İzolasyon ve Serebral Parankimal arteriollerin kanülasyonu

Özet

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Özet

parankimal Arteriolleri, delici arteriol ve pre-kapiller Arteriolleri içeren Intraserebral parankimal arteriol (genelge), beyin parankimi içine pial arterler ve arteriol ve dalış dallanma yüksek direnç kan damarları vardır. Bireysel PA parankim ayrı bir silindirik bölge ve içinde bulunan nöronlar serpmek. Bu arteriyollerde yerel serebral kan akımı, hem küresel (serebrovasküler otoregülasyon) ve (fonksiyonel hiperemi) düzenlenmesinde merkezi bir oyuncu vardır. PA nörovasküler biriminde, beyin içinde metabolik aktivite bölgesel kan akımı ile eşleşen bir yapının parçası olan ve aynı zamanda nöronlar, internöronlardan ve astrositler içerir. Pleomorfik adenomun ile perfüzyon doğrudan yem PA genişlemesinden kaynaklanır yerel perfüzyon bir artışlarına söz konusu bölgede nöronlar ve nöronal metabolizma kurşun artışların aktivitesi ile bağlantılıdır. Pleomorfik düzenlenmesi daha iyi karakterize farklıdırpial arterler. Basınç kaynaklı vazokonstriksiyon PA olgularında daha büyüktür ve vazodilatör mekanizmaları değişir. Buna ek olarak, PA perivasküler sinirler dışsal innervasyon almıyorsunuz - innervasyon astrositik endfeet ile temas yoluyla içsel ve doğada dolaylı olduğunu. Böylece, pial arterleri kullanarak çalışmalarla biriken kontraktil düzenlenmesi ile ilgili verileri doğrudan PA işlevini anlamak için anlamına gelmez. Hipertansiyon ve diyabet gibi patolojik durumlar, PA yapısı ve reaktivite nasıl etkilediğini Ayrıca, belirsiz kalır. Bu bilgi boşluğu kısmen PA izolasyon ve kanülasyona ilişkin teknik zorluklar bir sonucudur. Bu yazıda izolasyon ve kemirgen PA olgularının kanülasyon için bir protokol mevcut. Dahası, agonist kaynaklı daralma içi ve kas reaktivitesi de dahil olmak üzere, bu arteriyoller ile yapılabilir deneylerin örnekleri göstermektedir. Bu yazının odak noktası PA kanülasyon ve basınç myography üzerinde olmasına rağmen, PA izoles da biyokimyasal biyofiziksel moleküler ve görüntüleme çalışmaları için kullanılabilir.

Giriş

serebral dolaşım benzersiz merkezi nöronları, enerji depolar sınırlı ve oksijen basıncı ve gerekli besinlerin temini değişimlere dolayısıyla son derece duyarlıdır hücrelerin metabolik taleplerini desteklemek üzere düzenlenmiştir. Özel görevler yapılırken özellikle nöronal alt popülasyonlar aktif hale geldikçe, damarsal yerel hipoksi ve besin ¹ tükenmesi önlemek için perfüzyon oldukça lokalize bir artış teşvik etmektedir. Bu aktif nöronlar, astrositler ve serebral arterlerin ² oluşan nörovasküler kaplin olarak bilinen fonksiyonel hiperemi şeklidir ve nörovasküler ünitenin düzgün çalışması bağlıdır. İntraserebral parankimal Arterioller, kan damarları, parankimal kapsayan delici ve pre-kapiller arteriol bir grup, bu yanıt için merkezi önem taşımaktadır ve nörovasküler kaplin ³ araştırmak amacıyla bunları tek tek incelemek için kritik öneme sahiptir.

