ゼブラフィッシュ行動症候群のための大胆、攻撃的、および浅水アッセイ

要約

This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

要約

特定の挙動が異なる状況の下で相互に作用するときの行動症候群が存在します。ゼブラフィッシュは、最近の研究では被験者となっている、適切な分析や解釈を確保するためのプロトコルを標準化することが重要です。私たちの以前の研究では、我々は、1.5 Lの台形タンク内の挙動（表面近くの時間、トランジションでの待ち時間、遷移の数、およびダーツ）のシリーズを監視することによって大胆さを測定しました。同様に、我々は、長方形19 Lタンクに傾斜ミラーの近くに刺され、横方向のディスプレイ、ダーツ、および時間を観察することによって侵略を定量化しました。三分のに76 Lタンクを分割することにより、我々はまた、浅水好みを調べました。浅水アッセイは、高度にカスタマイズアッセイであり、特定の仮説のために調整することができます。しかし、このアッセイのためのプロトコルが標準化され、まだカスタマイズのために十分に柔軟でなければなりません。以前の研究では、末端室は空のいずれかであった、5又は10ゼブラフィッシュ、または5パールdanios（D. albolineatus）を含有しました 。 FOLで牛の鳴き声の原稿は、私たちは詳細なプロトコルおよび行動症候群実験の複製を可能にするプロトコルの成功のアプリケーションを伴う代表的なデータを提示します。

概要

一定の集団から個々の動物内の個別の行動との関連を調査文学の成長体があります。これらの団体は、行動症候群と呼ばれており、測定値は、通常、大胆さ、攻撃性、探索行動、および社交性^1-5が含まれます。行動症候群は、直接的および間接的の両方の理由で価値があります。直接、行動症候群の知識は進化論、人口構造、および人口動態³のより完全なビューを提供することができます。間接的に、行動の関連性についての知識は、このような薬理^6、毒物学^7、行動遺伝学^8,9、および内分泌学¹⁰として行動を定量化するフィールドを通知することができます。そのため、これらの直接的および間接的なメリットの、行動症候群の増加知識は、ゼブラフィッシュのような一般的に使用されるモデル生物では特に貴重です。ゼブラフィッシュを用いた研究が発見された私行動症候群^11-13の分析などの分野の様々な、ナ。行動症候群の研究で知識を進めるために、および他の分野でも仮説検証のための行動の測定値を使用しているため、動作の信頼性と簡潔な説明が有効な分析や解釈や標準化されたプロトコルのために必要とされると、種内間の研究の比較を容易にします。私たちのプロトコルは、ラボ飼育ゼブラフィッシュ¹⁴の集団での大胆さ、攻撃性、浅水行動症候群を測定するために開発されました。ただし、（、個々の魚を追跡し、適切なランダム化を確保し、適切な分析）プロトコルの基本は、簡単に代替行動測定の様々な変更することができます。さらに、大胆さ、攻撃性、または浅水アッセイは、明確な仮説をテストするため、個別に実行することができます。したがって、それは私たちの目標ですしながら行動症候群の研究と成功個々リットル用のプロトコルを実施する方法について説明しますEVEL行動測定は、この手順の各ファセットは、一人で立つことができます。

行動症候群に関する文献は行動症候群を測定するために、人間⁴に節足動物から、いくつかの分類群にまたがると、少なくとも二つの行動の文脈を定量化する必要があります。残念ながら、行動の軸を横切って行動測定を定量化するために使用されるアッセイはほとんど一貫性がしばしばあります。例えば、魚、大胆はT迷路アッセイ、オープンフィールドアッセイ、または新規のまたは外来の刺激¹⁵の導入を用いて測定することができます。魚類の攻撃性の研究はダイアドの相互作用、ビデオ刺激アッセイ、またはクレイモデルアッセイ^12,16,17を伴う可能性があります。同様に、典型的にshoalmate好みの測定を含む浅水挙動の分析は、会合時間^21〜23を決定するために^、さまざまな方法で、タンクの異なるタイプで実行されてもよいです。このプロトコルではOveraのの特定のサブセットLL行動アッセイレパートリーが提示されています。具体的には、このプロトコルは、比較が集団内の全個体間で整合性がとれているかどうかを判断するために、個人内比較を容易にするように大胆さ、攻撃性、および浅水アッセイを通じて個人を追跡するための方法論を提示します。我々は以前の研究^14,18にゼブラフィッシュとコンビクトシクリッド（Amatitlaniaのnigrofasciata）で、このプロトコルを実行した、それは任意の同様のサイズの淡水魚で動作します。

