血管平滑筋細胞と大動脈石灰化と炎症のイメージングの石灰化

要約

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

要約

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

概要

心血管疾患は、それが毎年78万を超える死者を占める米国をはじめ、世界における罹患率および死亡率の主要な原因である^。1冠動脈石灰化と大動脈石灰化は、アテローム性動脈硬化症の特徴であると心血管イベントのような強力な予測因子を提供します^。2- 、内膜石灰化アテローム性動脈硬化症と関連しており、内側には、慢性腎臓病と糖尿病に関連する石灰化、（もMönckebergとして知られている^）5内膜石灰化は、脂質蓄積とマクロファージの設定で発生します。血管石灰化の⁴つの主なタイプは、成人で報告されています。血管壁への浸潤^。5,6内側側の壁の石灰化は、エラスチン繊維または平滑筋細胞に局在し、脂質沈着やマクロファージの浸潤に関連付けられていない、独立して内膜石灰化の発生。の分子機構に関する研究^5,7,8血管石灰化は、細胞ベースおよび動物モデル系に依存していました。 atherocalcific疾患のための齧歯類モデルは、アポリポタンパク質E（アポ^E）9,10または低密度リポタンパク質受容体（LDLR）中膜石灰化のためのモデルは、行列のGlaタンパク質（MGP）欠損マウスを含むながら^11は 、高脂肪食を与えいずれかを欠損したマウスを含みます¹²またはそれに近い総腎摘出（5/6日の腎摘出モデル）によって、または高アデニン食事療法への曝露のいずれかによって尿毒症を発症ラット^。13

ここでは、MGPの欠損に関連する内側血管石灰化のモデルは、に焦点を当てています。 MGPは、動脈石灰化を阻害し、細胞外タンパク質である。MGP遺伝子における¹²の変異がKeutel症候群、brachytelephalangyに加えて、拡散軟骨石灰化によって特徴づけられるまれなヒト疾患、難聴、および末梢肺動脈狭窄症で同定されている^。14-18ではないが、しばしば観察^、19複数の動脈の同心円状石灰化がKeutel症候群に記載されている。非カルボキシル化、生物学的に不活性なMGPの高い循環レベルは、心血管死亡率を予測しながら、人間のMGP遺伝子における²⁰の一般的な多型は冠動脈石灰化^、21-23リスクの増加と関連している^。24人間とは異なり、 Keutel症候群で、MGP欠損マウスは生後2週間で開始自発的な広範囲の動脈石灰化からなる重度の血管の表現型を開発し、原因大動脈破裂に6-8週間出産後に死亡する^。12

アポEとは異なり^{- / -}およびLDLR ^{- / -}マウスは、高脂肪食を与え、関連マクロファージ誘発性炎症と内膜血管石灰化を開発する、MGP ^{- / - 。}マウスは、マクロファージの浸潤が存在しない状態で内側血管石灰化を開発^11,25が、これらの知見は、intimに異なる根本的な刺激を示唆していますアルと中膜石灰化は、例えば、腫瘍壊死因子αおよびIL-1およびプロ骨形成因子などの炎症性メディエーターを含む血管石灰化に貢献同定されている石灰化^。26、複数のシグナル伝達経路の両方の形式を仲介するシグナル伝達機構で重複がありますこのようなノッチは、Wnt、および骨形成タンパク質（BMP）シグナル^。27,28のように、これらのシグナル伝達経路は、次に、骨関連タンパク質の発現を増加させる転写因子ラント関連転写因子2（Runx2の）及びオステリックスの発現を（増加させます^{- / -}およびLDLR ^{- / -}マウスは、高脂肪食および自発を与え、例えば石灰化を媒介する血管系において、オステオカルシン、スクレロスチン、およびアルカリホスファターゼ^）28-30我々は、他のアポEで観察された血管石灰化のことを実証しましたMGPに観察血管石灰化^{- / -}マウスはすべて、骨形成タンパク質（BMP）SIに依存しますgnaling、それはここに焦点を当てているこの経路である^。11,25,31 BMPは、骨形成のために必要な強力な骨形成因子であり、ヒトのアテローム性動脈硬化症で発現増加を示すことが知られている^。32-34 in vitro試験を調節におけるBMPシグナル伝達を関与していますなどのRunx2などの骨形成因子の発現。BMPリガンドの^35-37過剰発現は、BMP-2は、高脂肪食給餌したApoE欠損マウスにおける血管石灰化の開発を加速^。38また、このようなシグナル伝達阻害剤、特定のBMPの使用を^39,40 LDN-193189（LDN）として、および/ ​​またはALK3-Fcは、両方のLDLR内の血管石灰化の発症を予防する^{- / -}マウスは、高脂肪食とMGP欠損マウスを与え^11,25。

