Misure autoradiografici di [<sup&gt; 14</sup&gt; C] -Iodoantipyrine nel cervello di ratto Dopo centrale post-ictus Pain

Riepilogo

We present a protocol to measure [¹⁴C]-iodoantipyrine (IAP) uptake and assess the activation of neural substrates that are involved in central post-stroke pain (CPSP) in a rodent model.

Abstract

Approximately 8% of stroke patients present symptoms of central post-stroke pain (CPSP). CPSP is associated with allodynia and hypersensitivity to nociceptive stimuli. Although some studies have shown that neuropathic pain may involve the dorsolateral prefrontal cortex, rostral anterior cingulate cortex, amygdala, hippocampus, periaqueductal gray, rostral ventromedial medulla, and medial thalamus, the neural substrates and their connections that mediate CPSP remain unclear. [¹⁴C]-Iodoantipyrine (IAP) uptake can be measured to evaluate spontaneously active pain. It can be used to assess the activation of neural substrates that may be involved in CPSP in an animal model. The [¹⁴C]-IAP method in rats is less expensive to perform compared with other brain mapping techniques. The present [¹⁴C]-IAP protocol is used to measure the activation of neural substrates that are involved in CPSP that is induced by lesions of the ventral basal nucleus (VB) of the thalamus in a rodent model.

Introduzione

Corsa emorragia ha dimostrato di verificarsi in oltre l'8% dei pazienti che soffrono di dolore neuropatico, di cui il dolore post-ictus come centrale (CPSP). ^1-3 CPSP può derivare da una disfunzione somatosensoriale, inducendo in tal modo ipersensibilità e allodinia. ⁴ Tuttavia , i meccanismi fisiopatologici della disfunzione somatosensoriale in CPSP rimangono incerte. Per esempio, la perdita delle sensazioni somatiche risulta da deafferentazione neuronale nella zona emorragica cerebrale. Iperalgesia può essere causato dal ipereccitabilità dei neuroni centrali nocicettivi o disinibizione centrale, ^{5, 6,} ma i substrati neurali che sono coinvolti nei sintomi cpsp rimangono sconosciute. Alcuni studi hanno suggerito che la corteccia dorsolaterale prefrontale (dPFC), rostrale della corteccia cingolata anteriore (ACC), amigdala, ippocampo, grigio periacqueduttale (PAG), midollo rostrale ventromediale, e le loro connessioni con l'altro mediano di elaborazione nocicettivo. ⁷ Ulterioricircuiti -amygdala Ly, corteccia prefrontale mediale (mPFC) hanno dimostrato di essere coinvolto nella percezione del dolore legati. ⁸ I dati sui meccanismi fisiopatologici della CPSP sono diverse, e l'attivazione di substrati neurali in CPSP ha bisogno di un ulteriore esame.

^[14 C] -Iodoantipyrine (IAP) si usa un assorbimento di osservare indirettamente regionale del flusso ematico cerebrale (rCBF), ipotizzando una relazione tra attività cerebrale e CBF. Anche se ^[14C] -IAP non può valutare l'attività cerebrale in tempo reale, come ad esempio con la risonanza magnetica funzionale (fMRI), che ha diversi vantaggi. Ad esempio, ^[14C] -IAP è adatto per misurare spontaneamente si verificano eventi cerebrali durante gli stati patologici. ^9, inoltre, ^[14C] -IAP assorbimento è misurata senza anestesia. Costa anche meno di altri metodi di imaging, tra cui fMRI e la tomografia ad emissione di positroni (PET). Il metodo ^[14 C] -IAP è stato suggerito in modo appropriato per measuring dolore spontaneo (ad esempio, CPSP) che è indotta da lesioni del nucleo basale ventrale (VB) del talamo. ⁹

Il presente Protocollo descrive come eseguire il -IAP metodo di ^[14C] per valutare il coinvolgimento dei substrati neurali di CPSP che è indotta da lesioni della VB del talamo in un modello animale. La tecnica offre un modo di determinare i meccanismi fisiopatologici che sono alla base dei sintomi cpsp a livello comportamentali e neuronali.

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Protocollo

Il protocollo in questo studio ha ricevuto l'approvazione dalla Sinica Istituzionali Animal Care Academia e del Comitato utilizzo a Taiwan.

1. preparati per animali

1. Ottenere ratti maschi Sprague-Dawley (circa 300 - 400 g). Mantenere i ratti in una stanza con aria condizionata (21 - 22 ° C, 50% di umidità) sotto un / ciclo di 12 ore 12 ore di luce / buio (luce accesa alle 8:00 AM) con libero accesso a cibo e acqua.