大胆アッセイは、タンクの上部と下部に同じ大きさの領域の輪郭を描く水平線を有する1.5 L台形槽で行われます。定量化された行動は、タンクの上部と下部に、それぞれの部分で費やされた時間の間、試験魚によって遷移の数、ダーツの数、および上部を入力するための待ち時間が含まれます。攻撃性アッセイは含まれ19L、矩形タンク内で行われます3インチ×5インチのミラーは、タンク¹⁹の左下隅に位置する約22度傾斜します。定量化された行動は、特定の攻撃的な指標とともに、ミラー²⁰と相互作用するターゲット魚が費やした時間の合計を含む-刺さ数、横表示され、試験魚とその反射の間にダーツを。これらの特定の指標については、刺さは開いた口と鏡に向かって素早く突進のように定義され、横方向の表示は、ミラーの方向の横、胸、肛門と背側フィンのフレアとして定義され、ダーツがある任意の不安定な動きをされています鏡に向かうありません。最後に、浅水アッセイは三室のタンクの中央室での試験魚の挙動を定量化します。タンクの側室は、空であるか、または魚の「目標浅瀬"を含む、および試験魚は、各側室の近くに費やす時間は^{、21から23を}測定しました。 STRENと呼ばれる単一の複合スコア、浅水のGTH（SOS）は、刺激に対する特定の、各個別の試験魚に対して計算され、下流側^14を分析に使用することができます。すべての行動がJWatcher ²⁴として知られている自由行動定量化ソフトウェアを使用して、単一の視聴者、または複数の視聴者によって採点されます。

行動症候群の存在をテストすることは、主に統計的な努力であり、Budeav 2010年²⁵によって提示されるようなガイドラインに従うことが賢明である。具体的には、中を中心とノルムデータに主成分分析（PCA）を実行することをお勧めします入力は、複数の行動の測定値（ すなわち、大胆さと攻撃性）を持つアッセイにおける個人の行動のベクトルです。相関行列に対して実行PCAは、行動測定の次元を減少させ、したがって、変化の大部分を説明し、最も重要な知識を抽出します。抽出された成分は、その後、BASを解釈することができます関心と回帰スコアの個人の行動のための高い因子負荷上のedは説明コンポーネントに基づいて各個人のために抽出することができます。これらの回帰スコアはその後、SOSの測定と、そのような魚のサイズや性別などの他の種々の非行動の測定値と比較することができます。

このワークフローでは、大胆さと浅水¹⁴との間に存在する性別の特定の行動症候群が発見されたゼブラフィッシュの行動症候群の研究で実装されています。この状況では、大胆なゼブラフィッシュ雄は大きく、より積極的な種（D. albolineatus）に関連付けるする可能性が高いですが、この協会は、女性で失われています。このワークフローはまた、行動症候群は、潜在的に種の行動の可塑性を示し、発見されなかった少年囚人シクリッド親族（Amatitlaniaの^{nigrofasciata）18}の研究で実装されました。したがって、以下のプロトコルがwが提示されています個人レベルの行動症候群を研究の枠組みの中で3つの特定のアッセイ（太さ、攻撃性、および浅水）の性質を描写するという目標i番目。