血管平滑筋細胞（VSMC）は、血管石灰化の発展に重要な役割を持っている。MGP欠損マウスに発症^30,41,42内側血管石灰化はCHARACです骨形成表現型へのVSMCの分化転換によってterized。このようなRunx2のおよびオステオポンチンなどの骨形成マーカーの同時上昇とミオカルディンおよびα平​​滑筋アクチンを含むVSMCマーカーの発現低下でMGP結果の損失、。これらの変化は、血管石灰化の発達と一致する^。25,43,44

大動脈石灰化と炎症マウスでは、典型的には、早期の石灰化および骨形成活性のためのアルカリホスファターゼ活性などの組織化学的技術を利用して評価され、後半に石灰化のためのフォン・コッサおよびアリザリンレッド染色、およびマクロファージのタンパク質マーカー（ 例えば 、標的免疫組織化学プロトコル。、CD68、F4 / 80、のMac-1、のMac-2 ^MAC-3）9,45しかし、これらの標準的な画像化技術が原因で、サンプリングの偏りに時間がかかり、不完全である、断面に大動脈組織の処理を必要とし、それらに限定されています炎症とcalcificatを定量する能力全体の大動脈内のイオン。このプロトコルは、ex vivo近赤外蛍光（NIR）分子イメージングを利用した全大動脈および中型動脈石灰化およびマクロファージの蓄積を可視化し、定量化する方法を説明している。また、提供収穫するための方法であるとマウスからの一次大動脈のVSMCを培養し、誘導します血管石灰化の根底にある分子メカニズムを決定するために、マウスおよびインビトロでヒトのVSMCの石灰化。これらの技術は、インビボおよびatherocalcific疾患を研究するためのインビトロ方法で両方で調査員を提供しています。

プロトコル

マウスを用いた研究はすべて国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施しました。住宅この研究で説明したマウスに関連するすべての手続きは、マサチューセッツ総合病院（研究動物管理部会）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。すべての手順は、苦痛を最小限にするために注意して行きました。

試薬の調製

1. 全大動脈の近赤外蛍光イメージング
   注：ビスホスホネート由来、近赤外蛍光イメージングプローブは、ヒドロキシアパタイトに結合することによって、血管系内の骨形成活性をマークするために使用することができる^46,47カテプシン活性化蛍光イメージングプローブは、マクロファージのタンパク質分解とにおける弾性線維溶解性の活性のマーカーとして働くことができます。血管系⁹の両方の蛍光プローブの同時使用を可能にするために、それが重要ですスペクトル的に別個であるプローブを使用しています。表記カルシウムNIRは、カテプシン活性を特異的近赤外蛍光イメージングプローブを示すために、石灰化に固有の近赤外蛍光イメージングプローブおよびカテプシンNIRを示すために使用されます。
   1. カルシウムNIRおよびカテプシンNIRの溶液を調製します。製造業者のプロトコルに従って、カルシウムNIRまたはカテプシンNIRの24ナノモルを含むバイアルに1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の1.2ミリリットルを追加し、軽く振ります。
      注：2〜8℃で暗所に保存した場合、メーカーによると、一度PBSで再構成し、カルシウムNIRおよびカテプシンNIRソリューションは、14日間安定のままです。
2. 単離とマウス大動脈のVSMCの石灰化
   1. 大動脈消化ソリューション：
      1. 175 U / mlの2型コラゲナーゼおよび1.25 U / mlのエラスターゼを含むハンクス液（HBSS）で新鮮な溶液（〜3〜5ミリリットルあたり大動脈収穫）を準備します。液Wを滅菌0.22μmの真空駆動型ろ過システムi番目、使用するまで氷上で解決策を続けます。
   2. セル・メディア：
      1. 10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の500ミリリットル、100単位/ mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシンを補足します。使用前に37℃に媒体を温めます。
   3. 石灰化メディア：
      1. 石灰化培地A（NaPhos;マウス細胞株において使用されます）。
         1. 10％ウシ胎児血清、2 mMリン酸ナトリウム、100単位/ mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシンを含むDMEM（体積適宜）100〜500ミリリットルを補います。使用前に37℃に媒体を温めます。
            
