単離および脳実質細動脈のカニューレ挿入

要約

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

要約

実質細動脈、貫通細動脈および前毛細血管細動脈を含む脳実質細動脈（PAは）、脳実質に軟膜動脈および細動脈やダイビングから分岐高抵抗血管です。個々のPAは実質および内に含まれるニューロンの離散的な円筒形の領土を灌流。これらの細動脈は、局所的に脳の血流の両方グローバル（脳血管自動調節）と（機能性充血）の調節において中心選手です。 PAは神経血管ユニット、脳内の代謝活性への局所血流量と一致し、また、ニューロン、介在ニューロン、アストロサイトを含む構造の一部です。 PAを介した灌流は、直接フィードPAの拡張によって引き起こされる局所灌流の増強に、その特定の地域内のニューロンとニューロンの代謝リードの増加の活動にリンクされています。 PAの調節は、より良好に特徴づけとは異なります軟膜動脈。圧力誘起血管収縮は、PAの中で大きくなり、血管拡張メカニズムが異なります。また、PAは血管周囲神経から外因性の神経支配を受けていない - 神経支配は、アストロサイトのエンドフィートとの接触を介して自然の中で、固有かつ間接的です。このように、軟膜動脈を用いた研究によって蓄積された収縮の調節に関するデータは直接PAの機能を理解するには変換されません。さらに、それは、高血圧や糖尿病などの病理学的状態は、PAの構造と反応性をどのように影響するか未定のまま。この知識のギャップは、部分的にPAの分離とカニュレーションに関連する技術的な問題の結果です。この原稿では、げっ歯類のPAの単離およびカニューレ挿入するためのプロトコルを提示します。さらに、我々は、アゴニスト誘導性の収縮および筋原性反応を含む、これらの細動脈、で行うことができる実験の例を示しています。この原稿の焦点は、PAカニューレ挿入および圧力筋運動記録法、孤立したPAにあるが、Sはまた、生化学的、生物物理学的、分子、およびイメージング研究のために使用することができます。

概要

脳循環を一意中枢ニューロン、エネルギー貯蔵を制限され、酸素圧力と必要な栄養素の供給の変化に結果的に非常に敏感であるた細胞の代謝要求をサポートするように構成されています。特定のタスクが実行されるときに、特定の神経細胞の亜集団がアクティブになると、血管系は、地元の低酸素や栄養素¹の枯渇を防ぐために、灌流の高度に局在化の増加を促進します。これは、アクティブニューロン、アストロサイト、および大脳動脈²から成る、 神経血管カップリングとして知られている機能性充血の一形態であり、そして神経血管ユニットの適切な動作に依存しています。脳実質動脈は、血管、実質を取り囲む貫通し、前毛細血管細動脈の基は、この反応のために集中的に重要であり、神経血管カップリング^3を調査するために、個別に研究するために、次に重要です。

<脳内の異なるニューロン集団を潅流 - （70μmの内径20）高抵抗血管のpクラス= "jove_contentは">実質細動脈は小さいです。表面の軟膜動脈から分岐、実質細動脈は地下微小循環（ 図1）を供給するために、ほぼ^90ᵒ角度で脳実質に浸透します。これらの細動脈は、彼らが毛細血管を保護する最も遠位の平滑筋を含む血管があるように、適切な灌流圧を維持する上で重要な役割を果たしています。表面軟膜の循環とは対照的に、実質細動脈は、担保の枝と吻合を欠き、その結果、脳循環⁴の「ボトルネック」です。その結果、実質細動脈の機能不全は、血管認知障害および（またサイレントまたはラクナストロークとして知られている）小虚血性脳卒中などの脳血管疾患の発展に貢献しています。研究はindicatEその実質細動脈の機能不全は、本態性高血圧^5、慢性ストレス⁶により誘導され、および小血管疾患の遺伝的マウスモデル⁷の初期事象であることができます。ラットにおける単一貫通動脈のさらなる実験的に誘発される閉塞は、古い人間⁸で観察される円筒形状で、類似している小さな虚血性脳卒中を引き起こすのに十分です。