parankim arteriol küçüktür. Yüzeyde pial arterlerden dallanma, parankimal arteriol yeraltı mikro dolaşımı (Şekil 1) beslemek için yaklaşık 90 ^ᵒ açıyla beyin parankimi içine nüfuz eder. Bu arteriyollerde onlar kılcal koruyan en uzak düz kas içeren kaplar gibi uygun perfüzyon basıncını muhafaza kritik bir rol oynamaktadır. Yüzey pial dolaşıma aksine, parankimal arteriol teminat şubesi ve anastomoz eksikliği ve dolayısıyla serebral dolaşımın ⁴ "darboğazlar" dir. Sonuç olarak, parankimal arteriollerin disfonksiyonu gibi vasküler kognitif bozukluk ve küçük iskemik inme (aynı zamanda sessiz veya laküner vuruş olarak da bilinir) gibi serebrovasküler hastalıkların gelişimine katkıda bulunur. çalışmalar Indicate bu parankimal arteriyollerinde disfonksiyonu esansiyel hipertansiyon ^5, kronik stres ⁶ tarafından uyarılan ve küçük damar hastalığı, genetik fare modelinde ⁷ erken bir olaydır olabilir. Sıçanlarda bir nüfuz arteriyollerin Bundan başka, deneysel olarak indüklenmiş oklüzyon yaşlı insanlarda ⁸ gözlenenler silindirik, benzer küçük bir iskemik inme neden olmak için yeterli olduğunu.

Bu anatomik farklılıklara ek olarak, kontraktil fonksiyon düzenleyici mekanizmalar Pial arter ve parenkimal arteriyollerin arasında farklılık gösterir. Miyojenik vazokonstriksiyon nedeniyle muhtemelen damar düz kas hücrelerinde ^12,13 sinyalizasyon hücre içi Ca dışsal inervasyon ^10, mechanotransduction ¹¹ farklı modları ve farklılıkların olmaması ²⁺ arasında parankimal arteriyollerde ⁹ daha fazladır. Kanıt endotele bağımlı vazodilatör mekanizmaları da bu vascu arasında farklılık göstermektedirCa ²⁺ içeren mekanizmalar üzerinde daha fazla güven sergileyen parankimal arterler ile lar bölümleri, nitrik oksit ve prostasiklinler ¹⁴ olarak yayılabilir faktörlerle karşılaştırıldığında damar duvarındaki K ⁺ kanalları ve elektrotonik iletişim -etkinleştirilmiş. Bu nedenle, veri serebral perfüzyon yerel kontrolü bilgimizin bir boşluk bırakarak, mutlaka Arteriolleri parenkimal için geçerli olmayabilir pial arterleri kullanarak deneylerde toplandı.

Onların önemine rağmen, parankimal arteriol öncelikle izolasyon ve ex vivo çalışma için montaj teknik zorluklar altında incelenmiş, büyük ölçüde vardır. Bu yazıda izole ve basınç myography için kullanılabilir ya da immunolabeling, elektrofizyoloji, moleküler biyoloji, ve biyokimyasal analiz için doku izole etmek için olan serebral parenkimal arteriyollerin kanülasyonu için bir yöntem tarif eder.

Protokol

1. Kanül ve Odası Hazırlık

1. (Dış çap: 1.2 mm; iç çapı: 0.69 mm, uzunluğu 10 mm), temiz borosilikat cam kılcal takın bir platin filaman (100 um çapında), bir pipet çektirmenin oluklara.
2. Uygun ayarları kullanarak, bir mikropipet çektirmenin kullanarak, uzun ve ince ucu (Şekil 2) ile bir kanül oluşturmak için kılcal çekin. kullanılan ayarlar şunlardır: Isı - 700, Pull - 100, Hız - 50, Zaman - 10.
3. Basınç myograph odasının tutucu içine kanül yerleştirin. uygun kanüller aynı hizaya getirin.
4. Dikkatle istenilen çapa mikroskop altında bir forseps kullanarak kanüller ipuçları bölünürler. Burada, bir 10 um ucu ile bir kanül (Şekil 2) göstermektedir.
5. 1.8 mM Ca2 ⁺ içeren yapay serebrospinal akışkan (CSF) her iki kanüllerin doldurmak; % 1 sığır serumu ile desteklenmiş Ca2 ⁺ içermeyen ACSF bölmeyi doldurmakalbümini (BSA) + 10 uM diltiazem (bütün çözeltiler, deney başlamadan önce taze hazırlanmalıdır). odasının boyutuna bağlı olarak, 5 ila 20 ml arasında aCSF hacmini gösterir. Kanülasyon başlatmak için hazır olana kadar 4 ^ᵒ C odasına saklayın.
   NOT: Diltiazem kanül kolaylaştıran arteriollerin genişlemesine neden olur tersine çevrilebilir bir L-tipi voltaj bağımlı kalsiyum inhibitörü,