プロトコル

ゼブラフィッシュのハウジング、ケア、および研究のための以下の方法論は、セントジョセフ大学IACUCによって承認されています。

1.ゼブラフィッシュの住宅とケア

1. 地元のサプライヤーからの、または野生キャッチ集団から被写体のゼブラフィッシュを入手します。ゼブラフィッシュは、ハウジング野生キャッチ集団のために必要とされるIACUCガイドラインおよび追加の許可の対象となる住宅を注意してください。
2. 性別に応じて特定し、独立したゼブラフィッシュ。また、このステップをスキップしたり、研究仮説に基づく分離の異なる方法で交換してください。
   注：セックス特性は、特に女性では、ゼブラフィッシュで決定することは困難です。性別を区別するために、これらのガイドライン¹⁰または有用なオンラインマニュアルを参照してください。
3. ランダムに魚を刺激するために、焦点魚の適切な比率へのさらなる集団を分離します。注：焦点魚を被験者はbehavio一連の続いていますRALアッセイ、および刺激魚は侵略と浅水アッセイにおける刺激室を占有する個人です。
   注：伝統的に、浅水アッセイにおける焦点魚あたりの刺激の魚と1 1〜5：1の刺激：侵略アッセイ^14,17における焦点魚の割合が使用されています。しかし、研究者は、具体的には（ すなわち、適切なランダム化を確実にするために、各アッセイの間で回転させることが焦点魚の行動の一貫性を維持するために一定に保つこと、または魚を刺激すべきである魚を刺激する必要があります）心の中で仮説と研究を設計する必要があります。
4. 厳密12時12明/暗サイクルの下でゼブラフィッシュの住宅ラック内のすべての魚（27.5から28.5°C）で保管してください。非研究日に、すべての毎日の焦点と刺激魚のフレーク食品やブラインシュリンプを毎週フィード。
5. すべてのテストは、概日リズムの影響^26を回避するために、ZT1とZT5（zeitgeber時間）の間に行われていることを確認してください。

2.無作為化とタンクのセットアップ

1. Raは行動アッセイの特定の配列にすべての個人に先験的に ndomize。オンラインランダム・シーケンス発生器²⁷または統計ソフトウェアパッケージ（R）からのランダムシーケンス発生器を使用して、一貫性のあるランダム化方式を設定します。
   1. 1から3までの各アッセイにラベルを付け、一貫性のあるこの割り当てを維持します。各個人にランダム系列を割り当て、行動アッセイラベルに従ってシーケンスをマッピングします。例えば、（攻撃にマップされた大胆にマッピング浅水、2にマッピングされた1、及び3）は、3つの合計アッセイのために、与えられた個人が特定を行うためにそれらを必要とするであろう、「2,3,1」のランダム化配列を有してもよいです指定された順序で行動アッセイ。
2. 不利な外部刺激の可能性を最小限に抑え、タンク全体をキャプチャするビデオカメラのための十分な部屋を持っているようにしてください場所に実験室でのアッセイタンク（太さ、攻撃性、および浅水）を設定します。ビデオカメラがenougていることを確認しますこの位置にビデオカメラをタンクのラベルを表示するだけでなく、焦点魚の微妙な行動を区別することができ、セットアップする時間明快。
3. 記録したカメラを持つすべての行動アッセイは、差動録音の結果として行動得点で意図しない差異を最小化するために指定されたタンクの完全なビューと同じ位置に維持しました。
   注：動きと音がゼブラフィッシュの行動に影響を与えるように重い人身売買の分野で、ドアによってタンクを配置しないでください。
4. 各行動アッセイをスコアリングするためのユニークなJWatcherプロトコル^24を確立^します。収集したデータを要約するキーストロークと焦点解析ファイルに動作を割り当てるために焦点マスターファイルを作成する方法については、JWatcherのマニュアルを参照してください。
   注：JWatcherは、カスタマイズされた信頼性と再現性行動得点²⁴を可能にする行動スコアリングソフトウェアです。
5. 例えば （すべての行動アッセイの日付、魚の数、およびアッセイの数を追跡するためにラベル付けスキームを定義し、12月31日^ST、2015年の「F5-B-123115」を暗示魚5、大胆アッセイ、）とビューとカメラの焦点にテープでタンクの外側にラベルを付けます。保ち、クイックリファレンスと今後の品質管理のための実験ノートにこの情報を記録します。
6. 個人が住宅のラックから削除された後、直接、すべてのアッセイ間で使用されるだけでなく、される順化タンクを設定します。
   注：順化タンクと端末戦車が小さな水槽砂利と（40センチメートルのx 20センチメートル×25センチ）と密接に収納ラックに似ているフィルターです。
7. アッセイが全て完了した後、すべての使用焦点個人のための最終的な目的地タンクとして機能する別の端末タンクに個人を移します。自分たちの生活の残りの個体（ 例えば、25ガロン）のグループを収容するのに十分な大きさのタンクを使用してください。
   注：一貫して同様の水の温度と条件のアクロスを維持することは非常に重要ですsのすべてのタンク。これは、ハウジングと、順化、およびすべてのテストのタンクを備えています。

