Arrojo, agressão e Ensaios shoaling para Zebrafish Síndromes Comportamentais

Resumo

This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

Resumo

A síndrome comportamental existe quando comportamentos específicos interagem sob diferentes contextos. Peixe-zebra foram cobaias em estudos recentes e é importante para padronizar protocolos para garantir análises e interpretações adequadas. Em nossos estudos anteriores, temos medido ousadia monitorando uma série de comportamentos (tempo perto da superfície, a latência em transições, número de transições, e dardos) em um tanque trapezoidal 1,5 L. Da mesma forma, nós quantificamos a agressão por mordidas de observação, monitores laterais, dardos e tempo perto de um espelho inclinado em um tanque de 19 L rectangular. Ao dividir um tanque de 76 L em três partes, que também examinou as preferências empolamento. O ensaio shoaling é um ensaio altamente customizável e pode ser adaptado para hipóteses específicas. No entanto, os protocolos para este ensaio também deve ser padronizado, mas suficientemente flexível para personalização. Em estudos anteriores, as câmaras finais eram ou vazio, continha 5 ou 10 peixes-zebra, ou 5 Danios pérola (D. albolineatus). No folmugindo manuscrito, apresentamos um protocolo detalhado e dados representativos que acompanham aplicações bem sucedidas do protocolo, que irá permitir a replicação de experiências síndrome comportamental.

Introdução

Há um crescente corpo de literatura investigando as associações entre comportamentos distintos dentro animais individuais a partir de uma dada população. Estas associações são denominadas síndromes comportamentais, e as medidas incluem, tipicamente, a ousadia, a agressão, o comportamento exploratório, e sociabilidade ^1-5. síndromes comportamentais são valiosos tanto por razões diretos e indiretos. Diretamente, o conhecimento das síndromes comportamentais podem fornecer uma visão mais completa da teoria da evolução, estrutura populacional e dinâmica populacional ^3. Indiretamente, o conhecimento sobre as associações comportamentais podem informar campos que quantificam o comportamento tais como farmacologia ^6, toxicologia ^7, genética comportamental ^8,9, e endocrinologia ^10. Devido a estes benefícios diretos e indiretos, o aumento do conhecimento das síndromes comportamentais é especialmente valioso em organismos modelo comumente utilizados, tais como o peixe-zebra. Estudos utilizando peixes-zebra são encontrados ina variedade de disciplinas, incluindo a análise das síndromes comportamentais ^11-13. Para avançar o conhecimento em pesquisa síndrome comportamental, e por outras disciplinas também usam as medidas comportamentais para o teste de hipóteses, descrições confiáveis ​​e sucintas de comportamento são necessários para análises e interpretações válidas e protocolos padronizados irá facilitar as comparações inter-estudo dentro das espécies. Nosso protocolo foi desenvolvido para medir uma síndrome comportamental ousadia-agressão shoaling em uma população de peixe-zebra criados em laboratório ^14. No entanto, a base do protocolo (rastreamento de cada peixe, assegurando randomização apropriada, e análises apropriadas) pode ser facilmente modificado para uma variedade de medidas comportamentais alternativos. Além disso, ensaios de ousadia, agressão ou empolamento pode ser executado individualmente para o teste de hipóteses distintas. Portanto, ao mesmo tempo que é o nosso objetivo para descrever como conduzir um estudo de síndrome comportamental eo protocolo para o sucesso l indivíduoEvel medição comportamental, cada faceta deste procedimento pode ficar sozinho.

A literatura sobre síndromes comportamentais abarca diversos grupos taxonómicos, de artrópodes e para os seres humanos ^4, a fim de medir uma síndrome comportamental, pelo menos dois contextos de comportamento tem de ser quantificados. Infelizmente, muitas vezes há pouca consistência nos ensaios que são utilizados para quantificar a medida de comportamento entre os eixos de comportamento. Por exemplo, no peixe, coragem pode ser medida utilizando ensaios de labirinto em T, ensaios de campo aberto, ou a introdução de um novo estímulo ou externa ^15. Estudos de agressão em peixes pode envolver interacções díade, ensaios de vídeo de estímulo, ou ensaios modelo de argila ^12,16,17. Da mesma forma, a análise do comportamento de empolamento, que tipicamente envolve a medição de preferência shoalmate, pode ser realizada em diferentes tipos de tanques, com diferentes métodos para determinar o tempo de associação ^21-23. Neste protocolo de um subconjunto específico do OveraLL repertório comportamental ensaio é apresentado. Especificamente, este protocolo apresenta uma metodologia para rastrear indivíduos através de ousadia, agressão e ensaios de empolamento de uma forma que facilita as comparações dentro dos indivíduos para determinar se as comparações são consistentes em todos os indivíduos dentro de uma população. Efetuamos este protocolo com o peixe-zebra e ciclídeos condenado (Amatitlania nigrofasciata) em estudos anteriores ^14,18, e ele vai trabalhar com qualquer peixes de água doce de tamanho similar.

