[オートラジオグラフィー測定<sup&gt; 14</sup&gt; C]中央郵便ストローク痛みに続いてラット脳で-Iodoantipyrine

要約

We present a protocol to measure [¹⁴C]-iodoantipyrine (IAP) uptake and assess the activation of neural substrates that are involved in central post-stroke pain (CPSP) in a rodent model.

要約

Approximately 8% of stroke patients present symptoms of central post-stroke pain (CPSP). CPSP is associated with allodynia and hypersensitivity to nociceptive stimuli. Although some studies have shown that neuropathic pain may involve the dorsolateral prefrontal cortex, rostral anterior cingulate cortex, amygdala, hippocampus, periaqueductal gray, rostral ventromedial medulla, and medial thalamus, the neural substrates and their connections that mediate CPSP remain unclear. [¹⁴C]-Iodoantipyrine (IAP) uptake can be measured to evaluate spontaneously active pain. It can be used to assess the activation of neural substrates that may be involved in CPSP in an animal model. The [¹⁴C]-IAP method in rats is less expensive to perform compared with other brain mapping techniques. The present [¹⁴C]-IAP protocol is used to measure the activation of neural substrates that are involved in CPSP that is induced by lesions of the ventral basal nucleus (VB) of the thalamus in a rodent model.

概要

脳卒中の出血は、神経因性疼痛に苦しむ患者の8％以上で起こることが示されており、中央の脳卒中後疼痛（CPSP）と呼ばれる^。1-3 CPSPそれにより過敏症および異痛症を誘発する、感覚機能不全から生じ得る^。4が、CPSPにおける体性感覚機能障害の病態生理学的メカニズムは不明のまま。例えば、体性感覚の喪失は出血性脳領域の神経求心路遮断に起因します。痛覚過敏は、中央侵害受容ニューロンまたは中枢脱抑制^、5、6しかしCPSP症状に関与している神経基盤は不明のままの過剰興奮によって引き起こされることがあります。いくつかの研究は、背外側前頭前野（DPFC）、吻側前帯状皮質（ACC）、扁桃体、海馬、中脳水道周囲灰白質（PAG）、吻側腹内側髄質、および互いの接続が侵害受容処理を仲介することを示唆している。追加の⁷LY、内側前頭前皮質（のmPFC）-amygdala回路は、疼痛関連の知覚に関与していることが示された。CPSPの病態生理学的メカニズムの⁸データは多様であり、かつCPSPの神経基質の活性化がさらに精査が必要です。

^[14 C] -Iodoantipyrine（IAP）の取り込みは、脳活動とCBFの関係を仮定して、間接的に局所脳血流量（のrCBF）を観察するために使用されます。 ^[14 C] -IAPは、機能的磁気共鳴画像法（fMRI）のように、リアルタイムで脳活動を評価することはできないが、それはいくつかの利点を有します。たとえば^、[14 C] -IAPは自然に測定する病理学的状態の間に、脳のイベントを発生するのに適している^。9また^、[14 C] -IAPの取り込みは麻酔なしで測定されます。また、fMRIの陽電子放出断層撮影（PET）を含む他の画像化方法、より少ないコスト。 ^[14 C] -IAP方法はmeasurinために適切であることが示唆されています視床の腹側基底核（VB）の病変によって誘発されるグラム自発痛（ 例えば ^{、CPSP）。9}

現在のプロトコルは、動物モデルにおける視床のVBの病変によって誘発されるCPSPの神経基盤の関与を評価するための^[14 C] -IAP方法を実行する方法について説明します。技術は、行動と神経細胞レベルでCPSP症状の根底にある病態生理学的メカニズムを決定する方法を提供しています。

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プロトコル

本研究におけるプロトコルは、台湾で中央研究院動物実験からの承認及び利用委員会を受け取りました。

1.動物の準備

1. （ - 400グラム約300）のオスのSprague-Dawleyラットを入手します。食料と水に自由にアクセスして、12時間/ 12時間の明/暗サイクル（午前8:00に点灯）下に - （22°C、湿度50％21）エアコン付きの部屋にラットを維持します。

