis zu heben. Verwenden Sie ein Fernglas, um diesen Schritt zu machen easy. Übertragen Sie die epidermale Schicht in DMEM mit seinen basalen Seite nach unten. Verwenden Sie die Blätter sofort für Infektionsversuche.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Vorbereitung der Epidermis von Neugeborenen Haut vor allem für die FACS-Analyse, Isolierung von Keratinozyten oder die Zubereitung von RNA. Wegen ihrer Zerbrechlichkeit, ist die Herstellung von infizierten Platten für Kryoschnitte oder Gesamtpräparate weniger geeignet.
2. Vorbereitung der Epidermis von Erwachsenen Schwanzhaut für Infektionsstudien
   1. Euthanize die Mäuse im Alter von 1-3 Monaten durch zervikale Dislokation. Nehmen Schwanz statt Rückenhaut, da die lang eingebettet Haarfollikel auf der Rückseite beeinträchtigen Trennung von intakten epidermalen Schichten. Schneiden Sie den Schwanz von Mäusen geopfert und schlitzte es der Länge nach mit einem Skalpell.
   2. Ziehen Sie weg der Haut vom Knochen und hacken sie mit einem Skalpell in Stücke von etwa 5 x 5 mm. Legen Sie bis zu 4 Stück in einem gut und fahren Sie mit der Inkubation in Dispase II wie unter 2.1.5 beschrieben,
      HINWEIS: Verwenden Sie für Erwachsene tail Haut zu Gefrierschnitten oder ganzen Lager vorzubereiten. Alternativ zur unmittelbaren Verwendung kann Schwänzen gelagert oder für etwa 24 h bei 4 ° C, ohne signifikante Infektionseffizienz transportiert werden. Wenn Schwänze sind bis zu 48 Stunden aufbewahrt, könnte epidermalen Schichten kaum mit HSV-1 infiziert.
3. Dissoziation der Epidermis für die FACS-Analyse
   Hinweis: Der Nachweis von Oberflächenprotein-Expression durch FACS-Analyse erfordert geeignete Zelldissoziation Techniken, die nicht die Zelloberfläche und das Protein von Interesse schaden.
   1. Inkubieren neugeborenen epidermalen Schichten in einer 6-Well-Platte mit der basalen Seite auf 1,5 ml / well rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung für 15 min bei RT und 15 Minuten bei 37 ° C.
   2. Stoppen Sie die Inkubation durch Zugabe von 3 ml DMEM. Distanzieren Keratinozyten unter Verwendung einer gekrümmten feinen Pinzette vorsichtig bewegen die Epidermis in der 6-Well-Platte, so dass die Keratinozyten erhalten gelöst. Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie diesen Schritt 3 malimmer mit frischem DMEM.
      Hinweis: Diese Dissoziation Verfahren ist angebracht, Nectin-1 auf der Oberfläche der Keratinozyten zu erkennen.
   3. Alternativ inkubiere die epidermalen Blätter auf enzymfreien Zelldissoziationslösung (CDS) für 15 min bei RT und 15 Minuten bei 37 ° C. Inkubieren Sie weitere 15 min bei RT, um sanft spülen die Keratinozyten durch Pipettieren von CDS auf und ab.
   4. Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie den Spülvorgang 3 mal mit frischem DMEM.
      Hinweis: Diese Dissoziation ist geeignet, um die Oberflächenexpression von HVEM zu erkennen. Der Nachteil der CDS-Lösung ist, dass weniger Zellen als bei rekombinante Trypsin-basierten Zelldissoziationslösung dissoziiert. Zusätzlich zur Oberflächen nach Dissoziation der infizierten epidermalen Schichten mit rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung Expression kann nukleare oder cytoplasmatische Expression wie ICP0-Expression durch FACS analysiert werden.
4. Dissoziation von Epidermis-Keratinozyten oder ex isolierenRNA-Darm-Trakt
   1. Gesetzt neugeborenen epidermalen Schichten in einer 6-Well-Platte mit der basalen Seite in Richtung der Unterseite der Schale, die 1,5 ml / well rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung enthält. Inkubation für 30 min bei RT. In 3 ml DMEM und distanzieren Keratinozyten unter Verwendung einer gekrümmten feinen Pinzette vorsichtig bewegen die Epidermis in die Schüssel.
   2. Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal mit frischem DMEM. Verwenden Sie diese Zellsuspension in RNA oder zur Kultur primären murinen Keratinozyten zu extrahieren.