            OR
            
      2. 石灰化メディアB（βGP/ ASC / DEXは、マウスまたはヒト細胞株のいずれかで使用）：
         1. 10％ウシ胎児血清を含むDMEM（体積適宜）100〜500ミリリットルを補足する、10mMのβグリセロリン酸ナトリウム、50μg/ mlのL-アスコルビン酸、10nMのデキサメタゾン、100単位/ mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシン。使用前に37℃に媒体を温めます。

2.尾静脈注射

1. 尾注射の前に、5分間の穏やかな加熱ランプ下でマウスを温めます。
2. チューブげっ歯類ホルダーにマウスを抑えます。アルコール綿棒で尾を消毒します。
3. 尾静脈注射のための30 G針を利用します。尾静脈を横方向に配置されています。
   1. 針が尾内に前進されるように、注射器に前方圧力の穏やかな量を適用します。注射に対する抵抗性がもはや存在したら、静脈がアクセスされていません。
   2. 安定した速度でカルシウムNIR100μlのおよび/またはカテプシンNIRの100μlの容量を注入します。注射の終わりに、5秒の休止の後、針を撤回。
4. 大動脈（セクション3を参照）注射後3-24時間を収穫。

3.マウスの解剖

1. 200ミリグラム/ kgの腹腔内ペントバルビタール注射でマウスを安楽死させます。
2. 解剖ボード上の動物仰向けに置き、ボードに各足をテーピングすることによって安定化させます。解剖顕微鏡と小さなハサミを使用して、上部胸郭に下腹部から延びる正中切開を行います。
3. 鉗子で皮膚をバック剥離し、腹部臓器を明らかにし、腹膜を削除します。大動脈を横断しないように注意しながら、胃腸の臓器を削除します。
4. 前方ダイアフラムの横切開を行い、腹部全体の切開を続けます。解剖ハサミを使用して、リブの側面を切断し、胸骨の上部に軟組織の付着を除去することによって胸郭をリリース。肺を明らかにし、胸郭を削除します。
5. （近位大動脈を識別し、解剖を支援するために）最初に場所で心のままにして、慎重に肺を取り出します。注意して胸腺、気管、食道を外し、ensuri大動脈が無傷のままであることをngの。
6. ストレート細かい鉗子とマイクロ解剖ハサミを使用して、周囲大動脈脂肪（ 図 1A）を取り外す際は細心の注意を払って、大動脈弓に腸骨分岐から大動脈を周囲の軟組織を除去します。残りの脂肪および大動脈弓の大枝周囲の軟組織（ すなわち 、腕頭、総頸動脈と鎖骨下動脈を、 図1B）を取り外します。
   注：蛍光撮影を行うときに脂肪がバックグラウンドシグナルを増加させることができるので、大動脈から脂肪を除去することが重要です。
7. 慎重に近位大動脈からそれを取り外し、胸腔から心臓を取り出し、廃棄してください。腸骨分岐に遠位大動脈を横断。インスリン注射針を使用して、残りの血液細胞を洗い流すために大動脈弓から大動脈への生理食塩水を注入します。それを完全に削除する、大動脈弓の血管に沿って大動脈を切り離し体内から。
8. イメージングのための準備ができるまで氷上に生理食塩水で大動脈を置きます。

4.大動脈イメージング

1. すぐ近赤外蛍光反射イメージングによる収穫後の画像大動脈エキソビボ ²⁵
   1. 製造業者によると²⁵前述のように、カルシウムNIRおよびカテプシンNIR注入マウスの大動脈からの蛍光シグナル強度を定量化するための適切なマルチチャネル波長で蛍光イメージャーを設定し、カルシウムNIRを有する〜650から678 nmの光で励起することができます〜680から700 nmの範囲で最大発光。カテプシンNIRは〜770 nmで最大発光で〜745-750 nmの光で励起することができます。

プライマリマウス大動脈血管平滑筋細胞の単離5.