2.実験方法

1. ラットのすべてが実験前に1週間のために彼らのホームケージ内の環境に適応できるようにします。適応中に、ベースラインを確立するために、フォン・フレイと足底テストを実行します。
2. フォン・フレイテスト
   1. 居住のための30分間のアクリルエンクロージャ（30センチ×30センチ×80センチ）にラットを置きます。
   2. （ノーフィラメント11から20）のvon Freyフィラメントを得る同じ長さを持っていますが、直径を変化させることの範囲を提供するために、100グラム - 2の力の。
   3. ラットの後肢に足引っ込め閾値を評価するために、5分の試行間隔でアクリル板上に網目状のポートを介して後足の中心を刺激するためのvon Freyフィラメントを使用します。最大印加圧力が記録されるまで、ローからハイに、昇順にフィラメントを使用し、最大印加圧力を記録する^。10
   4. ラットは刺激に対する足引っ込め応答を示す場合には、フィラメント数を記録します。最低の刺激に応じて、この裁判で撤退応答を決定します。
   5. 同じラットに連続して3回の合計、すぐに同じ手順を繰り返します。 （グラム）の対応力にフィラメント数を変換した値を平均します。
3. 足底テスト
   1. 居住のための30分間（4つのフレームに分かれて80センチ×30センチ×15センチ）透明プレキシガラス箱にラットを置きます。
   2. infファイルを使用してくださいraredビームは、ガラス板を介して後肢の中心を刺激します。約10秒の平均足引っ込め応答待ち時間を得るために、赤外光の強度を調整します。赤外線光源をオンにし、デジタルソリッドステートタイマを起動するキーを押すことにより、トライアルを実施しています。赤外光の持続時間を操作します。
   3. ラットが足引っ込め応答を示すときに、赤外光の持続時間を記録します。最長の期間は、組織の損傷を避けるために、各試験で20秒を超えてはなりません。連続的な刺激を避けるために、少なくとも5分の試行間間隔を使用してください。
   4. 左右の後足のための3つの臨床試験でテストを繰り返し、各ラットについて各後足の平均を計算します。
4. コラゲナーゼ病変手術
   1. つま先ピンチ応答と発生し、外科的刺激に対する身体的応答の喪失まで4％イソフルランでラットを麻酔。 1.5で麻酔を維持 - 2％isoflur手術の期間ANE。
   2. ℃〜37.5から36.5に体温を維持するための簡単​​な加熱パッドと定位装置にラットを置きます。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目にアイクリームを適用します。
   3. 滅菌電気バリカンで毛を剃る、と頭皮の正中線に沿ってメスでスムーズな切開（約2〜2.5センチメートル）を作ります。摂理のヨウ素と消毒のための75％アルコール溶液を交互に皮膚や頭蓋骨を清掃してください。外科的なフェーズでは、無菌状態を維持するために、すべてのデバイス、ツール、およびワークベンチを滅菌するために75％のアルコールを使用しています。その前に、すべての外科的材料は、蒸気オートクレーブで滅菌する必要があります。
   4. 滅菌手袋や楽器を使用し、視床の（腹側後内側視床核[VPM]および腹側後外側視床核[VPL]を含む）VB以上の電気ドリルで頭蓋骨に小さな穴（直径3mm）をドリル（3.0 -3.5ミリメートルの後方、3.0〜3.5ミリメートル、横）ブレグマ、および頭蓋表面5.5〜5.8ミリメートルの深さにします。
   5. それぞれ通常の生理食塩水または対照群と実験群における4型コラゲナーゼ溶液の0.125 Uの顕微注入する0.5μlを、。
   6. 薬物拡散を可能にするために追加の5分間の代わりに注射針を保管してください。
   7. 頭蓋骨に穴を埋めるために歯科用セメントを使用し、切開部を縫合。縫合切開後、創傷に局所鎮痛剤麻酔薬（リドカイン軟膏）を適用し、ホームケージに戻します。
