雄マウス超音波発声（USV）曲の抽出と分析

要約

マウスは、超音波声質化（USV）の複雑なマルチ音節レパートリーを生成する。これらのUSVは、神経精神医学的障害のための情報として広く使用されている。このプロトコルは、マウスの歌の音響的特徴および構文を一貫して誘起し、収集し、分析するために、我々が学んだ、および開発したいくつかのプラクティスを記載している。

要約

マウスは、発達および成人期を通じて、様々な社会的状況において超音波声帯（USV）を生成する。これらのUSVは、マザーポップ検索¹ 、少年インタラクション² 、同じ性交渉3,4,5、および領域相互作用^{6に使用される} 。数十年間、USVは、脊椎動物^10の声通信のメカニズムと進化を理解するために、神経精神医学的発達障害または行動障害7,8,9を研究するためのプロキシとして研究者によって使用されてきた¹⁰ 。性的相互作用の中で、成体の雄のマウスは、歌鳥^11の求愛歌に類似するいくつかの特徴を有するUSV歌を生み出す。そのような複数音節のレーパーの使用彼らは、要素がどのように編成され再結合されるか、つまり構文が異なることがあるので、潜在的な柔軟性と情報を増やすことができます。このプロトコルでは、新鮮な女性の尿、麻酔した動物、および発情の女性への暴露など、さまざまな社会的状況で雄マウスからUSVソングを引き出す信頼できる方法が説明されています。これには、マウスから大量の音節を誘導する条件が含まれます。安価な音場で周辺雑音の記録を減らし、USVを自動的に検出、分類、分析するための定量方法を提示します。後者は、コールレート、ボーカルレパートリー、音響パラメータ、および構文の評価を含む。特定の歌のタイプに対する動物の嗜好を研究するために再生を使用することに関する様々なアプローチおよび洞察が記載される。これらの方法は、雄マウスの異なる状況、および雌マウスの歌嗜好に関する音響および構文の変化を記述するために使用された。

概要

人間と比較して、マウスは低音と高音の両方の発声を生成します。後者は、聴力範囲を超える超音波発声（USV）として知られています。 USVは、母親の妊娠の回復、少年の相互作用から、反対のまたは同じ性交渉の成人への相互作用4,12など、さまざまな状況で生み出されている。これらのUSVは、手作業で自動的に分類することができる多様なマルチ音節のレパートリーから構成されています（ ¹⁰または^11） 。近年、これらのUSVの通信における役割はますます深まっている。これらには、神経精神医学、発達障害または行動障害^7,8 、および内部の動機づけ/感情状態^13のマウスモデルの表示としてUSVを使用することが含まれる¹³ 。 USVは信頼できる情報をeに伝えると考えられているレシーバ^14,15にとって有用なミッタの状態である。

2005年、HolyとGuo ¹¹は、大人の雄のマウスUSVが、鳴き鳥に類似した複数音節の呼び出し要素または音節の連続として編成されたという考えを進歩させました。多くの種では、マルチ音節のレパートリーにより、エミッタは、ソングによって運ばれる可能性のある情報を増やすために異なる方法で音節を結合して順序付けることができます。この構文のバリエーションは、性行動や仲間の選好に影響を及ぼすと考えられている^16,17 。その後の研究では、雄のマウスが、女性の存在の前、中、後に生成する音節型の相対的な組成を変えることができたことが示された5,18。すなわち、成体雄マウスは、USVを使用して求愛行動を誘発するまたは女性との密接な接触を維持すること、または交配を容易にすること^19,20,21 。彼らはまた、男性 - 男性の相互作用でも放出され、おそらく相互作用の間に社会情報を伝達する⁴ 。レパートリーにおけるこれらの変化を捕らえるために、科学者は通常、スペクトル特性（振幅、周波数などの音響パラメータ）、USV音節数または呼数、および最初のUSVに対する待ち時間を測定する。しかし、実際にこれらのUSVのシーケンスダイナミクスを詳細に見るものはほとんどありません²² 。最近、我々のグループは、USV音節系列の動的変化を測定する新しい方法を開発した²³ 。私たちは、歌の中の音節の順序（つまりシンタックス）は無作為ではなく、社会的な文脈によって変化し、聞き取りの動物はこれらの変化を人工的に関連するものとして検出することを示した。

我々はthに注意する動物のコミュニケーションを研究している多くの研究者は、人間の発話に使用されている構文と正確に同じ意味で、「構文」という用語に付いていません。動物のコミュニケーション研究では、いくつかの規則で順序付けられた非ランダムな一連の音を意味します。さらに、ヒトについては、特定の配列が特定の意味を有することが知られている。これがマウスに当てはまるかどうかはわかりません。

このペーパーと関連するビデオでは、さまざまな状況でUSVの雄マウスを記録し、再生を行うための信頼性の高いプロトコルを提供することを目指しています。逐次使用される3つのソフトウェアの使用：1）自動録音。 2）音節の検出と符号化。 3）音節の特徴と構文の詳細な分析が実証されている（ 図1 ）。これにより、雄性マウスのUSV構造と機能についてより多くのことを学ぶことができます。このような方法はデータ分析を容易にし、mouの正常および異常な声のコミュニケーションを特徴付ける際に新しい地平を開けてくれると信じているコミュニケーションおよび神経精神障害のモデルをそれぞれ示している。