2. Procedura sperimentale

1. Consentire a tutti i ratti per adattarsi all'ambiente nelle loro gabbie a casa per 1 settimana prima degli esperimenti. Durante l'adattamento, eseguire la von Frey e prove di plantari per stabilire linee di base.
2. von Frey test
   1. Posizionare il ratto in una custodia acrilica (30 cm x 30 cm x 80 cm) per 30 min per abitazione.
   2. Ottenere filamenti von Frey (filamento no 11 -. 20) che hanno la stessa lunghezza ma variando diametri di fornire una gammadelle forze di 2 - 100 g.
   3. Per valutare la soglia paw recesso hindpaw del ratto, utilizzare filamenti von Frey per stimolare centro delle hindpaws tramite una porta a rete sulla piastra acrilica ad intervalli tra le prove 5 min. Per registrare la massima pressione applicata, utilizzare i filamenti in ordine crescente, dal basso verso l'alto, fino a quando viene registrata la massima pressione applicata. ¹⁰
   4. Quando i topi mostrano una risposta zampa di ritiro alla stimolazione, registrare il numero filamento. Determinare la risposta recesso in questo processo secondo stimolo più basso.
   5. Ripetere la stessa procedura immediatamente, per un totale di tre volte consecutive sullo stesso ratto. Convertire il numero filamento nel corrispondente forza (in grammi) e la media dei valori.
3. plantare test
   1. Posizionare il topo in una scatola di plexiglas trasparente (diviso in quattro fotogrammi, 80 centimetri × 30 cm x 15 cm) per 30 minuti per l'abitazione.
   2. Utilizzare un inffascio NOMINALE per stimolare il centro della hindpaw attraverso una lastra di vetro. Regolare l'intensità della luce infrarossa per ottenere una latenza media di risposta zampa il ritiro di circa 10 sec. Effettuare una prova premendo un tasto che accende la sorgente di luce infrarossa e avvia un timer a stato solido digitale. Manipolare la durata del fascio di luce infrarossa.
   3. Registrare la durata della luce infrarossa quando i topi mostrano una risposta paw recesso. La più lunga durata non deve superare i 20 secondi in ogni prova al fine di evitare danni ai tessuti. Utilizzare un intervallo tra le prove di almeno 5 minuti per evitare la stimolazione successiva.
   4. Ripetere il test con tre prove per le hindpaws destra e sinistra, e calcolare la media per ogni hindpaw per ogni ratto.
4. Chirurgia Collagenasi Lesione
   1. Anestetizzare il topo con il 4% isoflurano fino alla perdita della risposta toe-pinch e le risposte somatiche a verificarsi stimoli chirurgici. Mantenere l'anestesia con 1,5-2% isoflurane per la durata dell'intervento.
   2. Posizionare il topo in un dispositivo stereotassico con una semplice piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea a 36,5-37,5 ° C. Applicare crema per gli occhi sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
   3. Accorciare il pelo con un rasoio elettrico sterilizzati, e fare una incisione liscio (circa 2-2,5 cm) con un bisturi lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Pulire la pelle e il cranio con alternanza di provvidenza iodio e soluzione alcolica al 75% per la disinfezione. Durante la fase chirurgica, utilizzare il 75% di alcool per sterilizzare tutti i dispositivi, strumenti, e il banco di lavoro per mantenere condizioni di sterilità. Prima di allora, tutti i materiali chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave a vapore.
   4. Utilizzare i guanti e strumenti sterili, e praticare un piccolo foro (3 mm di diametro) nel cranio con un trapano elettrico su VB (compresi ventrale nucleo postero-talamo [VPM] e ventrale postero nucleo talamo [VPL]) del talamo (3.0 -3.5 mm posteriormente, 3,0-3,5 mm lateralial bregma, e 5,5-5,8 mm di profondità dalla superficie del cranio).
   5. Microinject 0,5 ml di soluzione fisiologica o 0,125 U di tipo 4 soluzione di collagenasi nel controllo e gruppi sperimentali, rispettivamente.
   6. Mantenere l'ago di iniezione in posizione per altri 5 minuti per consentire la diffusione del farmaco.
   7. Utilizzare cemento dentale per riempire il buco nel cranio, e suturare l'incisione. Dopo l'incisione di sutura, applicare le anestetici locali (lidocaina analgesici unguento) per la ferita, e restituirli alla loro gabbie casa.