   8. 彼らは胸骨横臥位を維持し、麻酔から回復するまで暖かく保つまで手術後、単独でプラスチックケージにラットを収容します。
5. 外科回復後の行動試験
   1. 手術からの回復の7日後、セクション2.2およびテストフェーズ2.3の手順を繰り返します。動物の健康と発育状態を監視しながら、4週間以上の行動試験を行います。
   2. 手術後フェーズの対照群と実験群との間に、動物の健康状態（ 例えば 、体重、摂食量、および自由な動き）を監視します。
6. PE-50チューブでカニューレ注入を行います
   1. 4％イソフルランでラットを麻酔し、36.5で体温を維持する - 単純な加熱パッドで37.5°C。
   2. メスで、それぞれ、左肩の腹側部分と胸腔の前肢と交差点の背部の正中線に二つの穴（直径2cmずつ）カット。
   3. 二つの穴の間にはさみで皮膚と筋肉を解離。
   4. 腹穴から外頸静脈にPE-50チューブ（長さ20cm）の一方の端を接続します。背側の穴に同じPE-50チューブの終端に接続し、皮膚に貼り付けます。
   5. PE-50チュービングことを確認するために、頸静脈に生理食塩水を注入するために注射器を使用して、妨害されません。
   6. 切開部を縫合糸、および6ミリグラム/ kgのゲンタマイシン（腹腔内）でラットを注入します。
   7. 20 U / mlのヘパリン生理食塩水の0.1ミリリットル、続いて0.3ミリリットルの0.9％の生理食塩水でチューブを手術後一日おきにフラッシュします。
7. 最終的な行動試験
   1. 一週間ステップ2.6の後、繰り返しは、手術回復後のステップ2.5に比べて安定している、その動作を確認するために、2.2から2.3を繰り返します。
8. 放射性トレーサー注射
   1. 適応のための10分 - 5のための休憩ケージにラットを置きます。
   2. スプリッタを使用して、2つの1ミリリットルのシリンジにPE-50チューブを接続します。生理食塩水で1注射器を記入し^、[14 C] -IAP溶液（0.3容積の125μCiの/キロ- 0.5ミリリットル）で他を記入してください。
   3. 外頚静脈に放射性トレーサーを注入し、そして3 M塩化カリウムで満たされた別の注射器で注射器を交換してください。
   4. 放射性トレーサーのINJ後10秒ectionは、イソフルランの過剰摂取の下で3 M塩化カリウムを注入し、台湾の中央研究院動物実験及び利用委員会のガイドラインに基づいて、標準的な安楽死の方法（50分間の気化器からのすなわち 、イソフルラン）によると、動物を生け贄に捧げます。
   5. 1分後、頭蓋骨を露出させ、残りの筋肉を切り落とします。鉗子を使用して、脳から頭蓋骨の背側表面をはがします。骨鉗子を用いて、頭蓋骨の側面を切り取ります。次に、スパチュラを用いて、脳の腹側表面に沿って嗅球と神経接続を切断し、脳を取り出します。
   6. （約-55℃）ドライアイスとメチルブタンで脳を凍結する最適な切削温度（OCT）化合物を使用してください。冷凍庫に脳組織を保管してください^。11、12
9. 脳スライス
   1. 後脳を下に向けて、ミクロトームで組織を向けます。 20＆に脳をスライスするクライオスタットを使用します＃181;メートルの厚さの切片。
   2. 各スライスの間に240μmの間隔で、-20℃でクライオスタットに顕微鏡スライド上に脳スライスを配置します。
   3. -20℃で3日間露光カセットに顕微鏡スライドと段階的な放射能を持つ5つの標準の濾紙を置きます。脳スライスの順序に従って、上から下に顕微鏡スライドを配置します。最後に、カセットの底にろ紙を置きます^。12
   4. 露光カセットから蛍光体スクリーンを外し、脳切片のための^[14 C] -IAPの取り込みを示すために、蛍光体スクリーンを読み、画像を生成する可変モードイメージャーを使用しています。