プロトコル

倫理声明：すべての実験プロトコールは、デューク大学機関動物実験および使用委員会（IACUC）によってプロトコール＃A095-14-04の下で承認された。注：使用されるソフトウェアの詳細については、「 材料と機器 」の表1を参照してください。

1.マウスUSVの刺激と記録

1. 録音セッション前の男性の準備
   注：B6D2F1 / J若年成体雄マウス（7-8週齢）を用いて代表的な結果を得た。このプロトコールは、任意の株に適合させることができる。
   1. 他に必要な場合を除き、12時間の明/暗サイクルで動物室の光サイクルを設定します。必要または必要がない限り、ケージあたり4〜5匹の雄の標準的な住居規則に従ってください。記録する3日前に、同じ系統の一晩中、性的に成熟し受容性の女性（ケージあたり1匹のメスにつき最大3匹のオス）に個々にオスを暴露する。
   2. 翌日削除最初の録音セッションの前に少なくとも2日間は女性のいない男性を収容しています（試行錯誤の分析に基づいて）。
2. 録音ボックスの準備
   1. サウンド減衰ボックススタジオ（ 図2A ）として機能するために、ビーチクーラー（内部寸法はL 27 x W 23 x H 47 cmです）を使用してください。ボックスの上に小さな穴を開けて、マイクのワイヤーを動かします。
      注：聴覚またはお互いに見なくても数十のマウスを一度に記録し、周囲の室内の機器の騒音や部屋の人の迷惑を防ぎ、きれいにするために、弱毒化した視覚的に隔離された環境で動物を記録することが望ましいマウスの健全な記録（ 図2B ）。我々は、同じマウスの発声を内側から外側に比較したときに、サウンドにエコーや歪みがないことに気づいていません彼は減衰チャンバを消音する（ 図2C ）。むしろ、そこでは音が大きくなり、室内のハーモニクスが少なくなります。
   2. サウンドレコーディングソフトウェア（ 図1および表1のソフトウェアA など）を使用するには、マイクをワイヤに接続し、ワイヤをサウンドカードに接続し、サウンドカードをコンピュータに接続します。 .wavサウンドファイルを生成するソフトウェアAなど、適切な録音ソフトウェアが必要です。
   3. 防音ボックスの内側に空のケージ（58 x 33 x 40 cm）を置き、マイクの膜がケージの底から35〜40 cm上になるようにマイクの高さを調整し、マイクがケージの中央にくるようにします（ 図2A参照）。
3. 連続記録用記録ソフトウェアA（ 表1 ）の構成
   1. ソフトウェアをダブルクリックして開きますA.「設定」メニューをクリックして開き、名前の付いたデバイスを選択します、サンプリングレート（250,000Hz）、フォーマット（16ビット）。
   2. キー "Trigger"オプションを選択し、 "Toggle"をチェックしてください。
      注：この設定では、刺激をマウスのケージに置いている間にキー（F1、F2 など ）を押して記録を開始できます。
   3. 「Name」パラメータの下にマウスのIDを入力します。
   4. 最大ファイルサイズを記録する分数に設定します（通常は5分に設定されます）。
      注記：分が長くなればなるほど、コンピュータの記憶域に必要なメモリ量は増えます。連続モードが設定されていない場合、ソフトウェアは、設定されたパラメータに基づいてシーケンスの始めまたは最後にソングの試合を切断します。したがって、シーケンスを確実に定量化することはできません。
4. 異なる刺激を使用してUSVを記録する。注：各刺激は、ユーザーの実験的ニーズに応じて個別に使用できます。
   1. 尾で記録するように動物を静かに持ち上げ、寝具を使わずにケージに置きます（movを防ぐために防音ボックスの内側に寝具の上に音を立ててください）、ふたを上にして、ケージの開いた金網の蓋をその上に置きます。
   2. 消音されたボックスを閉じて、動物に15分間慣れさせます。この時点で刺激準備（1.4）を行う。
5. 刺激の準備
   1. 刺激としての新鮮尿（UR）サンプルの調製
      1. 記録セッションの前に最大5分間尿サンプルを採取し、男性からの歌唱を最大限に引き出す。注：長時間、特に数時間または夜間に座っている尿は効果的ではありません^{24,25 、}私たちは経験的に確認しています²³ 。
      2. 1つのケージで女性または男性（使用する刺激の性別に応じて）を選び、首の後ろの皮膚をつかみ、一方では動物を片手で拘束します。
      3. ピンセットで、綿棒（3 - 4mm x 2mm幅）をつかみます。静かにこすって動物の膀胱を押して、新鮮な尿を1滴抽出します。女性の膣または男性の陰茎を拭いて、コットンチップ上のすべての滴を集める。
      4. 次に、別のケージを選択します。別の女性または男性で同じ手順を繰り返しますが、以前に使用したのと同じ綿の先端を使用します。
         注：この手順では、発情周期が歌行動に影響を与える可能性があることが知られているように、少なくとも2人の女性または2人の独立したケージの男性の尿を同じコットンチップに混ぜて、発情または他の個々の影響を確実に防止します。
      5. 清潔なガラスまたはプラスチックのペトリ皿に使用する綿棒を置きます。
         注：尿を伴う綿棒は次の5分以内に使用する必要があるため、蒸発を防ぐために袋を覆う必要はありません。
   2. 準備生きている女性（FE）刺激の刺激としての
      1. 性的に成熟した女性の1つまたは2つの新しいケージを選択する。出生前または発情段階の女性を目視検査で確認する（ ^27,28に示すように、広範囲の膣開口部およびピンク色のサラウンド）。使用するまで別のケージに分けてください。
   3. 刺激としての麻酔動物の雌（AF）または雄（AM）の調製
      1. AFの場合は、上のプール（発情前または発情のいずれか）から女性を選択します。AMの場合は、成体雄マウスのケージから男性を選択します。
      2. ケタミン/キシラジン（それぞれ100および10mg / kg）の溶液を腹腔内注射して、雌または雄に麻酔をかける。
      3. 動物が麻酔をかけられている間に目の脱水を防ぐために眼軟膏を使用してください。ピンチ時の足の収縮反射を検査して、適切な麻酔をチェックする。麻酔した動物をきれいなケージにペーパータオルで置き、ウィットhヒートパッド上のケージは、体温のコントロールを確実にするために「最小限の熱」に設定してください。
      4. 彼らが目を覚ます前に（通常約45分）必要に応じて異なる記録セッションのために同じ動物を2〜3回再使用する。それぞれのレコーディングセッションの後、ヒートパッドに戻してください。
      5. 5分ごとに動物に触れることにより、目視検査（毎分60〜80回の呼吸）と体温で呼吸速度を制御します（触れると暖かい）。
   4. 録音の準備ができたら、ソフトウェアAの「録音」ボタンをクリックします。
      注：ユーザーが各チャンネルに関連付けられたキーボタンをクリックしない限り、録画は開始されません。コンピュータスクリーン上のケージからのライブオーディオフィードを監視して、動物が歌い、録音が適切に取得されていることを確認します。
   5. 同時に記録されるべき所望のボックスの関連するキーボタンを押す（ すなわち 、ボックス1についてはF1）、所望の刺激を導入する。
      1. 刺激の1つを以下のように提示する。ケージの内部に新鮮な尿サンプルを入れた綿棒を置くか、生きた雌をケージの中に置きます。ケージの金属製ふたの上に麻酔動物（AFまたはAM）を置きます。
   6. 録音ボックスを静かに閉じて、録音が設定された分（ たとえば、 1.3節で説明されているように5分）経過するようにします。
   7. 録音後、録音を停止するには赤い四角の赤いボタンをクリックします。
   8. 麻酔した動物を刺激として使用した場合は、防音レコーディングボックスを開き、ケージの金属蓋から麻酔した動物を取り出し、次のレコーディングセッションの前にヒートパッドに戻します。それは胸骨臥位を維持するのに十分な意識を回復するまで15分ごとに行われます。
   9. ケージを開き、意識のある試験動物を取り出し、それをそのホームケージに戻す。試験ケージを70％アルコールで洗浄する。蒸留水。