3.アグレッションアッセイを実施

1. 30センチメートル×15センチ×10センチを測定する19 Lの長方形のタンクに侵略のアッセイを行います。望ましくない外部の刺激を低減するために、閲覧のために露出前部を残して、侵略タンクの三方を囲む外部不透明なパーティション内のタンクを服。 4つの等しい長方形の象限に外部マーキングタンクを分割し、タンクの左端に対して直角三角形を形成する22.5°傾斜左下の象限内に、（シリコーンコーキングで）永久的にミラーを固定します。
2. 順化タンクと侵略タンク内の水の温度は、ハウジングラックの2℃以内であることを確認してください。これを行うには、新鮮な、高齢者の水は侵略タンクに追加する準備ができて27.5から28.5℃に予熱したしました。不当な排除するために、各アッセイの間に水を変更することが重要であることに注意してください嗅覚。
3. それが10分間順応されます別々の馴化タンクに収納ラックから、カッピングにより、焦点魚を移します。
   注：これは、不適切な取り扱いを通して魚に導入された刺激を低減することが重要です。転送個体は、先^27が記載^されています。
   1. 具体的には、手動で、慎重に関心のタンクに小さい、透明なプラスチックカップを置きます。ネットを使用して転送する限り魚を中断することなく、ゆっくりとカップに魚をすくい上げます。
4. ビデオカメラは、攻撃性アッセイタンクは（ステップ3.1参照）焦点が合っていることを確認することにより、すぐにデバイス上の侵略タンク、プレスレコードに個人を転送する前に録音する準備ができていることを確認してください。順化タンクからの侵略タンクにカッピングを介して焦点魚を移します。
   注：これは、前のエントリの正確な時刻を追跡するために侵略タンクに入る魚に記録することが重要です。
5. AGGRを記録しますその後、10分30秒とカップバック順化タンクへの攻撃タンクからの焦点魚用essionタンク。
6. 記録を見ているときに、魚が行動を採点する前に、追加の順応期間としてタンクに導入された後、30秒待ってください。
7. 積極的な行動のために定義されJWatcherスコアリングシステムを使用して、10分間、次の行動を定量化：ミラーの近くに費やした時間を、ミラーアプローチ、ダーツの数、試行さ咬傷（ミラーの方向に口を開ける）の数の数、および横方向の表示数（背、胸、肛門、および尾鰭勃起^）9。
8. アッセイは反復間の高い契約に得点されるまで、少なくとも2倍、単一の攻撃性アッセイをスコア。