Os ensaios de negrito são conduzidas num tanque trapezoidal 1,5 L que tem uma linha horizontal delinear áreas de igual tamanho das porções superior e inferior do tanque. comportamentos quantificados incluem o número de transições através do teste de peixe entre a parte superior e inferior do tanque, o tempo gasto em cada porção, o número de dardos, e a latência para entrar na porção superior. O ensaio de agressão é realizada num tanque rectangular 19L, que incluium espelho x 5 polegadas 3 polegadas inclinada a cerca de 22 ° situadas no canto inferior esquerdo do tanque ^19. Comportamentos quantificados incluem a quantidade total de tempo gasto pelos peixes-alvo interage com o espelho ^20, juntamente com indicadores agressivos específicas - número de picadas, displays laterais, dardos entre os peixes de ensaio e de sua reflexão. Para estes indicadores específicos, mordidas são definidos como estocadas rápidas para o espelho com uma boca aberta, displays laterais são definidos como a queima de lateral, peitorais, anal e dorsal barbatanas na direção do espelho, e dardos são quaisquer movimentos erráticos que são não dirigido para o espelho. Finalmente, o ensaio de empolamento quantifica o comportamento de um peixe teste na câmara de centro de um tanque de câmaras-tri. As câmaras laterais do tanque são ou vazio, ou conter uma "cardume target" de peixes, eo tempo o peixe teste gasta perto de cada câmara lateral é medido ^21-23. A pontuação composta única, referido como StrenGTH de empolamento (SOS), é calculada para cada peixe de teste individual, específica para os estímulos, e pode ser utilizado em análises a jusante ^14. Todos os comportamentos são marcados por um único visor, ou vários espectadores usando software quantificação comportamental livre conhecido como jWatcher ^24.

Testando a presença de uma síndrome comportamental é principalmente um esforço estatística, e é aconselhável seguir as orientações tal como apresentado pela Budeav 2010 ^25. Especificamente, recomenda-se realizar uma análise de componentes principais (PCA) em dados centralizados e normalizados em que o entradas são os vetores de comportamentos de um indivíduo em ensaios com múltiplas medidas comportamentais (ie, ousadia e agressividade). A APC, realizado em uma matriz de correlação, reduz a dimensionalidade das medições comportamentais, e assim extrai o conhecimento mais importante que explica a maioria da variação. Os componentes extraídos podem então ser interpretada based em cargas elevadas de factor para o comportamento individual de interesse e pontuações de regressão pode ser extraído para cada indivíduo na base dos componentes explicativas. Estas pontuações de regressão pode, então, ser comparado com a medição SOS e outras várias medições não-comportamentais, tais como o tamanho do peixe ou sexo.

Esse fluxo de trabalho foi implementado em um estudo das síndromes comportamentais peixe-zebra em que uma síndrome comportamental específica do sexo que existe entre ousadia e shoaling ¹⁴ foi descoberto. Nesta situação, ousadas machos de peixe-zebra são mais susceptíveis de se associar com a espécie de maior dimensão, mais agressivos (D. albolineatus), mas esta associação é perdida nas fêmeas. Esse fluxo de trabalho também foi implementado em um estudo de presidiário kin juvenil ciclídeos (Amatitlania nigrofasciata) ¹⁸ em que uma síndrome comportamental não foi descoberto, potencialmente indicando plasticidade comportamental da espécie. Portanto, o protocolo seguinte é apresentada Wom um objectivo de delinear a natureza dos três ensaios específicos (coragem, agressão, e de empolamento), no âmbito de um estudo síndrome comportamental nível individual.

Protocolo

Os seguintes metodologias para a habitação, cuidados, e estudo do peixe-zebra foram aprovados pela Universidade IACUC do Saint Joseph.