3.データ解析

1. ステップ2.9.4の後、統計的パラメトリックマッピング（SPM）およびImageJソフトウェアを使用して画像を調整します。シリアル冠状切片を用いて、すべての画像を再構成します。スムーズで参照ラット脳モデルに応じた画像を正規化します。12、13
2. 定量的評価のために、画素の信号強度を決定するために、ImageJソフトウェアを使用して、脳画像の関心領域（ROI）を測定し、分析のための統計ソフトウェアを使用する^。12、13
3. 異なる脳核の間の接続を調べるため、地域間の相関マトリックス中の放射能比を表示するMATLAB相関解析ソフトウェアを使用し、カラーマップとして行列を可視化します。最後に、ネットワーク分析のためPajekソフトウェアを使用しています^。12、13
4. ベースライン時に偽とCPSPグループに、von Frey試験で足底試験及び機械的な力で耐熱性の持続時間を比較するために、因子のようなグループと数週間で、分散の2×5の双方向混合分析（ANOVA）を使用し、週1 - 5は、グループと脳の領域に応じて放射能比を測定するために、2×31 2ウェイANOVAを使用してください。適切な場合、TukeyのHSD（HSD） 事後試験を行います。カルculateピアソン相関は、偽とCPSPグループ内の選択された脳領域のすべての間で相関を評価するために係数。

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結果

図1Aは、実験的なタイムラインを示しています。ラットを行動試験（ すなわち 、フォン・フレイテストと足底試験）のための偽とCPSP群に割り当てました。実験の最初の日は、ベースラインを務め、およびテストは1週間後に繰り返された - 4.ヘパリン（20 U / mlの、0.1ミリリットル/日）中に注入した週に5 PE-50カテーテル法は、外頸静脈に行きまし?...

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ディスカッション

行動試験では、CPSPグループは、ベースライン時に、von Frey試験における熱痛試験および機械的な力で足引っ込め閾値の削減と1週間展示- 。5.調査結果は先行研究と一致していたが¹⁴

^[14 C] -IAP方法は、異なる脳切片の定量分析のために脳画像のピクセル強度に依存しています。脳画像のデータを評価するために、画素の信号強度を定義しました。 46.​​979 C...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic:
Isoflurane	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
Surgery
homeothermic blanket system	Harvard Apparatus	Model 50–7079	body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 °C.
10 µl micro syringe	Hamilton	80008, Model 1701SN	injected with collagenase
polyethylene-50 tubing	Becton, Dickinson and Company	427411	catheterized into external jugular vein
1 c.c syringe	Terumo Medical Products	SS-01T	injected with 14C-IAP and saline.
saline (Sodium Chloride 0.9 gm)	Taiwan Biotech Co., LTD.	100-130-0201	To flush the tube
Drugs
type 4 collagenase	Sigma	C5138-500MG	0.125 U
Gentamicin	Sigma	G1264-250MG	6 mg/kg
Heparin	Sigma	H9399	20 U/ml; 0.1 ml/day
14C-iodoantipyrine (IAP)	PerkinElmer	NEC712	125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline
Potassium chloride	Merck	1.04936.1000	3 M
Behavior system:
von Frey esthesiometer	Fabrication Enterprises, Inc.	Baseline Tactile Monofilaments 12-1666	mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus
plantar test apparatus	IITC Life Science	IITC 390G Plantar Test	Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.
Brain slice:
Optimal Cutting Temperature compound	Sakura Fintek Inc	4583	embedded the brain
dry ice			frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
methylbutane	Sigma	M32631-1L	frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
Cryostat	Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany	Leica CM1850	Coronal brain slice were sectioned on this machine.
Data analyze
exposure cassettes with a phosphor screen	Amersham Biosciences	20 cm x 25 cm	The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20 °C.
γ-counter	Beckman Coulter	Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter	To measure the radioactivity count of the filter papers.
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	GMI, Inc.	WS-S9410	To read  phosphor screen which was exposed by brain slice
Statistical Parametric Mapping (SPM)	Wellcome Centre for Neuroimaging	version 8	all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij	version 1.46	Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.
Matlab	MathWorks	version 2009b	used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.
Pajek	http://Pajek.imfm.si/	version 3.06	Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.