4.大胆アッセイを行います

1. 15センチメートル（高さ）×26.5センチメートルトップのx 22.5センチメートル底×6センチ幅を測定する、小型の1.5 Lの台形タンクに大胆アッセイを実施します。すべての側面の周りに不透明な紙を包むOタンクFが、視聴のために露出したフロントを残します。タンクの底部から上部を区別するためにタンクに外部テープの単一の薄片を置きます。
2. 大胆タンク内の水の温度は、ハウジングラックの2℃以内であること（ステップ3.2参照）を確保します
3. 順化タンクに収納ラックから焦点魚を移す（ステップ3.3を参照）、10分間順応させて。
4. ビデオカメラは、デバイスに焦点魚、プレスレコードを転送する準備ができたら、大胆アッセイを記録し、準備ができていることを確認してください。 8分30秒のための大胆タンクやレコードに順化タンクから焦点魚を移します。
5. 記録を見ているときに魚が得点する前にタンクに導入された後、さらに30秒の順応期間を可能にします。
6. JWatcherソフトウェアを使用して、8分間の大胆行動を定量化します。具体的には、以下の行動を定量化：表面近くの時間を、待ち時間はトラの上部​​、番号を入力します上部にnsitions、および不安定な動き（ダーツ）の数^29。
7. アッセイは反復間の高い契約に得点されるまで、少なくとも2倍、単一の大胆アッセイをスコア。

5.浅水アッセイを実施

1. シリコーンコーキング（結果として得られる3つの区画は、2つの刺激ゾーンと1焦点の区画で構成さ）で密閉二枚のガラスの分周器で割った3つの区画を持つ76 Lタンク内の浅水アッセイを行います。外部的には、マーク2優先ゾーンが2体^30を長さの指標で、刺激ゾーン「ガラス分周器のそれぞれから6.35センチメートルを指定します。外部浅水タンクの三辺の周りに不透明なパーティションを適用しますが、閲覧のために露出フロントを残します。
   注：この環境ゾーンは、異なるサイズの種のための特定の仮説をテストするためにカスタマイズすることができます。
2. 試験の性質に応じて、選択刺激群れは、少なくとも12時間befor順応さ電子テストと実験の過程を通して浅水タンク内に残っています。
   注：刺激群れは、焦点魚はこれらの群れの存在下または非存在下でどのように振る舞うかを評価するために使用される個々の魚のコレクションです。異なる刺激浅瀬の組み合わせが多様浅水仮説の数を試験するために選択することができます。刺激群れは側バイアスを回避するために、各刺激のゾーンとの間で回転され、また、試験前に少なくとも12時間順応させることを確認してください。
3. 前述したように順化タンクに焦点魚を移す（ステップ3.3を参照してください）
4. 浅水タンク内の中央コンパートメントに中間順化タンクから、焦点魚をすくうことによって、転送します。
5. 10分のライブスコアの観察期間の10分前の順応期間を可能にします。また、後でJWatcherを使用して、浅水アッセイとスコアを記録。それらは、チャンバ内の優先ゾーン内にあるとき魚は浅水であると判定されますターゲット浅瀬を収容します。
6. 中央のボリュームに費やされた各優先ゾーンと時間に費やされた時間を定量化します。
7. 追加の説明対策として、「浅水の強さ」（SOS）を計算します。大きさはどのくらいの頻度で、個々の魚の群れを説明どこ-1と1の間の値を割り当てます。
8. 浅水域の面積で割った時間を過ごした浅水の比率を計算し、時間の比率を引く浅水と非浅水ゾーンの領域ではない過ごしました。個別に各ゾーンの体積で割った各ゾーンで費やした時間の合計にわたってこの量を置きます。この計算の詳細については、以前の研究¹⁴で見つけることができます。

6.データ品質管理

1. 従来のデータ分析ツール^31-32を使用してデータを分析します。
2. すべての行動のためのノンパラメトリックレーベン検定を用いて分散の均一性のためのテスト。動作は不均質である場合は、ログ変換を実行33。
3. 均質なデータ³⁴にクラスカル・ウォリスANOVAを使用しないシーケンスの影響（ すなわち、ランダム化の順序は個人の行動に影響を与えなかったこと）がないことを確認してください。
4. 固定係数³⁵としてサイドでのSOS指標に単変量一般線形モデルを作成することで、浅水アッセイのための側バイアスがないことを確認してください。
   注：データと無問題へのほとんどがある場合は、下流の分析を行うことができます。問題がある場合は、生物学的にもっともらしい説明で合理化、追加の変換で和解、および/またはサンプルサイズを増加させます。