2.マウス・ソング・アナライザーv1.3を使用した.wavファイルと音節コードの処理

1. コーディングソフトウェアBを開き（ 図1 、 表1 ）、「マウスパス解析ツール」（ 図1 、 表1 ）のソフトウェアスクリプトCを含むフォルダをソフトウェアBのパスに置き、「パス設定」をクリックしてソフトウェア上のフォルダを追加しますB.その後、ソフトウェアBを閉じて保存します。
2. 結合されたソフトウェアB + Cの音節識別設定を構成します。注：ソフトウェアスクリプトCコードでは、 "sonograms"という新しいフォルダが自動的に作成されます。このフォルダには、.wavファイルが保存されていた同じフォルダに.sng形式のファイルが作成されます。同じフォルダ内のソフトウェアAを使用して生成された同じレコーディングセッションからの.wavファイルをすべて格納する方が一般的です。
   1. Cで構成されたオープンソフトウェアB
      注：このバージョンのソフトウェアBは完全にcです。ソフトウェアスクリプトCとは互換性がありません。それ以降のバージョンが現在のコードに含まれるすべての機能を受け入れることは保証されません。
   2. 「現在のフォルダ」ウィンドウを使用して分析する記録用.wavファイルを含む対象のフォルダに移動します。
   3. 「コマンドウィンドウ」に、「whis_gui」コマンドを入力します。
   4. 新しいwhis-guiウィンドウでは、「Sonogram Parameters」、「Whistle Options」など、さまざまなパラメータを持ついくつかのサブウィンドウセクションを観察します（ 図3 ）。 USVを検出するためのパラメータを調整します。ラボラトリーマウス（ 例えば 、本研究で使用したB6D2F1 / JおよびC57BL / 6Jマウス系統）からのUSVシラブルを検出するために、以下のパラメータ設定を使用する：
   5. [ソノグラムパラメータ]セクションで、 最小周波数を15,000 Hz、 最大周波数を125,000 Hz、サンプリング周波数（周波数の数 ）tに調整しますo 256 kHz、 Thresholdを0.3に設定します。
   6. Whistle Optionsセクションで、 Purity Thresholdを0.075、音節のMin Durationを3 ms、 Min Frequencyスイープを20,000 Hz、 Filter Durationを3 msに調整します。
   7. 他のセクションでは、 Min Note Durationを3 msに、 Min Note Countを1に調整します。
   8. 音節分類プロトコルでは、whis_guiウィンドウの中央セクションのボックスを選択します。
      デフォルトの分類は、Holy and Guo ¹¹とArriaga et al。に基づいています。 ^10であり 、音節をピッチジャンプの数およびジャンプの方向によってコード化している。単純な連続音節の場合はSである。 1つのダウンピッチジャンプのためのD ; 1つのアップピッチジャンプのU; 2つの連続的なダウンジャンプのためのDD ; 1ダウのDUnと1つのアップジャンプ;ユーザーが何も選択しない場合、これがデフォルトになります。ユーザは、代表ボックスのそれぞれを選択することにより、特定の音節タイプに対して分析を実行する選択肢を有する。
      Scattoni、 et al。に記載されている音節分類を選択する。 ⁹では、さらに、このタイプを音節の形状に基づくより多くのサブカテゴリに分けるスプリットのカテゴリを選択します。
      ユーザが高調波の有無に応じて音節をさらにソートしたい場合は、「 高調波 」を選択します。
3. 関心のある.wavファイルの音節を分類する
   1. whis_guiウィンドウの左上のセクションで、1つの録画セッションからすべての.wavファイルを選択します。
   2. whis_guiウィンドウの中央にある "Get sonograms"をクリックします（ 図3 ）。ソンググラムを含む新しいフォルダが、.sngファイル形式で作成されます。上のすべてのソノグラム（.sngファイル）を選択します。ウイソグラムウインドウの下のボックスに「動物ID」と「セッションID」を入力します。次に、プロセスソノグラムをクリックします。
      1. 「動物IDセッションID -Notes.csv」（音節から抽出された音符に関する情報を含む）、「動物IDセッションIDSyllables.csv」（すべての音符の値を含む）の3つのファイルタイプをソノグラムフォルダで観察する。ソノグラムで検出された音節の総数など）、「Animal ID-Session ID -Traces.mat」（すべての音節の図形表示が含まれています）。
         注： "Animal ID-Session ID - 音節"ファイルには、選択されたものよりも複雑であるか、お互いに重なっている2つの動物の音節を持つ未分類のUSV音節の小さなパーセント（2 - 16％）が含まれることがあります。これらは、必要に応じてトレースファイルとは別に調べることができます。