1. 上記のようにステップ3.1から3.7を実行します。
2. 解剖が完了するまで冷HBSSで大動脈を置きます。慎重に任意のレムを切り取ります唯一の大動脈を残し、大動脈周囲脂肪や軟部組織をaining。
3. 無菌組織培養フードの下で35ミリメートル×、10mmの組織培養皿に大動脈消化溶液に大動脈を転送します。穏やかな断続的に揺り動かしながら30分間、37℃のインキュベーター内に置きます。消化後、大動脈を伸ばしたり擦り切れた外観を呈します。
4. 無傷の中間層を維持しながら解剖顕微鏡および滅菌鉗子で、大動脈の外側の外膜層を除去します。外膜を除去するための一つの技術は、一端に大動脈の外側の層をはがすと靴下のような下層の中間層からそれを削除することですバック剥離して除去することができました。
5. 外膜層を除去した後、2-4時間、5％CO _2、37℃で細胞培養培地とストアと新しい組織培養皿に残っている大動脈を置きます。
6. 無菌フード下で無菌の3ミリメートルの微小解剖ハサミを使用して、幅の広い1〜2ミリメートルに大動脈をカットリング。
7. 大動脈消化ソリューションを使用して新しい組織培養皿の中でこれらのリングを置き、120分間穏やかに振動し、断続的に37℃でインキュベートします。細胞を再懸濁するために、このインキュベーションの間を上下に数回ソリューションをピペット。
8. 消化液に暖かい細胞培養培地の5ミリリットルを追加し、15ミリリットルコニカルチューブに移します。
9. 遠心分離機200×gで5分間チューブ。
10. 細胞培養培地（ 例えば 、5ミリリットル）の所望の体積にメディアを再懸濁細胞を吸引。
11. プレート25cm ²の細胞培養フラスコの各大動脈から単離された細胞の全体の量、5％CO _2、37℃でインキュベートします。インキュベーションの最初の7〜10日の間^、25,48。前述したように、標準的な技術を用いて細胞を増殖させる、メディアごとに72〜96時間を変更します。細胞がコンフルエントに近づくにつれ、より頻繁に（48時間ごと）、メディアを補充。
    注：これは、十分な資格を成長させるために何週間かかる場合があります細胞のntity。
12. コンフルエント後、トリプシンで継代細胞を^37℃に加温すること^。
    1. 各培養フラスコにトリプシン0.5〜1.0 mlを加え3-5分間インキュベートします。表面から細胞を剥離するために、必要に応じて静かにすべての30-60秒フラスコの側面をタップします。
    2. 細胞がフラスコの底から切り離した後、トリプシンで細胞に細胞培地の10ミリリットルを追加します。 5分間、200×gで細胞を遠心。細胞ペレットからメディアおよびトリプシンを吸引。新鮮な細胞培地（ 例えば 5〜10 ml）を所望の量で細胞を再懸濁し、（チャンバースライドに移し、一部の細胞で）新しいフラスコに移します。
13. 細胞の最初の継代において、前述のように、標準的な免疫細胞化学技術を用いて平滑筋細胞系統を確認し^、49α平滑筋アクチンに対する抗体を用いました。

培養平滑筋の6誘導石灰化細胞

1. プレートの細胞を6ウェルフォーマットで5.12から得られます。注：1×10 ⁵細胞/ウェルあたりの細胞培地の2.0ミリリットルの全容量でで開始が推奨されます。
2. 細胞を6ウェルプレートフォーマットで少なくとも7日間石灰化メディアAまたはBで成長することを可能にします。 5％CO ₂で37℃で細胞をインキュベートします_。
3. 細胞培地を48時間ごとに変更します。

7.フォン・コッサ染色法を用いたVSMC石灰化の評価

注：組織または培養細胞の細胞外マトリックスの石灰化を測定するためのフォン・コッサ法は、銀イオンとリン酸塩結合カルシウムイオンの置換に基づいて^50の光及び有機化合物の存在下で、銀イオンが還元され、金属のように可視化されます銀。未反応の銀はチオ硫酸ナトリウムで処理することにより除去し、以下のように、フォン・コッサ染色のための⁵⁰のプロトコルです。

1. セルのCuから培地を吸引ltureプレート。
2. 20分間室温で10％ホルマリンの1ミリリットルでそれらを配置することによって細胞を固定。
3. ホルマリンを削除し、5分間蒸留水で固定した細胞を洗浄します。
4. 1-2時間のための60から100 Wの電球の下で5％硝酸銀溶液1mlで細胞をインキュベートします。
5. 硝酸銀溶液を吸引し、5分間蒸留水で洗浄しました。
6. 5分間蒸留水中の溶液（w / v）の5％チオ硫酸ナトリウム1mlに細胞を配置することによって、未反応の銀を削除します。
7. 5分間蒸留水で細胞を洗浄。繰り返し洗浄を3倍。フォン・コッサ染色は、標準的な倒立光学顕微鏡とイメージングのための準備ができています。
8. オプションの手順：5分間の核ファーストレッドの1ミリリットルとの対比。蒸留水で3回洗浄（5分ごと）でこれに従ってください。

