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要約

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

要約

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

概要

疾患の診断のためのいくつかのプラットフォームでは、このようなナノワイヤー、3ナノ粒子、4ナノチューブ、5及びナノファイバー（NFS）6-8のようなナノスケール物質1,2に基づいて開発されてきました。これらのナノ材料は、その独特の物理化学的特性のために高感度のバイオアッセイのための新技術の設計で優れた展望を提供しています。例えば、メソ多孔性酸化亜鉛ナノファイバーは、乳癌バイオマーカーのフェムトモル感度検出のために使用されている。 図9は、最近、二酸化チタン（TiO 2）に基づくナノ材料は、その化学的安定性を考慮すると生体分析アプリケーション10のために検討されている、11無視できるタンパク質の変性、12および生体適合性。13また、TiO 2の表面上のヒドロキシル基が化学修飾および生体分子の共有結合を促進する。14,15柄のTiO 2 THInはフィルム16またはTiO2ナノチューブ17は、表面積を増大させることにより標的タンパク質の検出感度を向上させるために利用されています。しかし、製造工程はかなり複雑であり、高価な装置を必要とします。一方、エレクトロスピニングされたNFSが簡単かつ低コストの製造工程だけでなく、その高い表面積の注目を集めている; 18,19は、まだ、エレクトロスピニングされたTiO 2のNFマットの壊れやすいまたは緩い特性が処理することが困難になり、マイクロ流体デバイスと統合。6,20したがって、TiO 2のNFマットはほとんど生物分析アプリケーション、過酷な洗浄条件を必要特にで利用されませんでした。

この研究では、これらの制限を克服するために、我々は、薄いポリジメチルシロキサン（PDMS）、接着剤層を利用して任意の被処理基板の表面にNFがマット電界紡糸を転送するための新しい技術を開発しました。 Furthermore、我々は成功したTiO 2 NFは、ポリカーボネート（PC）製の遠心マイクロ流体デバイス上にマットエレクトロスピニングの統合を示しています。 C反応性蛋白（CRP）と同様に心筋トロポニンI（のcTnI）の完全に自動化され、敏感な高、および統合された検出は、全血のわずか10μLから30分以内に達成された、このデバイスを使用する。21により組み合わせにNFSおよび遠心プラットフォームの特性の利点は、アッセイは、検出下限で100 ng / mlで（〜0.8 PM）に1 pg / mlで（〜8 FM）から6桁の広いダイナミックレンジを示しCRPおよび37 pg / mlで（〜1.5 PM）の検出限界は100 ng / mlで（〜4 nm）に10 pg / mlで（〜0.4 PM）からダイナミックレンジの0.8 pg / mlで（〜6 FM）のcTnIのため。これらの検出限界は、対応する従来のELISAの結果と比較して〜300〜20倍低いです。この技術は、適切な抗体を用いて、任意の標的タンパク質を検出するために適用することができます。全体的に、このデバイスの共同例えば 、全血を10μl、それは生物学的試料の非常に少量からでも素晴らしい感度で標的タンパク質のまれな量を検出することができるので、ULDは、体外診断薬および生化学的ア ​​ッセイに大きく貢献します。我々は唯一の本研究でELISAを用いた血清タンパク質の検出を示しているが、マイクロ流体デバイスとエレクトロNFSプロトコルの転送と統合技術は、より広く、高い検出感度のための大きな表面積を必要とする他の生化学的反応に適用することができます。

プロトコル

注：血液は健康な個体から採取し、採血管に採取しました。書面によるインフォームドコンセントは、すべてのボランティアから得ました。

TiO 2のNFマットの1製作

  1. 前駆体溶液 22 の調製
    1. 1.5エタノールの混合物中のチタンテトライソプロポキシド（TTIP）のグラム（99.9％、3mL）および氷酢酸（3ml）に溶解し、マグネチックスターラーで30分間、室温（25℃）で溶液を混合します。
    2. エタノール（99.9％）3.64gのポリビニルピロリドン（PVP）の11重量％を溶解し、ホットプレートマグネチックスターラーを用いて1時間、65℃で溶液を攪拌します。
    3. 組み合わせると、ホットプレートマグネチックスターラーで4時間、65℃で2溶液をかき混ぜます。
  2. エレクトロスピニング
    1. 200μmの内側ディアメのステンレス鋼針に接続されたシリンジに調製した溶液を読み込みター。プランジ​​ャーを除去した後、シリンジに直接ソリューションを注ぎます。
    2. 高いDC電圧（15キロボルト）に接地された基板上に配置されたSiウェハ上に10分間0.3ミリリットル/ hrの流速（2 cmの×2センチ）で一定溶液を導入します。エレクトロスピニングの間、針10センチ接地された基板との間の距離を設定します。
  3. NFマットの焼成
    1. 炉内でNFマットを置き、高真空状態（5×10 -5トール）下で3℃/分の傾斜速度で500℃まで温度を上昇させます。
    2. 3時間500℃に温度を維持します。炉内のRT（25℃）に、サンプルの温度をクールダウン。