これらの解剖学的な違いに加えて、収縮機能を調節するメカニズムは軟膜動脈および実質細動脈の間で異なります。筋原性血管収縮はおそらく外因性神経支配¹⁰の欠如、メカノ¹¹の別個のモード、および細胞内Caの違いにより、実質細動脈⁹に大きい²⁺血管平滑筋細胞における^12,13に信号^を送ります。証拠は、内皮依存性血管拡張剤機構はまた、これらの間で異なることを示唆しているvascuカルシウムが関与するメカニズムのより大きな信頼を示す実質動脈²⁺活性化K ⁺チャネルおよびそのような一酸化窒素とプロスタサイクリン¹⁴などの拡散性因子と比較して血管壁内の電気緊張通信とLARセグメント。したがって、軟膜動脈を用いた実験で収集したデータは必ずしも脳かん流の局所制御の知識のギャップを残して、実質細動脈には適用されない場合があります。

その重要性にもかかわらず、実質細動脈は、主として分離とex vivoでの研究のための実装と技術的な課題に、大幅に下に研究されています。この原稿では、隔離し、圧力筋運動記録法に使用することができ、または免疫標識、電気生理学、分子生物学、および生化学的解析のための組織を分離するためにどの、脳実質細動脈にカニューレを挿入する方法について説明します。

プロトコル

1.カニューレと商工会議所の準備

1. きれいなホウケイ酸ガラスキャピラリーを挿入（外径：1.2ミリメートル;内径：0.69ミリメートル、長さ10mm）白金フィラメント（直径：100ミクロン）でピペットプラーの溝に。
2. 適切な設定を使用して、マイクロピペットプラーを使用して、長い、細い先端（ 図2）とのカニューレを生成するために、キャピラリを引き出します。使用される設定は次のとおりです。熱 - 700、プル - 100、速度 - 50、時間 - 10。
3. 圧力ミオグラフ室のホルダーにカニューレを挿入します。適切にカニューレを合わせます。
4. 慎重に所望の直径に解剖顕微鏡下でピンセットを使用して、カニューレの先端を破ります。ここでは、10μmの先端部（ 図2）とのカニューレを示します。
5. 1.8 mMののCa ^2+を含む人工脳脊髄液（aCSFの）との両方のカニューレを埋めます。 1％ウシ血清を補充し^た Ca ²⁺フリーのaCSFのでチャンバーを埋めますアルブミン（BSA）+ 10μMジルチアゼム（すべてのソリューションは、実験の開始前に、新たに調製されるべきです）。チャンバの大きさに応じて、5〜20 mlのaCSFの量を変化させます。カニュレーションを開始する準備ができるまで^4ᵒCで室内に保管してください。
   注：ジルチアゼムは、細動脈の拡張を引き起こすであろう可逆L型電位依存性カルシウム阻害剤である挿管を容易にします