Parankimal arteriollerin 2. izolasyonu

1. Kurumun hayvan bakım komitesi tarafından onaylanmış laboratuarda standart protokolleri kullanarak hemen önce diseksiyon hayvan Euthanize. Diğer yaygın olarak kullanılan anestezikler, serebral dolaşım ¹⁵ vazodilatör etkileri olabilir barbitüratlar veya karbon dioksit kullanılması tercih edilmektedir. Burada gösterilen tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Tıp Nevada Okulu Üniversitesi Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış, ve ag geçmiş bulunmaktadır"Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Yol Gösterici İlkeler" Sağlık National Institutes ile reement.
2. Karbondioksit kullanarak hayvan Euthanize. dekapitasyon önce, hayvan nefes durdu ve pençeleri kısma zaman tepkisiz olduğunu olduğundan emin olun.
3. keskin bir makas (fare) ya da giyotin (sıçan) kullanarak hayvan başını kesmek. Hayvanın başının cildi çıkarın ve ince uçlu makas kullanılarak orta hat kafatası sütür boyunca kesilir. künt forseps (fare) ya da kemik Pense kullanarak dikkatli bir şekilde kafatası kemikleri kaldırmak ve beyni maruz kalmaktadır. yavaş ve dikkatli yüzey pial damarlara zarar etmeyecek şekilde beyin çıkarın. Buz üzerinde% 1 BSA ile desteklenmiş Ca2 ⁺ içermeyen aCSF 20 ml dolu bir kap içine beyin yerleştirin.
4. % 1 BSA ile desteklenmiş buz soğukluğunda Ca2 + içermeyen ACSF bir ped ihtiva eden bir diseksiyon çanak doldurun ve çanak (Şekil 2A) için yukarı doğru bakan ventral yüzeyi ile beyin aktarın. Bir dissec altında tabak yerleştirinting mikroskobu (Şekil 3A). 27-gauge iğne kullanılarak pad beyin sabitleyin. orta serebral arter (MCA) yakınlarındaki işaretçilerine yerleştirerek önlemek için dikkatli olun.
5. Willis ve ondan dallanma MCA Çemberi yerelleştirilmesine. Keskin ve hizalanmış Vannas yaylı makas kullanılarak, MCA etrafında küçük bir dikdörtgen kesin. Bu dikdörtgen MCA tüm uzunluğu boyunca genelinde 5 mm yakın olduğundan emin olun. Dikdörtgenin üst kısmı (Willis, Şekil 2B, ok Circle proksimal) Willis poligonu gelen dallanma noktasından öteye olmalıdır.
6. 3 mm - Vannas yaylı makas kullanılarak, yaklaşık 2 için doku derinlemesine bir alttan gerçekleştirin.
   NOT: Bu bölüm parankimal arteriollerin iyi izolasyonu için kritik olduğunu ve doğru almak için birkaç deneme alabilir. kesim yeterince derin yapılmış notu ise, izole parankimal arteriol kısa olacaktır; kesim çok derin ise disseke zaman, arteriol kendi dallanma noktasında kıracakdoku çıkarılır.
7. böcek pimleri kullanarak yukarı (Willis poligonu gelen distalinde) bakan MCA ile diseksiyon çanak içine beyin dilim en uzak ucunu aşağı pin. sığ bir kesi altta yatan serebral korteks (aksi pimleri tutmak olmaz) çok derin kesmek için dikkatli olmak, pin yakın pia kesmek için emin olun.
8. Dikkatle küçük forseps ile pia her tarafında yakala ve korteksten pia soyma başlar. Gerekirse, çevredeki pial zarı hasar olmadığından emin olduktan, MCA üzerinde tutmak.
9. MCA içeren pia korteks serbest kalıncaya kadar soyulması tutun. soyulmaya karşı direnç Çember Willis yakın artacağını unutmayın. uzun parankimal arteriyollerde bu bölgede olacak çünkü, bu noktada ekstra dikkatli olun.
10. Pia ücretsiz sonra, (Şekil 2B) aşağı bakacak şekilde Arteriolleri parenkimal yüzey ile ters diseksiyon çanak pedin üstüne dikkatlice yerleştirin.
11. Vannas yaylı makas kullanarak, geminin uçları açık açık kesilir emin olun, MCA ücretsiz disseke Arteriolleri kesip.
12. Toplanan arteriyoller basınç myography, moleküler analiz, ya da yerli düz kas veya endotel hücrelerinin izolasyonu için de kullanılabilir.