OR

8.近赤外蛍光イメージングでVSMC石灰化の評価

注：その能力と同様にマウスの大動脈内の石灰化を識別するために、カルシウムNIRは容易に培養細胞によって堆積石灰化ミネラルをバインドします。長波長フィルタと、この技術、蛍光顕微鏡およびプレートリーダーを使用して画像をそれぞれ、 インビトロでの石灰化を定量化することができます。カルシウムNIRの長波長の発光は、他の特徴を検出するための低波長発光蛍光体の同時利用が可能になります。次のようにカルシウムNIR染色のためのプロトコルは次のとおりです。

1. 第1.1.1項で説明したように、カルシウムNIRの24ナノモル含むバイアルに1×PBSの1.2ミリリットルを追加します。
2. 適切な石灰化や制御のメディアで100：カルシウムNIRの株式1を希釈します。
3. 培養プレートから吸引細胞培地およびカルシウムNIR含有培地と交換してください。
4. 一晩37℃でカルシウムNIRメディアと培養プレートをインキュベートします。
5. ウェルから培地を吸引除去し、PBSで一回、ウェルを洗浄します。
   注：この時点で、元の培養培地をウェルに添加することができ、細胞が生きて画像化することができます。それ以外の場合は、以下の手順に進んでください。
6. 20分間室温で10％ホルマリンの1ミリリットルでそれらを配置することによって細胞を固定。
7. ホルマリンを削除し、5分間蒸留水で固定した細胞を洗浄します。繰り返し洗浄を3倍。
8. オプションの手順：目的のタンパク質のための免疫蛍光染色または他のcounterstainsを実行します^8,9。
9. 画像または（ 例えば 、カルシウムNIRは、650から678 nmの光で励起することができます）、適切な蛍光励起波長と発光フィルタ（〜680から700 nm）を用いて、カルシウムNIRの汚れを検出。

結果

^{- / -}大動脈MGPにおける石灰化および野生型マウスは、カルシウムNIR蛍光イメージングを用いて測定しました。いいえカルシウムNIR信号は、石灰化が存在しない（ 図2）を示す、野生型マウス由来の大動脈において検出されませんでした。強力なカルシウムNIR信号が高度な血管石灰化と一致しているMGP欠損マウスからの大動脈で検出されました。野?...

ディスカッション

動脈石灰化は、ヒトにおける心血管疾患の重要な危険因子であり、心血管イベントの発症に直接貢献するかもしれない。アテローム性動脈硬化症の薄い線維性キャップで^1,5,52内膜カルシウム沈着は、ローカル生体力学的ストレスを増加させ、に貢献することが提案されていますプラーク破裂。心臓肥大を誘導し、心臓機能に影響を与える可能性動脈硬化を増加させることによって^...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical tube	Falcon	352096
30 G needle	BD	305106
Alpha smooth muscle actin antibody	Sigma	SAB2500963
Chamber slide	Nunc Lab-Tek	154461
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004176
Dexamethasone	Sigma	D4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium	Gibco	14190-144
Elastase	Sigma	E1250
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
Forceps, fine point	Roboz	RS-4972
Forceps, full curve serrated	Roboz	RS-5138
Formalin (10%)	Electron Microscopy Sciences	15740
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
Human coronary artery smooth muscle cells	PromoCell	C-12511
Insulin syringe with needle	Terumo	SS30M2913
L-ascorbic acid	Sigma	A-7506
Micro-dissecting spring scissors (13 mm)	Roboz	RS-5676
Micro-dissecting spring scissors (3 mm)	Roboz	RS-5610
NIR, cathepsin (ProSense-750EX)	Perkin Elmer	NEV10001EX
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX)	Perkin Elmer	NEV10020EX
Normal Saline	Hospira	0409-4888-10
Nuclear fast red	Sigma-Aldrich	N3020
Odyssey Imaging System	Li-Cor	Odyssey 3.0
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-001-CI
Silver nitrate (5%)	Ricca Chemical Company	6828-16
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S-9390
Sodium thiosulfate	Sigma	S-1648
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma	G9422
Tissue culture flask, 25 cm2	Falcon	353108
Tissue culture plate (35 mm x 10 mm)	Falcon	353001
Tissue culture plate, six-well	Falcon	353046
Trypsin	Corning	25-053-CI
Tube rodent holder	Kent Scientific	RSTR551
Vacuum-driven filtration system	Millipore	SCGP00525