実質細動脈の2の単離

1. 金融機関の動物管理委員会によって承認された実験室での標準プロトコルを使用して、直前の解剖に動物を安楽死させます。他の一般的に使用される麻酔薬は、脳循環¹⁵における血管拡張作用を有することができるようにバルビツレートまたは二酸化炭素の使用が、好ましいです。ここに示されているすべての動物の手順は、医学の大学ネバダ州の学校から施設内動物管理使用委員会により承認され、及びAgであるされています国立衛生研究所「動物の管理と使用における指導原則」とreement。
2. 二酸化炭素を使用して動物を安楽死させます。断頭前に、動物が呼吸を停止し、その足をつまむときに応答しない状態になっていることを確認してください。
3. 鋭いハサミ（マウス）またはギロチン（ラット）を用いて動物を刎ねます。動物の頭から肌を削除し、先端の細いハサミを使用して、正中頭蓋縫合糸に沿って切断。鈍鉗子（マウス）または骨プライヤーを使用すると、慎重に頭蓋骨を削除し、大脳を公開します。ゆっくりと慎重に表面の軟膜動脈を損傷しないように脳を削除してください。氷上で1％のBSAを添加し^た Ca ²⁺フリーのaCSFのの20ミリリットルを充填した容器の中に脳を置きます。
4. 1％BSAを添加し、氷冷のCa2 +フリーaCSFのとパッドを含む解剖皿を記入し、この料理（ 図2A）に上向きに腹面で脳を転送します。 dissecの下に皿を置きますティン顕微鏡（ 図3A）。 27ゲージの針を使用してパッドに脳をピン。中大脳動脈（MCA）の近くにピンを配置しないように注意してください。
5. ウィリスとそれから分岐するMCAのサークルをローカライズ。シャープと整列Vannas春のはさみを使用して、MCAの周囲に小さな長方形をカット。その矩形がMCAの全長を通って渡って5ミリメートルの近くに位置していることを確認します。長方形の上部には、ウィリス（ウィリス動脈輪、 図2Bに近位、矢印）のサークルから分岐点を越えなければなりません。
6. 3ミリメートル - Vannas春のはさみを使用して、約2のための組織の深さにアンダーカットを行います。
   注：この部分は実質細動脈の良好な分離のために重要であり、それは右のそれを得るために、いくつかの試験を取ることができます。カットが深く十分に作られたノートがある場合は、孤立した実質細動脈が短くなります。カットが深すぎる解剖とき、細動脈は、その分岐点で壊れます組織が除去されます。
7. MCAは虫ピンを使用して（ウィリス動脈輪から遠位）上向きと解剖皿に脳切片の最も先端を突き止めます。 （そうしないと、ピンが保持されません）基本となる大脳皮質にあまりにも深く切らないように注意しながら、ピンの近くにPIAをカットする浅い切開を行います。
8. 慎重に小さな鉗子で軟膜の両側をつかみ、皮質から軟膜を剥離開始。必要であれば、周囲の軟膜膜が損傷していないことを確認して、MCAにしがみつきます。
9. MCAを含むPIAは皮質から外れるまで剥がれてください。剥離に対する抵抗がサークルウィリスの近くに増加することに注意してください。長い実質細動脈がこの領域になりますので、この時点では、余分な注意してください。
10. PIAが自由になると、（ 図2B）を下に向けて細動脈を実質とは反対側の面と解剖皿上のパッドの上に慎重に置きます。
11. Vannas春のはさみを使用して、容器の端部が露骨にカットされていることを確認すること、MCAから切り離し細動脈を切り出します。
12. 集めた動脈は、圧力筋運動記録法、分子解析、または天然の平滑筋または内皮細胞の単離のために使用することができます。