7.データの分析

1. 両側スピアマンの順位相関を大胆さと攻撃性アッセイ内の別々のすべての行動のために^36を計算^します。
2. 複数のティムを実施した行動アッセイのための一貫性と双方向混合モデルとして内相相関係数（ICC）を計算します与えられた個々の³⁶の電子。この設定では、ICCは、所与のアッセイで挙動魚が複数回測定方法一貫の測定値です。
3. 主成分分析^（PCA）25への入力のために準備するために、すべての行動を中心とnormingによってプリプロセスの大胆さと攻撃性行動。
   注：センタリングとnormingによって測定の前処理は不可欠なステップです。この前処理することなく、複数の周波数とよりで発生ステップの動作は、可変過度に抽出された成分の解釈に影響を与えるであろう。センタリングとnormingのプロセスは、このバイアスを除去します。
4. 大胆さと攻撃性を行動症候群として一緒にリンクされているかどうかを判断するために相関行列とPCAを実行します。 0.6>での重要な各コンポーネントの行動の負荷を解釈します。行動研究のためにPCAを報告するための総合的なガイドのためBudaev 2010 ^24を参照^してください。スクリープロットは、どのeigenve有益になりますctorsは、解釈のために維持されるべきです。
5. このようなRやSPSS ^31,32として統計ソフトウェアパッケージを使用して、各個体の各コンポーネントのスコアを抽出します。スコアは、指定された個人の行動は、特定のコンポーネントによって説明することができるどのくらい表します。
6. 要因回帰スコアと浅水³⁶の強度とのスピアマンの順位相関を計算します。
   注：重要な解釈負荷を持つすべてのコンポーネントは、浅水の強さと相関する場合大胆さと侵略行動が、同じコンポーネントにロードした場合、または行動症候群は存在であると考えられます。また、浅水の強度は、より複雑な行動の定量化（大胆さと攻撃性）のより良い解釈を可能にするためにPCAに含まれていないことに注意してください。 PCAは直角に説明し、これらの複雑な測定に適しています変化量を最大化するために、固有ベクトルに大胆さと攻撃性の機能を崩壊します。通訳固有ベクトルをもたらし、複雑な振る舞い（大胆さと攻撃性）のそれぞれが、より明確に定義されたバイナリ浅水測定にどのように関係するかのはるかに直感的な解釈を与え、それらのそれぞれに浅水測定の強みを退行（ すなわち、魚が浅水されますか）浅水ありません。

結果

試験の性質に応じて、特定のプロトコルの使用は、いくつかの異なる結果は、行動症候群実験が可能です。以下の表と示された数字は、雑誌に掲載された私たちの以前の研究から適応される行動は^、14とジャーナルゼブラフィッシュ^17を処理^します。提案は、（上述のように）、その全体で行う場合、および「アッセイ相関以内'結果、二組?...

ディスカッション

ゼブラフィッシュにおける一貫した大胆さ、攻撃性で団体、および浅水行動があるかどうプロトコルが決定されます。一貫性のある団体は、これらの動作のいずれかの間の所定の集団である場合は、その後の行動症候群が存在しています。人口の自然な行動症候群を研究することによって、研究者はその行動のダイナミックな、人口構造、およびおそらく進化の歴史³のより完全な理?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish Rack System	Aquaneering Inc	Cat. # ZS550
Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g	Pet Valu	Cat. # 31700
Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz	Brine Shrimp Direct
1.5 L Trapezoidal Tank	Pentair Aquatic Ecosystems	Cat. # itsts-a
19 L rectangular tank	That Fish Place	211932
76 L rectangular tank	That Fish Place	212180
Hitachi KP-D20A CCD Camera	Prescott's, Inc.
Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens	Nikon Corporation
ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3"	Michaels	Cat. # 10334162
Jwatcher
SPSS Statistics Base	IBM
R	The R Foundation