1. Zebrafish alojamento e cuidados

1. Obter o peixe-zebra assunto a partir de um fornecedor local, ou a partir de populações selvagens capturados. Por favor, note que a habitação o peixe-zebra está sujeito às diretrizes IACUC e autorizações adicionais são necessários para as populações selvagens capturados habitacionais.
2. Identificar e peixe-zebra em separado de acordo com o sexo. Como alternativa, ignore este passo ou substituir com um método diferente de separação com base na hipótese do estudo.
   NOTA: características sexuais são difíceis de determinar no peixe-zebra, especialmente nas fêmeas. Referem-se a estas diretrizes ¹⁰ ou manuais on-line úteis para distinguir o sexo.
3. Aleatoriamente separar as populações mais para dentro da proporção apropriada de peixe peixes focal ao estímulo. Nota: peixes Focal são os assuntos de teste seguido através da série de behavioensaios de RAL, e peixes de estímulo são as pessoas que irão ocupar as câmaras de estímulo nos ensaios agressão e empolamento.
   NOTA: Tradicionalmente, entre 1 e 5 estímulo peixe peixes por focal em ensaios de empolamento e uma mistura 1: estímulo proporção de 1: peixes focal em ensaios de agressão ^14,17 são usados. No entanto, o pesquisador precisa projetar especificamente o estudo com a hipótese em mente (ou seja, deve estímulo peixes ser mantida constante para manter a consistência no comportamento dos peixes focal, ou deveria estímulo peixes ser rodado entre cada ensaio para assegurar a randomização adequada).
4. Armazenar todos os peixes nas prateleiras habitação peixe-zebra (27,5-28,5 ° C) sob uma 00:12 ciclo de luz / escuridão rigorosa. Alimentar todos os alimentos focal e estímulo peixes floco diária e semanal camarão de água salgada, em dias não-investigação.
5. Certifique-se de que todos os testes é feito entre ZT1 e ZT5 (hora zeitgeber) para evitar os efeitos do ritmo circadiano ^26.

2. A randomização e tanque de Setup

1. Randomize todos os indivíduos a priori a uma sequência específica de ensaios comportamentais. Configurar um esquema de randomização consistente usando um gerador de seqüência aleatória on-line ²⁷ ou um gerador de seqüência aleatória de um pacote de software estatístico (R).
   1. Rotular cada ensaio 1-3 e manter essa atribuição consistente. Atribuir uma sequência aleatória para cada indivíduo e mapear a sequência de acordo com a etiqueta de ensaio comportamental. Por exemplo, para três ensaios totais (1 mapeados para shoaling, 2 mapeado para a ousadia, e 3 mapeados para Agressão), um determinado indivíduo pode ter uma sequência aleatória de '2,3,1', que vai obrigá-los a realizar o específico ensaios comportamentais na seqüência especificada.
2. Configurar os tanques de ensaio (ousadia, agressão e empolamento) no laboratório em lugares que minimizam a possibilidade de estímulos externos adversos e certifique-se de ter espaço suficiente para uma câmara de vídeo para capturar todo o tanque. Certifique-se de que a câmara de vídeo enough clareza para ver etiquetas tanque, bem como ser capaz de distinguir comportamentos sutis do peixe focal e configuração da câmara de vídeo nesta posição.
3. Grave todos os ensaios comportamentais com a câmera mantida na mesma posição com uma vista completa do tanque especificado para minimizar as diferenças inesperadas na pontuação comportamental, como resultado de gravações diferenciais.
   NOTA: Evite colocar tanques nas áreas de tráfico pesadas e por portas como o movimento e som irá afetar o comportamento do peixe-zebra.
4. Estabelecer protocolos jWatcher únicas ²⁴ por conseguir cada ensaio comportamental. Consulte o manual jWatcher para aprender como criar arquivos mestres focais para atribuir comportamentos a teclas e ficheiros de análise focais para resumir dados coletados.
   NOTA: jWatcher é software de pontuação comportamental que permite a pontuação comportamental, confiável e repetível personalizado ^24.
5. Definir um sistema de rotulagem para rastrear a data, número de peixes, e número de ensaio para todos os ensaios comportamentais (por exemplo,'F5-B-123115' implicando Peixe 5, ensaio Ousadia, no dia 31 de ^dezembro de 2015) e rotular o exterior do tanque com fita em vista e no foco da câmera. Manter e gravar essas informações em um caderno de anotações para referência rápida e controle de qualidade futuro.
6. Defina-se um tanque de aclimatação que vai ser utilizada entre todos os ensaios, bem como imediatamente após os indivíduos são retirados da carcaça cremalheira.
   NOTA: Os tanques de aclimatação e tanques do terminal estão aquários pequenos (40 cm x 20 cm x 25 cm) com cascalho e um filtro que se assemelham a cremalheira habitação.
7. Após os ensaios estão todos concluídos, transferir o indivíduo para um tanque de um terminal separado, que servirá como o tanque de destino final para todos os indivíduos focais usados. Use um tanque que é grande o suficiente para abrigar um grupo de indivíduos para o resto de suas vidas (por exemplo, 25 litros).
   NOTA: É muito importante para manter as temperaturas e condições consistentes e similares água across todos os tanques. Isso inclui habitação, aclimatação, e todos os tanques de teste.