3.音節の音響構造と構文の数量化

注：最初の構文解析の手順については、「READ ME！」に記載されています。 "Song Analysis Guide v1.1.xlsx"ファイルのスプレッドシート、カスタム設計のスプレッドシート計算機E（ 図1 、 表1 ）

1. スプレッドシートソフトウェアD （ 図1 、 表1 ）を使用して、上のセクションで取得したソフトウェアスクリプトCファイル出力 "Animal ID-Session ID -Syllables.csv"を開きます。これには、すべてのソノグラムで検出された音節の総数とそのすべてのスペクトル特性が含まれます。
2. まだ変換されていない場合、スプレッドシートソフトウェアD内で、この値を個々の列に入れるために、この.csvファイルをソフトウェアDの列分離に変換します。
3. ソフトウェアDの中の "Song Analysis Guide v1.1.xlsx"ファイルを開き、thテンプレートシートの指示に従って、このシートに「Animal ID-Session ID -Syllables.csv」ファイルデータをコピー＆ペーストしてください。 'Unclassified'カテゴリの音節を含む行を削除します。
4. 'Unclassified'行を削除した後、最初にO列のISI（音節間）データをコピーしてE列に再計算します。次に、列AからNまでのすべてのデータを 'データ'スプレッドシートにコピーします。
5. データスプレッドシートに、動物ID（列AF）と記録長（分単位、列AC）を入力します。
   注記：動物IDは、録画設定で入力したものと一致する必要があります。ファイルは入力された文字を検出し、.wavファイルの名前と比較します。
6. 「密度ISI」とラベルされたスプレッドシート、「ISIプロット」結果を使用してシーケンスを定義するISIカットオフを決定します。
   注：過去の研究²³では、カットオフを2つのスタンド最後のピークの中心からのrd偏差。それは歌のセッションの中で異なる歌の試合を分けた250ミリ秒以上の長い間隔（LI）から成っていた。
7. 主な結果を「特徴」スプレッドシート（​​各動物から測定されたすべてのスペクトル特徴をグループ化する）で見る。
   注：ユーザがセクション2.8.9で説明したソフトウェアスクリプトCのデフォルトの音節カテゴリ設定を使用した場合、音節は上記のようにさらにChabout、 et al。 ²³ ：1）シンプルな音節、ピッチジャンプなし、«s»; 2）単一の上向き（«u»）ジャンプで分けられた2音節の音節。 3）1つの下向きのジャンプによって分離された2つの音節（«d»）; 4）音符間のピッチジャンプが2つ以上あるより複雑な音節（«m»）。
8. 構文値については、各対の確率を計算する「Global Probabilities」スプレッドシートをクリックしてください次の式²³を用いて、開始音節に関係なく、すべての遷移タイプを推定する。
   P（トランジションタイプの発生）=トランジションタイプの合計発生数/ すべてのタイプのトランジション総数
9. 「条件付き確率」スプレッドシートをクリックして、開始音節に関連する各遷移タイプの条件付き確率を計算します。次の式が使用されます。
   P（開始音節が与えられた遷移タイプの発生）=遷移タイプの発生総数/開始音節が同じであるすべての遷移タイプの合計発生数
10. 上記の遷移確率がnon-randomと異なるかどうか、および^23のアプローチに従った1次マルコフモデルを使用してカスタムソフトウェアFを使用するかどうかをテストするには（ 例えば 、R studioのSyntax decorder; 図1 、strong>表1）に以下のRスクリプトを追加します。異なる条件のグループ内ではTests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Contexts.R。同じ条件のグループ間ではTests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Genotypes.Rを使用します。
11. カイ2乗検定または他の検定を行い、 ^23のアプローチに従って異なる状況（ペアワイズ）で同じ動物の移行確率の統計的差異をテストする。
    注記：グループ間で構文を比較するために使用される統計モデルの詳細は、 ^{23ページを参照して}ください。研究者は、他のアプローチを使用して、自分や他の人が開発したグローバルまたは条件付き遷移確率を分析することができます。
12. 構文図としてシーケンスをグラフィカルに表示するには、ネットワークグラフ作成ソフトウェアG （ 図1 、 表1参照）に値を入力します。ノードは異なる音節候補を指定しますゴリ、および矢印の色および/または厚さの​​ピクセルであり、音節間の確率値の範囲を表す。
    注：わかりやすくするために、グローバル確率グラフでは、遷移確率が0.005以上（偶発事象の0.5％以上）しか示していません。条件付き確率については、「グローバルモデル」における各確率は、1つの特定の音節タイプだけでなく、合計の音節数で除算することを考慮すると、より低い。