3. Basınç myography

1. Vaktinden önce dikiş hazırlayın. 5 mm parçalar halinde koyu yeşil naylon iplik kesin ve Petri kabı bir çift taraflı bant yapışkan tarafına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, ince forseps kullanarak filamentler içine her parçayı ayrı ve gevşek bir ucunu diğer içine filaman geçirerek basit bir yarı-hitch düğüm hazırlamak.
2. forseps kullanarak, çok fazla basınç ile kapmak için değil emin, çift taraflı bant kapalı bir düğüm seçin. kanül üzerine banyo çözüm, slayt düğüme dikiş çekin ve kanülün ucundan bir mesafede sıkın. Her kanül 2 sütür için bu işlemi tekrarlayın.
3. Bir cam Coat% 10 BSA çözeltisi ile mikropipet ve daha sonra% 1 BSA ile desteklenmiş Ca2 ⁺ içermeyen ACSF aşırı durulayın.
4. Cam mikropipet içine çözeltinin 50 ul çekin bir parankimal arteriolden yukarı çekin ve basınç myography odasına transfer. Cam mikropipet iç odaya yapışmasını önlemek için odasına parankimal arteri dağıtmak için bir sıvı hareket pistonu itin.
5. iki süper ince forseps kullanarak, sadece geminin çok ucunu dokunmaya özen göstererek, PA lümen açın.
6. forseps kullanarak dikkatli bir şekilde kanül üzerine gemi çekme, parankimal arteriyol kenarlarını tutun. Damar kanül (Şekil 3A) çok konik sonunda olmayacak şekilde kanül üzerinde yeterince çekin.
7. Kanül 2 sütür gevşetin ve gemi (Şekil 3B) onları sıkın. Uzay gemi üzerinde ayrı sütür biraz ve operatöre doğru çekin tigh ikenOn onu. herhangi bir dalları parankimal arteriole diğer ucunu kapatmadan önce kapalı bağlı olduğundan emin olun.
8. etrafında odasına dönün ve bir kör-sac olarak parankimal arteriole diğer ucunu kapatın. Bunu başarmak için, ters kanül üzerinde bağları açıp arteriole üzerine geçmektedir. Yavaş yavaş parankimal arteriol kanülün tarafına bağlı olacaktır şekilde düğüm kapatın. arteriole boyuna streç kaçının. (Şekil 3C).
   NOT: Bu çalışmanın amacı, lümen yoluyla ilaç perfüze edilmesi için ise, kanülün tarafına parankimal arteri bağlama yerine ucunu kanüle. kanüller herhangi bir tuz kristalleri veya intraluminal akışını engellemek iç yapı-up yok emin olun. Fizyolojik seviyelerde kesme gerilimi muhafaza etmek için uygun bir şekilde akış hızını düzenler. Shih ve ark. Tarafından yapılan bir çalışmada sıçanlarda ⁸ Arteriolleri delici içinde debileri gösterir ve pi için bir başlangıç ​​rehber olarak hizmet verebilirlot çalışmaları.