3. Die Infektion von epidermalen Schichten mit HSV-1

1. Es wird eine Lösung von HSV-1 Stamm 17 Gew ^{11 in} nicht weniger als 500 & mgr; l DMEM-Medium ersetzt und die durch die Viruslösung auf dem die epidermalen Schichten schwimmen. Dieser Zeitpunkt wird als Zeitpunkt 0 ¹² definiert. Führen Infektion eines epidermalen Schicht in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen bei 37 ° C. Die Berechnung der Virustiter über die geschätzte Anzahl basierendvon Zellen in der Basalschicht pro epidermale Schicht (etwa 2 x ¹⁰ 5 Zellen pro 5 x 5 mm Blech).
2. Infizieren mit HSV-1 mit ungefähr 100 Plaque-bildende Einheiten (PFU) / Zelle und ersetzen das virushaltige Medium durch DMEM bei 1 h pi
   HINWEIS: Bei epidermalen Schichten von Neugeborenen Haut, bedenken Sie, dass Blätter beginnen, während der Inkubation zu distanzieren.

4. Visualisierung der infizierten Zellen

1. Epidermal Whole Halterungen ¹³
   1. Fix epidermalen Schichten mit 3,4% Formaldehyd entweder für 2 h bei RT und O / N bei 4 ° C. Zwei Mal mit PBS waschen und blockieren mit 0,5% Milchpulver, 0,25% Gelatine aus Kaltwasserfischen Haut und 0,5% Triton X-100 in TBS 1 h bei RT ^14.
   2. Inkubieren Sie die Platten O / N mit Maus-Anti-ICP0 (monoklonaler Antikörper 11060) ¹⁵ verdünnt 1:60 in Blocking-Puffer bei RT. Um die Intermediärfilament Netzwerk visualisieren inkubieren gleichzeitig mit polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus Keratin 14 (100 ng / ml).
   3. Während 4 Stunden bei Raumtemperatur mit PBS-0,2% Tween 20 waschen 4-5 mal. Inkubieren O / N mit AF488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (1 ug / ml), AF555-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG (1 ug / ml) und DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol) (100 ng / ml) in Blockierpuffer bei Raumtemperatur.
   4. Waschen mit PBS-0,2% Tween 20 für 4 h bei RT. Berg epidermalen Schichten mit ihren basalen Seite auf einem Objektträger, einbetten in fluoreszierende Einschlussmittel geben und mit Deckgläschen.
2. Epidermal Kryoschnitte
   1. Erwachsenen epidermalen Schichten wurden in 4% Formaldehyd in PBS für 20 min bei RT fixiert und 2 mal mit PBS gewaschen. Einbetten festen Blätter in Gewebegefriermedium und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Geschnitten 8-10 um-Schnitte mit einer Kryomikrotom.
   2. Befestigen Sie die Profile wieder mit 0,5% Formaldehyd in PBS für 10 min bei RT, wäscht 2 mal mit PBS, Block mit 5% normalem Ziegenserum und 0,2% Tween 20 in PBS für 30 min bei RT und dann für 60 min mit m FleckOUSE Anti ICP0 (monoklonaler Antikörper 11060) ¹⁵ verdünnt 1:60 in Blocking-Puffer, gefolgt von 3 Mal Waschen mit dem Blockierungspuffer.
   3. Dann Inkubieren mit AF488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (1 ug / ml) und DAPI (100 ng / ml) in Blockierungspuffer für 45 Minuten bei RT und 3 x waschen. Betten Sie Abschnitte in fluoreszierende Einschlussmittel geben und mit Deckgläschen.

Ergebnisse

Die Aufgabe des Verfahrens ist es, epidermalen Blätter in dem HSV-1 kann von der basalen Schicht eindringen vorzubereiten. Der entscheidende Schritt ist die Trennung der Epidermis von der Dermis durch Dispase II-Behandlung, die in Abhängigkeit von der Mausstamm, angepasst werden muss. Die Konzentration von Dispase II kann 2,5 bis 5 mg / ml, und die Zeit der Inkubation von 20 bis 45 min liegen. Die Färbung der Intermediärfilamente Protein Keratin 14 ermöglicht leicht vorherzusagen, ob der basalen Epidermis infiziert...

Diskussion

Wenn epidermalen Schichten der Haut von Erwachsenen aus C57BL / 6 sind mit HSV-1 infiziert bei etwa 100 PFU / Zelle beobachten wir Infektion in fast allen Zellen der Basalschicht der interfollikuläre Epidermis während geringere Virusdosen korrelieren mit weniger infizierten Zellen und einer langsameren Fortschritt der Infektion. Im allgemeinen Haarfollikel zeigen eine variable Anzahl von infizierten Zellen; während die meisten der eher klein Keratinozyten säumen die Entwicklung Haarfollikel infiziert sind, wird nur ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX	Life Technologies	31966047	needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder	Roche	4942078001	has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution	Sigma	C5914	needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution	Life Technologies	12563-029	needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin	Bio-Rad	142-2832	needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765	needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)	Covance	PRB-155P	used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-11029	used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-21429	used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml)	Sigma	36670	used to counterstain the nucleus