4.ソングの種類に対するソングの編集とテストの設定

注：USVの再生は、特定の曲の種類の設定を含む動物の行動反応を実験的にテストするために使用できます。女性の嗜好は発情状態に応じて変化する可能性があるので、女性は以下のように試験前に同じ発情状態にあることを確認する。

1. 再生実験の数日前に性的経験を持つ女性を準備する
   1. エストロ（ウィッテン²⁸効果）を誘発する実験の前に、性別に成熟した雌（7週間を超える）を雄に3週間曝露し、それらを分離ケージ（穿孔された透明な固体プラスチック）に入れて、男性のにおいがするが、性交を妨げる。
   2. 発情周期をモニターし、発情または発情が明白な場合（ ²⁷に示すように膣口およびピンクのサラウンド）、女性を自分のケージに戻します。彼らは翌日にテストする準備が整いました。
2. 再生のために曲ファイルを準備する
   1. 音声処理ソフトウェアH （ 例えば SASLap Pro; 図1 、 表1 ）のコピーアンドペースト機能を使用して、刺激に使用する所望の条件を有する2つの編集済み.wavファイルを作成する。変数としての発声の量を防ぐために、2つのサウンドファイルに同じ数のs（ 例えば、 UR）からの同一または異なる雄/雌からのシーケンスの長さ（曲の試合）を含む。
   2. ソフトウェアHの条件1の曲を含む最初のファイルを開きます。ファイル>スペシャル>ファイルからチャンネルを追加し、条件2からテストする2番目のサウンドファイルを選択します。
   3. 必要に応じてボリュームを視覚的に調整して、2つのファイルのボリュームが互いに一致することを確認します。編集/ボリュームに移動します。
   4. 次に、編集/フォーマット/サンプリング周波数変換に行き、250,000Hzから1,000,000Hzへの変換を選択して、.wavファイルをサンプリング周波数256kHzから1MHzに変換します。この手順は、再生デバイスが.wavファイルを読み取るために必要です。
   5. これらの新しいファイルを再生するテストファイルとして保存します。どの曲がどのチャンネルに入っているかを確認してください（1または2）。分かりやすくするために、 "file name.wav"という名前を付けてください。
   6. Eに行く「フォーマット」>「チャンネルを入れ替えて2つのチャンネルを入れ替えます。スワップされたバージョンを別の名前で保存します。注：これは反対のコピーで、後で 'file name_swapped.wav'という名前のチャンネルが反転したものになります。
3. 再生装置の準備
   1. 再生装置「Y字型迷路」を70％アルコールで洗浄した後、蒸留水で洗浄する。ペーパータオルで乾かしてください。私たちのY-mazeは手作りの不透明な黒いプラスチック製の装置で、長さ30cmの腕と、迷路の先端に2つの穿孔された穴があり、超音波スピーカーを腕の床の高さに合わせることができます（ 図4A ）。
   2. スピーカーが正しい位置にあり、サウンドカードに接続され、カードがコンピュータに接続されていることを確認します。
   3. ソフトウェアを開き、「再生」>「デバイス」を選択し、再生サウンドカードデバイスを選択します。 「ファイルヘッダレートを使用」を選択します。プレイ>プレイリストに移動し、2つのチャを含む興味のあるファイルを読み込みますnnels（ つまり、 "file.wav"）。 「ループモード」を選択します。ビデオレコーダーを迷路の上に設置して、迷路全体をカバーします。
4. 再生実験を行う
   1. 試験雌を迷路に入れ、10分間慣れさせる。 10分後、メスがスタートアームにない場合は、メスをスタートアームに静かに押し戻し、プラスチック分離ウィンドウを閉じます。
   2. 準備されたファイル（ "file.wav"）を選択して、再生して再生します。ビデオレコーディングを開始し、ビデオレコーディングの視野に紙のメモがあるY字型迷路のアーム（ つまり 、左のURまたは右腕のFE）にどのチャンネルが配置されているかを確認します。
   3. 女性がループモードで曲を聴き、所望の分数（ すなわち 5分）の間に迷路を探索できるようにする：これは1セッションである。メスを元の腕に戻します。彼女に次のセッションを準備しながら1分間休ませる。レム蒸留水で尿の痕跡や排泄物を排除する。
   4. "file_swapped.wav"ファイルをロードするビデオ録画のために紙のメモの位置を変更する左のものを右に移動する、またはその逆に移動する1分後にファイルを再生する。 。
   5. テスト中に潜在的なサイドバイアスを検出するために制御するために、合計4セッション×5分のステップ4.4.3〜4.4.4を繰り返します。赤いストップボタンをクリックして、すべてのセッションの終わりに録画を停止します。 70％アルコールと蒸留水で迷路をきれいにする。
   6. 同じ女性と1週間後に異なる曲の模範ですべての手順を繰り返して、結果の信頼性をテストするのに十分な結果を得ます。
   7. 後でビデオを観察し、ビデオのタイマーとストップウォッチを使って、各腕の女性が各セッションに費やした時間を測定します。可能な曲の選好について統計的に結果のデータを分析する。