3. Realização do Ensaio Agressão

1. Realizar o ensaio de agressão em um 19 L tanque retangular medindo 30 cm x 15 cm x 10 cm. Equipar o tanque em partições opacas exterior adjacente de três lados do tanque de agressão, deixando exposta a frente para visualização, para reduzir a estímulos exteriores indesejáveis. Divida o tanque com marcações externas em quatro quadrantes iguais retangulares e fixar um espelho permanentemente (com calafetar silicone) no quadrante inferior esquerdo, inclinado a 22,5 ° formando um triângulo direito contra o lado esquerdo do tanque.
2. Certifique-se de que a temperatura da água no tanque de depósito de aclimatação e agressão está dentro de 2 ° C da cremalheira habitação. Para fazer isso, ter água fresca e em idade pré-aquecido a 27,5-28,5 ° C pronto para adicionar ao tanque de agressão. Por favor, note que é importante para mudar a água entre cada ensaio para eliminar injustificadapistas olfactivas.
3. Transferir, por escavação, um peixe focal da cremalheira carcaça para um tanque de aclimatação separada onde ele vai aclimatar durante 10 min.
   NOTA: É importante para reduzir estímulos introduzidos para o peixe através do manuseio inadequado. Indivíduos de transferência como descrito anteriormente ^27.
   1. Especificamente, manualmente e com cuidado colocar um copo de plástico pequena, transparente para o tanque de interesse. Sem interromper o peixe, tanto quanto a transferência usando uma rede, lentamente recolher o peixe no copo.
4. Certifique-se de que a câmara de vídeo está pronta para gravar, confirmando que o tanque de ensaio de agressão (veja o passo 3.1) está em foco e imediatamente antes de transferir o indivíduo para o tanque de agressão, pressione registro no dispositivo. Transfira o peixe focal através de escavação a partir do tanque para o tanque de aclimatação agressão.
   NOTA: É importante registrar antes de o pescado que entra no tanque agressão para controlar o tempo exato de entrada.
5. Grave a aggrESSÃO tanque durante 10 min e 30 seg e em seguida, o copo de peixe focal do tanque de agressão de volta para o tanque de aclimatação.
6. Ao assistir a gravação, espere 30 segundos depois de o peixe foi introduzido para o tanque como um período de aclimatação adicional antes de comportamentos de pontuação.
7. Usando o sistema de pontuação jWatcher definido para comportamentos agressivos, quantificar os seguintes comportamentos para 10 min: O tempo gasto perto do espelho, o número de abordagens espelho, número de dardos, número de tentativas de picadas (abertura da boca na direção do espelho), e número de monitores laterais (dorsal, peitoral, anal, e montagem barbatana caudal) ^9.
8. Marcar um ensaio de agressão única, pelo menos, duas vezes, até que o ensaio é marcado com alta concordância entre as iterações.