   8. Dopo l'intervento chirurgico, singolarmente ospitare i ratti in gabbie di plastica fino a quando mantengono decubito sternale, e mantiene caldo fino recuperato da anestesia.
5. Test comportamentali dopo il recupero chirurgico
   1. Dopo 7 giorni di recupero da un intervento chirurgico, ripetere le procedure di cui ai punti 2.2 e 2.3 per la fase di test. Eseguire i test comportamentali per 4 settimane durante il monitoraggio della salute e lo stato di sviluppo degli animali.
   2. Controllare le condizioni sanitarie degli animali (ad esempio, il peso corporeo, quantità di alimentazione, e libera circolazione) tra il controllo e gruppi sperimentali per la fase post-intervento chirurgico.
6. Eseguire la cannula Impianto con PE-50 Tubing
   1. Anestetizzare ratto con isoflurano 4%, e mantenere la temperatura corporea 36,5 - 37,5 ° C con una semplice piastra elettrica.
   2. Con un bisturi, tagliare due fori (cm diametro 2 ciascuno) sulla linea mediana della parte dorsale arti anteriori e intersezione della parte ventrale della spalla sinistra e la cavità toracica, rispettivamente.
   3. Dissociare la pelle e il muscolo con un paio di forbici tra i due fori.
   4. Collegare un'estremità del PE 50 tubi (20 cm di lunghezza) alla vena giugulare esterna attraverso il foro ventrale. Collegare l'estremità terminale dello stesso PE 50 tubi al foro dorsale, e apporre alla pelle.
   5. Utilizzare una siringa per iniettare soluzione fisiologica nella vena giugulare per verificare che il tubo PE 50non sia ostruito.
   6. Suturare l'incisione, e iniettare i topi con 6 mg / kg di gentamicina (per via intraperitoneale).
   7. Lavare il tubo a giorni dopo l'intervento con 0,3 ml di soluzione salina allo 0,9%, seguiti da 0,1 ml di soluzione salina con 20 U / ml di eparina.
7. Finali della prova comportamentale
   1. Una settimana dopo il punto 2.6, ripetere i passaggi 2,2-2,3 per confermare che il comportamento è stabile rispetto al punto 2.5 dopo il recupero chirurgico.
8. iniezione radiotracer
   1. Posizionare il ratto in una gabbia di riposo per 5 - 10 min di adattamento.
   2. Utilizzando uno splitter, il collegamento PE 50 tubi a due 1 ml siringhe. Riempire una siringa con soluzione fisiologica e riempire l'altra con ^[14 C] -IAP soluzione (125 pCi / kg in un volume di 0,3 - 0,5 ml).
   3. Iniettare il radiofarmaco nella vena giugulare esterna, e sostituire la siringa con un'altra siringa piena di cloruro di 3 M di potassio.
   4. Dieci secondi dopo la inj radiofarmacoessione, iniettare cloruro di 3 M di potassio sotto una dose eccessiva di isoflurano, e sacrificare gli animali secondo metodi eutanasia standard (ad esempio, isoflurano da un vaporizzatore per 50 min) sulla base delle linee guida del Sinica Istituzionale Animal Care mondo accademico e Comitato utilizzo in Taiwan.
   5. Dopo 1 minuto, esporre il cranio, e tagliare il muscolo restante. Utilizzando rongeurs, staccarsi la superficie dorsale del cranio dal cervello. Tagliare via i lati del cranio con Rongeurs. Successivamente, utilizzando una spatola, tagliare i bulbi olfattivi e connessioni nervose lungo la superficie ventrale del cervello, e rimuovere il cervello.
   6. Utilizzare mescola ottimale temperatura di taglio (OCT) per congelare il cervello in ghiaccio secco e metilbutano (circa -55 ° C). Conservare il tessuto cerebrale in un congelatore. ^{11, 12}
9. cervello affettare
   1. Orientare il tessuto in un microtomo, con hindbrain rivolto verso il basso. Utilizzare un criostato per tagliare il cervello a 20 &# 181; m sezioni di spessore.
   2. Mettere le fette di cervello su vetrini da microscopio in un criostato a -20 ° C, con un intervallo di 240 micron tra ogni fetta.
   3. Porre i vetrini da microscopio e cinque carte da filtro standard con radioattività classificato in cassette di esposizione per 3 giorni a -20 ° C. Secondo la sequenza delle sezioni di cervello, disporre i vetrini per microscopio da cima a fondo. Infine, posizionare le carte da filtro nel fondo delle cassette. ¹²
   4. Rimuovere lo schermo di fosfori dalle cassette di esposizione, e utilizzare un imager-mode variabile per leggere lo schermo fosforo e generare immagini per mostrare ^[14 C] -IAP assorbimento per le fette di cervello.