結果

現在のプロトコルでは、雄のB6D2F1 / Jマウスの声の挙動および構文の変化を特徴付けた。一般に、このプロトコルを使用して、5分間のセッションごとに平均して、男性URに応答して675±98.5の分類音節、FEに615.6±72、AFで450±134、AMで75.6±38.9、および0.2で記録することができた男性URでは±0.1（n = 12雄）。料金は女性URでは〜130音節/分、FEでは約120音節/分、AF文脈では約100音節/分であった（ 図5A ）。男性は、一晩採取した尿と比較して、新しく採取した尿に応答してはるかに大きな量の音節を生成する（10,23）。男性はまた、麻酔した男性または新鮮な男性の尿の存在下ではかなり少なく歌う（ 図5A ）。男性はまた、文脈を越えてレパートリーを変える²³ 。例えば、B6D2F1 / Jオスは、女性の尿状態（ 図5B ）における複数のピッチジャンプ「m」カテゴリの音節の生成。彼らはまた、文脈の向こう側に個々の音節の音響特徴を変える。例えば、B6D2F1 / J男性は女性の尿の文脈ではより高い振幅と帯域幅で音節を、他の女性の文脈では女性の覚醒状態ではより高いスペクトル純度を歌います（ 図6 ）。

このプロトコルは、シーケンスの動的特徴を測定し、構文を変更する手段も提供します。 Ey らによる適合法を用いて、 ^図22では、シーケンス間のギャップを定義するためにISIを使用し（ 図7A ）、その後、ギャップを使用して音節シーケンスの時間的パターンを識別し分析する。我々は、より長い配列の長さが、目が覚めている女性の状況において産生されることを示した（ 図7B ）この技法は、複雑なシーケンス（「m」音節タイプの少なくとも2つの出現によって構成される）対単純シーケンス（「m」タイプの1つまたは全くない、 B6D2F1 / J雄では、尿中の雌の状態が他の雄と比較してより高い比率を引き起こし（ 図7C ）、これは女性の尿状態においてより複雑な音節を生成したことを示し、より多くの配列にわたって。

また、ある音節タイプから別の音節タイプへの条件遷移確率を計算することもできます（「無音」状態からの遷移を含む24種類の遷移タイプ）。異なる文脈では、与えられた開始音節のマウスの遷移タイプの選択が異なり、シンタックスdiv女性の尿状態のersity（ 図8 ） ²³ 。これらの観察は、男性が異なる刺激および経験に応じて発声の音響特徴またはレパートリー構成を変化させることができることを示す以前の報告と一致する4,5,24。

最後に、本プロトコルは、再生を伴う女性の嗜好をテストするための指針を提供する。私たちは、B6D2F1 / Jの女性が、単純な歌よりも複雑な曲（2つ以上の "m"音節を含む）を好むことを発見しました²³ 。ほとんどの女性は、複雑な歌を演奏したY字型迷路の側にもっと頻繁に留まることを選んだ（ 図4B ）。