3.圧力筋運動記録法

1. 事前に縫合糸を準備します。 5ミリメートル片に濃い緑色のナイロン糸をカットし、ペトリ皿に両面テープの粘着面に置きます。解剖顕微鏡下で、微細な鉗子を使用して、そのフィラメントに各部分を分離し、緩く他にフィラメントを一方の端を通過することにより、簡単なハーフヒッチ結び目を準備します。
2. 鉗子を使用して、あまりにも多くの圧力でそれをつかむしないように確認しながら、両面テープから結び目を選びます。浴溶液の中に縫合糸を引いて、カニューレ上に結び目をスライドさせ、カニューレの先端からの距離でそれを締めます。各カニューレ上の2縫合糸を持っているために、このプロセスを繰り返します。
3. ガラスコート10％のBSA溶液でマイクロピペット、その後、1％BSAを添加し^た Ca ²⁺フリーのaCSFのと過剰を洗い流してください。
4. ガラスマイクロピペット溶液50μlを引き、圧力筋運動記録法室に実質細動脈および転送を引き上げます。ガラスマイクロピペットの内部チャンバに付着することを防止するために、チャンバー内に実質細動脈を分配するために一つの流体運動にプランジャーを押してください。
5. 2超微細鉗子を使用して、PAの内腔を開き、唯一の容器の最後に触れように注意してください。
6. 実質細動脈のエッジを保持するために鉗子を使用して、慎重にカニューレ上に容器を引っ張ります。容器は、カニューレ（ 図3A）の非常に先細の終わりにならないようにカニューレに十分引き出します。
7. カニューレ上の2縫合糸を緩め、容器（ 図3B）でそれらを締めます。スペースの小さな容器に離れて縫合糸、およびtighながら、オペレータに向かってプル10それは。いずれかの分岐が実質細動脈の反対側の端部を閉じる前にオフに結びついていることを確認します。
8. 周り室を回して、盲嚢として実質細動脈の反対側の端部を閉じます。それを達成するために、反対側のカニューレ上の結びつきを開き、細動脈にそれを渡します。ゆっくり実質細動脈をカニューレの側に縛られるように結び目を閉じます。細動脈の長手方向のストレッチをすることは避けてください。 （ 図3C）。
   注：本研究の目的は、内腔を通って薬を灌流する場合、カニューレの側に実質細動脈を結ぶのではなく、反対側の端にカニューレを挿入します。カニューレは、任意の塩の結晶または管腔内の流れを遮断する内部ビルドアップがないことを確認してください。生理学的なレベル内にせん断応力を維持するために適切に流量を調節します。シーズーらの研究は、ラット⁸に細動脈を貫通する内部の流量を示しており、パイのための最初のガイドとして機能することができます多くの研究。
9. 慎重に血管径を記録するために使用される顕微鏡のステージにチャンバーを転送します。正しいチューブに灌流するための温度プローブおよび入口と出口を接続し、顕微鏡ステージ上にチャンバーを取り付けます。 （圧力変換器に接続され、蠕動ポンプ、 など 。水柱）実験室で利用可能な圧力システムを使用して、40 mmHgの管腔内マウス実質動脈圧力またはラット動脈50 mmHgのに動脈を加圧する。 図4Dは、一例を示しています圧力変換器に接続された蠕動ポンプは、カニューレ動脈を加圧します。
10. 直径（ 図3E）の変化を検出するために使用されるシステムの電源をオンにします。可能な限り最高の検出を得るために、このような照明やコントラストのように、顕微鏡の設定を調整します。理想的には細動脈の壁が暗いとルーメン半透明であるべきです。検出が適切になったら、トンの記録を開始彼は実験します。
11. 灌流システムを起動します。 5ミリリットル/分- 3との間の流量で15〜20分間、1.8 mMののCa ²⁺を含む温かい^{（37ᵒC）aCSF}のでカニューレを挿入し、加圧された実質細動脈を洗ってください。このaCSFのは、ジルチアゼムまたはBSAを含むべきではありません。
12. 準備の生存能力を評価するために、60mMのKClをaCSFのと定期的にaCSFを交換してください。 60 mMのKClに対する20％の狭窄 - この時点で、PAは10を示すべきです。細動脈は、その程度に収縮しない場合は、削除して、別の細動脈にカニューレを挿入。
13. 定期的にaCSFで60のKClを洗浄します。 1時間程度かかる可能性が自発的な筋原性緊張の世代まで待ちます。細動脈は、それまでに筋原性緊張を持っていない場合は、別の細動脈と交換してください。
    注：筋原トーンが収縮アゴニストまたは高KCl溶液による刺激なしの血管の内腔直径の漸進的な、そして時にはゆっくりと、減少として観察されます。筋原性緊張は以下のfで計算されますormula：（1 -直径ルーメンパッシブ（アクティブ管腔直径は/））100 ⁵ xは筋原性緊張の適切な量は、治療法、株、種、遺伝子組換えなどに応じて異なる場合があります。 ^30％5 -一般的に、生理学的な筋原性緊張15の範囲です。