9. Dikkatle damar çapı kayıt için kullanılmak üzere mikroskop aşamasına odası aktarın. Doğru tüplere perfüzyon için sıcaklık probu ve giriş ve çıkışları bağlamak, mikroskop sahneye odasına takın. (Bir basınç transdüktörüne bağlanan, peristaltik pompa, vb. Su sütunu) laboratuarda uygun bir basınç sistemi kullanılarak, 40 mm Hg lümen içi bir fare parankimal arteriyollerin için basınç veya sıçan arteriyollerin 50 mmHg arteri zorlar. Şekil 4D bir örneğini göstermektedir bir basınç transdüktörüne bağlı peristaltik pompa kanül arteri basınç uygulamak için.
10. Çapı (Şekil 3E) değişiklikleri tespit etmek için kullanılan sistemi açın. Mümkün olan en iyi algılama elde etmek amacıyla, bu tür aydınlatma ve kontrast gibi mikroskop ayarları ayarlayın. İdeal arteriole duvarları karanlık ve lümen saydam olmalıdır. algılama uygun olduğunda, t kaydetmeye başlamakO deneme.
11. superfusion sistemini başlatın. 5 ml / dak - 3 arasında bir akış hızında 15 ila 20 dakika süreyle 1.8 mM Ca2 ⁺ içeren sıcak (37 ^ᵒ C) ACSF kanüllenmiş, basınçlı parankimal arteri yıkayın. Bu CSF diltiazem ve BSA içermemelidir.
12. hazırlık canlılığı değerlendirmek için 60 mM KCI aCSF düzenli aCSF değiştirin. 60 mM KCI% 20 ​​daralma - Bu noktada PA 10 sergilemelidir. arteriole ölçüde daraltıyor vermezse, kaldırmak ve başka arteri cannulate.
13. Düzenli aCSF ile 60 mM KCl yıkayın. bir saat kadar sürebilir spontan miyojenik ton, üretimi kadar bekleyin. arteriole o zamana kadar miyojenik sesi yoksa, başka bir arteriyol ile değiştirin.
    Not: miyojenik sesi kontraktil agonistleri veya yüksek KCI çözeltisi uyarı olmaksızın kabın lümen çapına kademeli bir ve bazen yavaş azalma olarak görülmektedir. Miyojenik tonu aşağıdaki f hesaplanırormula: (1 - (aktif lümen çapından / pasif lümen çapı)) 100 ⁵ x miyojenik sesi uygun miktarda vb tedaviler, suşlar, türler, transgenik göre değişebilir.. % 30 ⁵ - Genel olarak, fizyolojik miyojenik ton 15 arasında değişmektedir.

4. Örnek Basınç myography deneyler: agonist kaynaklı Daralma andMyogenic reaktivite