図1：Sofのフローチャート2つの使用と分析。各プログラムと関連するコードには、本人の身元を説明するのに役立つ文字名が与えられています。 In（）には、私たちのプロトコルで使用する特定のプログラムがあります。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2：雄のマウスの歌を録音するためのセットアップ。 （A）消音録音ボックスの画像で、USVの発声を記録するように設定されています。 （B） 「マウス・ソング・アナライザーv1.3」によって計算された詳細なスペクトル特徴を含む、ソフトウェアA（ 表1 ）を用いて作成された記録の例の超音波像：持続時間、音節間間隔（ISI）、ピーク周波数最小値ピーク周波数max（Pf max）、ピーク周波数開始（Pf start）、ピーク周波数終わり（Pf end）、および帯域幅。 （C）同じ部屋のラボベンチの箱の外側で、消音ボックスの内側で、生きている女性への別の男性の歌唱のソノグラム。私たちの逸話的な観察は、同じ動物の箱の記録は音量が大きく（高強度）、高調波は少ないが、泡のない箱にエコーがないことを示している。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3：「マウス・ソング・アナライザv1.3」のスクリーン・ショット分析に使用できるさまざまなオプションを表示するwhis_guiウィンドウ。示されたパラメータは、男性USVを図に示し、データ分析を表示するために使用されるパラメータである（最小音符時間は3msであることを除いて）。 .com / files / ftp_upload / 54137 / 54137fig3large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4：複雑な曲とシンプルな曲の再生間の女性の選択（A）使用したY字型迷路装置の写真および寸法測定。 （B）複雑な（女性の尿が惹起された）か、より単純な（覚醒された女性が誘発された）同じ男性の歌から、各腕の女性が費やした時間。データは、n = 10のB6D2F1J雌マウスについて平均±SEとして示され、個々の値も示されている。 10人の女性のうち9人が、より複雑な音節/シーケンスソングの選択を示した。 * p <0.05対のスチューデントt検定。 Chabout、 et al。 ²³許可なくblank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5：出現した音節の数と条件を超えたレパートリー （A）異なる文脈における男性の音節生成率。 （B）女性尿（UR）、麻酔女性（AF）、覚醒女性（FE）、および麻酔男性（AM）の存在下で男性のレパートリー組成物。データは、平均±SEMとして示す。 * p <0.03; ** p <0.005; *** BenjaminiおよびHochberg矯正（n = 12の男性）の後の就労後のペアの学生t検定については、p <0.0001であった。 Chabout らの図。 ²³許可なくこの図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図6：異なるコンテキストにおけるスペクトル特性の例 （A）振幅。 *補正後の練習後の生徒t検定ではp <0.025。 （B）周波数範囲または帯域幅。 *：p <0.041; **：p <0.005; ***：補正後にp <0.0001。 （C）音節のスペクトル純度。 * p：<0.025; **：p <0.005; ***：補正後にp <0.0001。略語：女性の尿（UR）、麻酔した女性（AF）、目を覚ました女性（FE）、および麻酔した男性（AM）。 Chabout、 et al。 ²³許可なくこの図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図7：シーケンス測定。 （A）シーケンスを分離するためのISIの使用。短いISI（SI）と中程度のISI（MI）はシーケンス内の音節を分離するために使用され、250 ms（LI）を超える長いISIは2つのシーケンスを分離します。 （B）配列の長さ（配列ごとの音節の数として測定）は、異なる状況で男性によって生成される。 *：p <0.025; ** p <0.005; ***補正後のp <0.0001。 （C）男性が異なる文脈で作った単純な歌より複雑な歌の割合。 * p <0.041; ** p <0.005; ***補正後のp <0.0001。データは、平均±SEM（n = 12男性）として示す。 Chabout らの図。 ²³許可なくこの図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図8：各コンテキストの条件付確率に基づくシーケンスの音節構文図矢印の厚さは、n = 12の男性：P（開始音節が与えられたときの遷移の発生）から平均化された各文脈における遷移タイプの条件付き確率発生に比例する。明確にするために、0.05の確率を下回るまれな遷移は示されていない。 Chabout らの図。 ²³許可なくこの図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、様々な大部分の女性関連刺激に亘って、実験室での雄マウスの求愛発声を収集し、定量し、研究するためのアプローチを提供する。 Chabout、 et al。代表的な結果では、この方法を使用することにより、受信する女性にとって重要な文脈依存の発声および構文を発見することができました。これらの刺激の標準化は、信頼できる数のUSVの収集を提供し、男性の求愛歌とレパートリーの詳細な分析を可能にする。

生きている女性が男性と一緒にいるとき、プロトコルは私たちが発声のエミッタをはっきりと識別することを許さない。しかし、これまでの研究では、このような状況で放出された発声の大部分は男性^26,29人であったことが示されています。同種の（男性または女性の）男性の刺激として、これらの文脈における女性の発声の量は、4,5,22,30と無視できると考えている。しかし、近年の論文では、グループ収容条件^31のエミッタの発声を局在化するための三角測量を用いており、ダイアダ内では女性がUSVの約10％に寄与していることが示されている。本プロトコルでは、麻酔された女性の使用により、ユーザは、彼女の発声をせずに女性の存在下で男性の発声を研究することができる。この最近の研究^31の期待とは対照的に、我々は、FEとAFの条件^23の間に放出された音節の数に差がないことを発見した²³ 。生きた雌が記録に有意に寄与しなかったこと、または雌が麻酔をかけられたfemに対して生存している雌の存在下で声があまり発声されなかった可能性があるエール。それにもかかわらず、将来の実験では、この三角測量法を使用して女性の貢献の潜在的な影響を評価することを検討すべきであると考えている。