Analisi 3. Dati

1. Dopo il punto 2.9.4, regolare le immagini utilizzando Statistical Parametric Mapping (SPM) e il software ImageJ. Ricostruire tutte le immagini utilizzando sezioni coronali di serie. Liscio e normalizzare le immagini secondo un modello di cervello di ratto di riferimento.12, 13
2. Per valutazioni quantitative, misurare la regione-di-interesse (ROI) delle immagini del cervello utilizzando il software ImageJ per determinare l'intensità del segnale dei pixel, e utilizzare il software statistico per l'analisi. ^{12, 13}
3. Per indagare le connessioni tra i diversi nuclei cerebrali, usare MATLAB software di analisi di correlazione per visualizzare il rapporto radioattività in una matrice di correlazione interregionale, e visualizzare le matrici come mappe di colore. Infine, utilizzare il software Pajek per l'analisi di rete. ^{12, 13}
4. Utilizzare 2 × 5 bidirezionale analisi mista della varianza (ANOVA), con il gruppo e settimane come fattori di confrontare la durata della tolleranza al calore nella prova plantare e forza meccanica nel test von Frey nei gruppi sham e cpsp al basale e settimane 1 - 5. Utilizzare un 2 × 31 ANOVA a due vie per misurare il rapporto di radioattività in base al gruppo e la zona del cervello. Se del caso, condurre una differenza significative di Tukey (HSD) test post hoc. Calla correlazione di Pearson colare coefficienti per valutare le correlazioni tra tutte le aree cerebrali selezionate nella farsa e gruppi cpsp.

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Risultati

La figura 1A illustra la timeline sperimentale. I ratti sono stati assegnati alla farsa e gruppi cpsp per i test comportamentali (ad esempio, von Frey prova e plantare test). Il primo giorno dell'esperimento servito come base di riferimento, e le prove sono state ripetute alle settimane 1 - 5. PE-50 cateterizzazione è stata eseguita nella vena giugulare esterna alla settimana 4. L'eparina (20 U / ml, 0,1 ml / giorno) è stato iniettato durante settimane...

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Discussione

Nei test comportamentali, il gruppo CPSP esibito una riduzione della soglia di ritiro zampa nella prova dolore termico e forza meccanica nella prova di von Frey al basale e le settimane 1 -. 5. I risultati erano coerenti con uno studio precedente ¹⁴

Il ^[14 C] metodo -IAP basa sull'intensità del pixel di immagini del cervello per l'analisi quantitativa di diverse sezioni di cervello. Per valutare i dati nelle immagini cerebrali, l'intensità del segnale del ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic:
Isoflurane	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
Surgery
homeothermic blanket system	Harvard Apparatus	Model 50–7079	body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 °C.
10 µl micro syringe	Hamilton	80008, Model 1701SN	injected with collagenase
polyethylene-50 tubing	Becton, Dickinson and Company	427411	catheterized into external jugular vein
1 c.c syringe	Terumo Medical Products	SS-01T	injected with 14C-IAP and saline.
saline (Sodium Chloride 0.9 gm)	Taiwan Biotech Co., LTD.	100-130-0201	To flush the tube
Drugs
type 4 collagenase	Sigma	C5138-500MG	0.125 U
Gentamicin	Sigma	G1264-250MG	6 mg/kg
Heparin	Sigma	H9399	20 U/ml; 0.1 ml/day
14C-iodoantipyrine (IAP)	PerkinElmer	NEC712	125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline
Potassium chloride	Merck	1.04936.1000	3 M
Behavior system:
von Frey esthesiometer	Fabrication Enterprises, Inc.	Baseline Tactile Monofilaments 12-1666	mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus
plantar test apparatus	IITC Life Science	IITC 390G Plantar Test	Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.
Brain slice:
Optimal Cutting Temperature compound	Sakura Fintek Inc	4583	embedded the brain
dry ice			frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
methylbutane	Sigma	M32631-1L	frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
Cryostat	Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany	Leica CM1850	Coronal brain slice were sectioned on this machine.
Data analyze
exposure cassettes with a phosphor screen	Amersham Biosciences	20 cm x 25 cm	The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20 °C.
γ-counter	Beckman Coulter	Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter	To measure the radioactivity count of the filter papers.
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	GMI, Inc.	WS-S9410	To read  phosphor screen which was exposed by brain slice
Statistical Parametric Mapping (SPM)	Wellcome Centre for Neuroimaging	version 8	all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij	version 1.46	Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.
Matlab	MathWorks	version 2009b	used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.
Pajek	http://Pajek.imfm.si/	version 3.06	Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.