1. uygun konsantrasyonlarda ACSF tercih edilen bir agonistin bir seyreltme serisi hazırlanır. Bu örnek için tromboksan _A2 reseptörü agonisti U46619 kullanılmıştır. 1 mM'lik bir konsantrasyonda U46619 1 ml stok çözeltisi elde edilmiştir. Aktarım 100 uM U46619 ihtiva eden bir çözelti elde ilacın 10 kat seyreltme yapmak aCSF 900 ul ihtiva eden yeni bir tüpe 1 mM çözeltisinin 100 ul. Bir konsantrasyon-yanıt konstriktör eğrisi hazırlamak için 1 mM'den 100 nm arasında değişen, 6 dilüsyonları için bu işlemi tekrar edin.
2. EkleaCSF superfusing 100 ml (daha sonraki bütün doz 900 ul ve ardından ilk doz için 1 ml) agonist içeren çözeltinin tüm hacmi. Bu agonistin ilave 100 kat seyreltildikten yol açacaktır. Bu durumda, 10 pM ila 10 uM banyosu aralığında agonist nihai konsantrasyonlar. lümen çapı kararlı duruma ulaşıncaya kadar, arteriol ~ her konsantrasyonda 10 dakika inkübe izin verin.
3. PA çapı özgün değerine geri gelene kadar herhangi bir ilaç vermeden aCSF PAS superfusing ile agonist yıkayın. Maksimum genişlemeyi başlatıcı ve arteriole pasif çapı kaydetmek için 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA ile desteklenmiş (BSA) olmadan Ca ^{2 +} içermeyen aCSF parankimal arteri kuluçkaya yatmaktadır.
4. dikkatlice ilişkilerin ucuna tutarak çekerek kanül parankim arteri çıkarın. artıkları ve agonist fazlasının ayrılması için çift deiyonize su ile damar haznesi yıkayın. Ca odasına doldurun2 + içermeyen aCSF + BSA ve başka bir arteri cannulate. Arteriol başına birden fazla deney yapılması tavsiye edilmez.
5. Bir miyojenik tepkime deneyi gerçekleştirmek için, kendiliğinden miyojenik tonu (yukarıda tarif edilen) oluşturulana kadar parankimal arteriol 40 mmHg lümen içi basınçta dengelenmeye gelmeye bırakın. lümen çapı kararlı duruma ulaşana kadar, 10 dakika - 5 mmHg intraluminal basıncı azaltmak ve PA ~ 5 için gelmesini sağlayınız. (20 mmHg artışlarla 5 140 mmHg örneğin) tercih aralığını kullanarak intraluminal basınç kademeli artırın.
6. Bu nedenle deney sonuçlarını değiştirerek, endotel çökmesine neden olabilir ve zarar verebileceğinden, 5 mmHg'nin altında intraluminal basınç arteri maruz bırakmayın.
7. Basınç eğrisinin sonunda lowes başlayarak 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA ile takviye edilmiş Ca (BSA'sız) ^{2 +} içermeyen ACSF parankimal arteri superfuse ve basınç adımları tekrarlayınt basıncı.
   NOT: Bu formülle belirlenen% myojenik sesi hesaplanması için gerekli olan PA pasif çapları, verecektir:% tonu = (1 - (aktif çap / pasif çap)) x 100.

Sonuçlar

Şekil 5A hazırlık bütünlüğünü değerlendirmek için 60 mM KCI aCSF fare PA olgularının temsili daralmasını gösterir. 60 mM KCI mevcudiyetinde% 30 - PA 15 arasında büzülür gerekir. daralma% 15 altında ise, PA atmak ve arteriole izolasyon ve kanülasyon sırasında zarar gördüğünü anlaşılacağı gibi, başka bir cannulate.

Şekil 5B, superfusing banyosuna tromboksan A <...

Tartışmalar

Serebral parankimal arteriyollerde farklı nöron popülasyonları serpmek birkaç anastomoz ve şubeleri ile yüksek direnç arteriyollerinde vardır. Bu özel kan damarları astrosit aracılı vazodilatasyon ¹ ile serebrovasküler otoregülasyonun ve nörovasküler kaplin merkezi oyuncular. Serebral vasküler hastalık bu özel kan damarlarının önemi Doktor Miller Fisher öncü çalışması hipertansif hastalarda ölüm sonrası ¹⁶ beyinlerinde laküner infarkt topraklarında paranki...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl	Fisher Scientific	S-640
KCl	Fisher Scientific	P217
MgCl Anhydrous	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Isolation/Cannulation
Stereo Microscope	Olympus	SZX7
Super Fine Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Wiretrol 50 μl	VWR Scientific	5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter	VWR Scientific	28145-477
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
Dark Green Nylon Thread	Living Systems Instrumentation	THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump	Living Systems Instrumentation	PS-200
Video Dimension Analyzer	Living Systems Instrumentation	VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software	Living Systems Instrumentation	DAQ-IWORX-404
Heating Unit	Warner Instruments	64-0102
Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B