4. Realização da Ousadia Assay

1. Conduzir o ensaio ousadia em um pequeno 1.5 L tanque trapezoidal, medindo 15 cm de altura x 26,5 cm x 22,5 cm topo inferior x 6 cm de largura. Enrole papel opaco em torno de todos os lados of do tanque, mas deixar a frente expostos para visualização. Colocar uma peça única, fina de fita externa ao tanque para demarcar o topo da porção inferior do tanque.
2. Assegurar que a temperatura da água no tanque é coragem dentro de 2 ° C da cremalheira caixa (ver passo 3.2)
3. Transferir o peixe focal da cremalheira carcaça para o tanque de aclimatação (ver passo 3.3) e deixe aclimatar durante 10 min.
4. Certifique-se de que a câmera está pronta para gravar o ensaio ousadia e, uma vez pronto para transferir o peixe focal, pressione registro no dispositivo. Transfira o peixe focal do tanque de aclimatação para o tanque de ousadia e recorde de 8 min e 30 seg.
5. Ao assistir a gravação, permitir um período adicional de aclimatação de 30 segundos depois de o peixe é introduzido no tanque antes de marcar.
6. Usando o software jWatcher, quantificar comportamentos ousadia para 8 min. Especificamente, quantificar os seguintes comportamentos: Tempo perto da superfície, a latência para entrar porção superior, o número de transitions para a parte superior, e número de movimentos erráticos (dardos) ^29.
7. Marcar um ensaio audácia única, pelo menos, duas vezes, até que o ensaio é marcado com alta concordância entre as iterações.

5. A realização do Ensaio shoaling

1. Conduzir o ensaio shoaling em um tanque de 76 L que tem três compartimentos divididos por dois divisores de vidro selados com silicone calafetar (as resultantes três compartimentos consistem em duas zonas de estímulo e um compartimento focal). Externamente, marcar duas zonas preferenciais designados 6,35 cm de cada uma divisória de vidro nas zonas de estímulo ", indicativo de dois corpos comprimentos ^30. Aplicar divisórias opacas externamente em torno de três lados do tanque shoaling, mas deixe a frente expostos para visualização.
   NOTA: Esta zona de preferência pode ser personalizado para testar hipóteses específicas para diferentes espécies de tamanho.
2. Dependendo da natureza do estudo, seleccione cardumes de estímulo a aclimatar durante pelo menos 12 horas antes da suae testar e permanecem no tanque empolamento durante todo o decurso da experiência.
   NOTA: cardumes estímulo são colecções de peixes individuais que são usados ​​para avaliar a forma como o peixe focal comporta-se na presença ou na ausência desses bancos de areia. Diferentes combinações estímulo cardume pode ser seleccionado para testar um número de diversas hipóteses de empolamento. Certifique-se de que os cardumes de estímulo são rodados entre cada zona de estímulo para evitar viés de lado e também estão autorizados a aclimatar durante pelo menos 12 horas antes do teste.
3. Transferir o peixe focal para dentro do tanque de aclimatação como previamente descrito (ver passo 3.3)
4. Transferir, por escavação, o peixe focal do tanque de aclimatação intermédia para o compartimento central do tanque de empolamento.
5. Permitir para um período de aclimatação de 10 minutos antes de um período de observação live-scoring 10 min. Alternativamente, gravar os ensaios de empolamento e marcar mais tarde usando jWatcher. Os peixes são determinado a ser shoaling quando estão dentro da zona de preferência na câmaraabrigando o cardume alvo.
6. Quantificar o tempo gasto em cada zona de preferência e tempo gasto no volume central.
7. Como medida descritivas adicionais, calcule 'força da shoaling' (SOS). Atribuir um valor entre -1 e +1, onde a magnitude descreve quantas vezes um cardumes de peixes individuais.
8. Calcula-se a razão entre o tempo gasto empolamento dividida pela área das zonas de empolamento e subtrair a percentagem de tempo gasto não empolamento e a área das regiões não-empolamento. Coloque esta quantidade através da soma do tempo gasto em cada zona, dividido pelo volume de cada zona individual. Mais informações sobre este cálculo pode ser encontrado em um estudo anterior ^14.

6. Controle de Qualidade de Dados

1. Analisar dados usando dados tradicionais ferramentas de análise de ^31-32.
2. Teste de homogeneidade de variância por meio do teste não paramétrico de Levene para todos os comportamentos. Se um comportamento é não homogênea executar uma log-transformação33.
3. Confirmar que não há nenhum efeito de sequência (ou seja, que a ordem de randomização não afectou o comportamento dos indivíduos), utilizando um ANOVA de Kruskal-Wallis nos dados homogéneas ^34.
4. Confirmar que não há desvios laterais para o ensaio de empolamento criando modelos lineares gerais univariadas em índices SoS com o lado como um fator fixo ^35.
   NOTA: Se houver pouca ou nenhuma problemas com os dados, as análises a jusante pode ser conduzida. Se houver problemas, conciliar com transformações adicionais, racionalizar com explicações biologicamente plausível, e / ou aumentar o tamanho das amostras.