私たちが概説したいくつかのステップを実行できる他のソフトウェアがありますが、ソフトウェアA、ソフトウェアBを使用するマウス・ソング・アナライザー・ソフトウェア・スクリプトC、例えば、最近の論文では、ユーザがソノグラムから音響変数を自動的に抽出するか、または手動であったユニットに直接音声変数を抽出することを可能にするVoICEというソフトウェアが提案されているユーザ³²によって選択される。しかし、自動または半自動の配列解析は、我々のアプローチほど詳細ではありません。いくつかの市販のソフトウェアは、音響的特徴を自動的に分析することができるが、音節のアトミックな分類。その後、ユーザは異なる音節をソートしなければならない。 Grimsley、Gadziola、 et al。 ³³は、共通の音響機能に基づいて音節をクラスタリングするが、音節の自動検出を提供しない、テーブルベースの仮想マウスボーカルオルガンプログラムを開発した。彼らのプログラム³⁴は、マルコフモデルを使用して録音された曲から新しいシーケンスを作成するという点でユニークで、簡単な編集よりも高度な機能を備えています。

マウスでの以前のコミュニケーション研究のほとんどはエミッタの側面^35,36に焦点を当てている。受信機の側面を調査した研究はほとんどない30,37,38。再生および識別プロトコルは、Asaba、Kato、 etによって最近記載されたような受信側の側面を研究するための簡単なテストを提供するal。 ³⁹ 。この研究では、著者らは、ここで説明したY字型の迷路の代わりに音響フォームで区切られた2つの選択肢のテストボックスを使用しました。どちらの選択設定にも長所と短所があります。まず、Y字型の迷路は音を一方の腕から他方の腕に分離するのではなく、2つの選択肢のボックスが音を分離します。しかし、Y字型の迷路のデザインを使用することで、動物は同時に演奏される2つの曲をすぐに評価し、好みの曲に向かって移動することができます。それにもかかわらず、再生実験は一般に、実験動物が特定の動物のために生成される発声の意味および機能を決定するのに役立つ。結論として、このプロトコルの技術を習得し、分析した後、読者はマウスUSVの文脈、遺伝学、神経生物学に影響を与える多くの問題に取り組むことができるはずです。

B6D2F1 / Jマウスを使用して、女性関連刺激は、ほとんど常に我々の研究室で試験した男性のUSVを誘発する。それは、強力な統計的分析を得るためには十分な音節（5分で> 100）が必要です。トラブルシューティングのために、USVが記録されていない（または不十分な）場合は、サウンドが記録されていることを確認するために設定をチェックしてください。刺激の導入後にコンピュータスクリーン上でリアルタイムソノグラムを見ることによって、記録中にケージ内で起こっていることの生の検査を行う。それ以外の場合は、性的に成熟した/受容性のある女性に男性を一晩再曝露させてから、数日間または1週間以内にそれらを単独で収容してから再度記録してください。日常的な観察に基づいて、ある男性は（ほぼ完全に5分間）1日に多くの歌をし、次の日はあまりありません。我々は、そのような被験体の変動が生じる理由を知らないが、それはおそらく男性の動機付けまたは季節性であり、女性の尿の発情状態であると推測する。 USVが記録されていない場合は、動物を複数日に記録して、これらの変動効果を拾い上げてください。 Unl私たちは歌の鳥の中で、時間に基づいて歌う量の明白な違いに気づいていません。我々は、男性が7週前にはあまり歌わない（5分で100音節以下）ことを発見した。

ここに示された検出方法は、何千もの音節とすべての音響パラメータを数分で抽出することができます。しかし、どのような自動検出方法でも、バックグラウンドノイズに非常に敏感です。雑音の多い録音（例えば寝具で録音した動物など）のマウスソングアナライザー検出ソフトウェアを使用すると、より柔軟性を持たせるために検出「スレッショルド」を調整する必要があります。しかし、これは偽陽性の音節の数も増加させ、自動検出が失敗する可能性があります。このような状況下では、手作業でコーディングすることができます。

前述のように、発声の数、レパートリー、およびレイテンシーは、歪みに応じて広範囲に変化するため、パラメータ（記録長、刺激、自動音節検出など ）を使用して、統計解析のための最適な記録を保証する。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sound proof beach cooler	See Gus paper has more info on specific kind		Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm):
Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#40011	Includes extension cable
Ultrasound Gate 1216H sound card	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#34175	12 channel sound card
Ultrasound Gate Player 216H	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#70117	2 channels playback player
Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#60103	2 playback speakers
Test cage	Ace	#PC75J	30 x 8 x 13 cm height; plexiglas
plexiglas separation	home made	-	4 x 13 cm plexiglas with 1 cm holes
Video camera	Logitech	C920	logitech HD Pro webcam C920
Heat pad	Sunbeam	722-810-000
Y-maze	Home made	-	Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm):
Tweezers
Software
Avisoft Recorder (Software A)	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10101, #10111, #10102, #10112	http://www.avisoft.com
MATLAB R2013a (Software B)	MathWorks	-	MATLAB R2013a (8.1.0.604)
Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C)	Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B		http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_ v1.3-2015-03-23.zip
Microsoft Office Excel 2013 (Software D)	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Song Analysis Guide v1.1 (Software E)	Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D		http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx
Syntax decorder v1.1 (Software F)	Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - in R studio		https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Graphiz (Software G)	AT&T Research and others		http://www.graphviz.org
Avisoft SASLab (Software H)	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10101, #10111, #10102, #10112	http://www.avisoft.com
Reagents
Xylazine (20 mg/mL)	Anased	-
Ketamine HCl (100 mg/mL)	Henry Schein	#045822
distilled water
Eye ointment	Puralube Vet Ointment	NDC 17033-211-38
Cotton tips
Petri dish