4.例の圧力筋運動記録法実験：アゴニスト誘発性狭窄および筋原性反応性

1. 適切な濃度を用いてaCSFの中の選択肢のアゴニストの希釈系列を調製します。現在、例えばトロンボキサンA ₂受容体アゴニストU46619を使用しました。 1mMの濃度でU46619を1mlのストック溶液を調製しました。 100μMのU46619を含む溶液が得られ、薬剤の10倍希釈液を作るためにaCSFの900μLを含む新しい管に1 mMの溶液100μlを移します。濃度 - 応答コンストリクター曲線を作成するために1 mMのから100nmの範囲、6の希釈のために、このプロセスを繰り返します。
2. 加えますaCSFのをsuperfusingの100ミリリットルのアゴニストを含む溶液の全体積（それ以降のすべての用量の900μlのに続いて、最初の投与のための1ミリリットル、）。これは、アゴニストの余分な100倍希釈につながります。このように、10時から午後10μMのバス範囲におけるアゴニストの最終濃度。管腔直径が定常状態に達するまで細動脈は、各濃度で〜10分間インキュベートすることができます。
3. PA径が元の値になるまで任意の薬なしにaCSFでのPAをsuperfusingことにより、アゴニストを洗浄します。最大拡張を誘導し、細動脈の受動的な直径を記録するために、10μMジルチアゼム+ 2mMのEGTAを補充した（BSAなし）のCa ^2+を含まないaCSFの中の実質細動脈をインキュベートします。
4. 慎重にネクタイの端部に保持しながら、それを引き出して、カニューレから実質細動脈を削除します。破片やアゴニストの過剰を除去するために、二重脱イオン水で容器室を洗ってください。 Caでチャンバーを埋めます2+を含まないaCSFの+ BSAおよび他の細動脈にカニューレを挿入。細動脈ごとに複数の実験を行うことは推奨されません。
5. 筋原性反応実験を行うために、（上記の）自発的な筋原性緊張が生成されるまで実質細動脈が40 mmHgの管腔内圧力で平衡化することができます。管腔直径が定常状態に達するまで、10分 - 5 mmHgのに管腔内の圧力を削減し、PAは〜5平衡化することができます。 （20 mmHgの単位で5〜140 mmHgでから例えば）の選択の間隔を使用して管腔内の圧力を段階的に増やします。
6. それが崩壊を引き起こし、したがって、実験の成果を変える、内皮を損傷する可能性があるとして、5 mmHgの下の管腔内の圧力に細動脈を露出させないでください。
7. 圧力曲線の終わりには、ローズから始まる、10μMジルチアゼム+ 2mMのEGTAを補充したのCa（BSAなし^）2+を含まないaCSFのと実質細動脈を表面かん流すると圧力の手順を繰り返しトンの圧力。
   注：これは、式で定義される％筋原性緊張を計算するために必要なPAの受動的直径を、与える：％トーン=（1 - （有効直径/パッシブ直径））×100。

結果

図5Aは、製剤の完全性を評価するために、60mMのKClをaCSFのにマウスPASの代表的な収縮を示します。 60のKClの存在下で30％ - PAは15の間に収縮する必要があります。狭窄が15％未満である場合は、PAを破棄し、それは細動脈の単離およびカニューレ挿入プロセス中に損傷されたことを示唆しているように、別のものにカニューレを挿入。

ディスカッション

脳実質細動脈は、異なるニューロン集団を灌流少数の吻合や支店を持つ高抵抗細動脈です。これらの専門の血管は、星状細胞媒介血管拡張^1を介して脳血管自動調節し、神経血管カップリングの中心的プレーヤーです。脳血管疾患におけるこれらの特殊な血管の重要性は、ミラー博士フィッシャーの先駆的な仕事は、高血圧患者の死後 ¹⁶の脳内にラクナ梗塞の領土内で?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl	Fisher Scientific	S-640
KCl	Fisher Scientific	P217
MgCl Anhydrous	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Isolation/Cannulation
Stereo Microscope	Olympus	SZX7
Super Fine Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Wiretrol 50 μl	VWR Scientific	5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter	VWR Scientific	28145-477
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
Dark Green Nylon Thread	Living Systems Instrumentation	THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump	Living Systems Instrumentation	PS-200
Video Dimension Analyzer	Living Systems Instrumentation	VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software	Living Systems Instrumentation	DAQ-IWORX-404
Heating Unit	Warner Instruments	64-0102
Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B