7. Analisar dados

1. Calcule bicaudal de Spearman correlações ³⁶ para todos os comportamentos separadamente nos ensaios de ousadia e agressividade.
2. Calcule os coeficientes de correlação intraclasse (CCI) como um modelo misto de duas vias com consistência para ensaios comportamentais que foram realizados mais de um time para um determinado indivíduo ^36. Neste cenário, o TPI é uma medida de como consistentemente um peixe comportou-se de um dado ensaio mediu mais de uma vez.
3. Preprocess ousadia e agressividade comportamentos de centragem e normatização todos os comportamentos para se preparar para a entrada para a análise de componentes principais (PCA) ^25.
   NOTA: Pré-processamento das medições pela centralização e normatização é um passo vital. Sem este passo de pré-processamento comportamentos que ocorrem com mais frequência e mais variável irá influenciar excessivamente as interpretações dos componentes extraídos. O processo de centralização e normatização irá remover esse viés.
4. Execute um APC com uma matriz de correlação para determinar se a ousadia e agressividade estão ligadas entre si como uma síndrome comportamental. Interpretar cargas comportamentais de cada componente significativo em> 0,6. Veja Budaev 2010 ²⁴ para um guia completo para relatar PCA para estudos comportamentais. A trama scree vai ser informativo em que eigenvectors deve ser mantido para a interpretação.
5. Usando software estatístico, como R ou SPSS ^31,32, extrair pontuações para cada componente para cada indivíduo. As contagens representam a quantidade de comportamento do indivíduo dado pode ser explicado por o componente em particular.
6. Calcule Spearman correlações entre os escores de regressão de fatores e a força de empolamento ^36.
   NOTA: A síndrome comportamental é considerado presente se ousadia e agressividade comportamentos carregar no mesmo componente ou, se algum componente com cargas interpretáveis ​​significativas correlaciona-se com a força de empolamento. Além disso, observe que a força de shoaling não está incluído no PCA para permitir melhores interpretações das quantificações comportamentais mais complexos (ousadia e agressividade). A APC ortogonalmente colapso ousadia e agressividade apresenta em vectores próprios para maximizar a quantidade de variação explicada e é bem adequado para estas medições complexas. interpretaçãoo que resulta autovetores e regredindo a nossa força de medições empolamento em cada um deles dá uma interpretação muito mais intuitiva de como cada um dos comportamentos complexos (ousadia e agressividade) referem-se a uma medição shoaling binário mais bem definida (ou seja, o peixe é empolamento ou não shoaling).

Resultados

Dependendo da natureza do estudo, e protocolo específico empregue, vários resultados distintos são possíveis através de uma experiência síndromes comportamentais. As tabelas e figuras, onde indicado a seguir, são adaptados de nosso estudo anterior publicado na revista Behavioural Processes ¹⁴ e do jornal Zebrafish ^17. Quando a proposta (como descrito acima) é levada a cabo na sua totalidade, dois conjuntos de resultados, "dentro de correlações de ens...

Discussão

O protocolo irá determinar se existem associações consistentes em ousadia, agressão e comportamentos empolamento em peixes-zebra. Se existem associações consistentes numa dada população entre qualquer um destes comportamentos, em seguida, uma síndrome comportamental está presente. Ao estudar a síndrome comportamental de uma população, os pesquisadores podem ter uma compreensão mais completa da sua dinâmica comportamental, estrutura populacional e história evolutiva, possivelmente, ^3. Além dis...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish Rack System	Aquaneering Inc	Cat. # ZS550
Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g	Pet Valu	Cat. # 31700
Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz	Brine Shrimp Direct
1.5 L Trapezoidal Tank	Pentair Aquatic Ecosystems	Cat. # itsts-a
19 L rectangular tank	That Fish Place	211932
76 L rectangular tank	That Fish Place	212180
Hitachi KP-D20A CCD Camera	Prescott's, Inc.
Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens	Nikon Corporation
ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3"	Michaels	Cat. # 10334162
Jwatcher
SPSS Statistics Base	IBM
R	The R Foundation