遠心マイクロ流体ディスクへのTiO 2の統合2 NFマット

  1. ディスクの作製
    1. 3D設計ソフトウェア（ 例えば 、ソルを使用しますチャンバー、チャネル、またはディスクの各層のバルブを描写するidWorksまたは類似）。デザインファイルは、コード生成ソフトウェア（ 例えば 、EdgeCAMのまたは類似）を使用してコンピュータ数値制御（CNC）コードに変換します。指示に従ってソフトウェアを使用して手動23,24注：このデバイスで使用される典型的なチャネル寸法は、x 0.3ミリメートル（幅×奥行）1.0ミリメートルです。
    2. CNCフライス盤のオペレーティングソフトウェアを開きます（ 例えば 、 DeskCNCまたは類似の）およびオペレーティング・ソフトウェアにCNCコードをロードし、順番に以下をクリックしてください： "AUTO" - > "GコードOPENを" - >生成されたCNCコードを選択します。
    3. CNCフライス盤にPC板を取り付け：トップ層とディスク層のためのPC板5ミリメートルのために1ミリメートルのPC板を使用しています。 「START」ボタンをクリックすることで、ディスクの各層を切断するためにCNCフライス盤を実行します。
  2. ディスクへ のTiO 2 NFマット の転送
    1. 30分間真空下で真空チャンバー内-1-トリクロロシランシリコン基板と（トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル）の40μLを含む小さなペトリ皿に置きます。フルオロシランは、気化し、基板上に塗布されます。
    2. 真空チャンバ1の比率とドガ：10で硬化剤とポリジメチルシロキサン（PDMS）プレポリマーを混合します。スピンコート60秒間650 rpmでシリコン基板上にPDMS。
    3. 付着状態を達成するために10分間65℃のオーブン中でシリコン基板上に塗布されたPDMSを硬化します。
      注：硬化時間は、環境条件に応じて変えることができ、接着力は、レオメーターを用いてタック試験によって試験することができます。
    4. ピンセットを使用して、PDMS被覆シリコン上にエレクトロスピニングし、焼成することにより調製TiO 2のNFマットを転送します。その後、手動でフラットなオブジェクト（ 例えば 、ガラススライド）に移したTiO 2 NFのマットの上にコンフォーマルな圧力を適用し、オブジェクトを削除します。置きます4時間、65℃または1時間80℃のオーブン中でこのサンプルは、完全にPDMS層を硬化させました。
    5. 20μlのPDMS /硬化剤混合物と、ディスク内のコート結合反応室（10：1）、接着層として機能するディスク上にTiO 2のNFマットを接続します。
    6. PDMS層上のTiO 2 NFのマットの上にエタノール（99.9％）の50μLを分注し、直径6mmのパンチ穴とNFマットを切断し、20μlのでコーティングされた結合反応室にTiO 2のNFマットをカットを転送前のステップでPDMSの。
      注：このステップでは、エタノールはSi基板からカットTiO 2のNFマットを取り外すために役立つであろう。
    7. 完全にPDMSを硬化させる1時間4時間、または80℃で65℃のオーブン中のTiO 2 NFマット統合ディスクをインキュベートします。
  3. ディスク上 のTiO 2 NFマット の表面改質
    1. Pエタノール中の（3-グリシドキシプロピル）メチルジエトキシシラン（GPDES）（99.9％）のrepare 1％（v / v）の溶液。
    2. 140 W、180秒間50sccmの酸素流量で酸素プラズマでディスクを統合したTiO 2 NFマットを扱います。各ナノ繊維マットの上GPDES溶液100μlを分注し、2時間室温（25℃）でインキュベートします。
    3. 洗浄瓶を使用して、エタノール（99.9％）を分配することによって基板を簡単に洗浄し、その後、ディスクを反転し、クリーンワイプに対してそれをブロッティングによりエタノールを完全に除去します。 1時間80℃で硬化します。上記のように物理的に吸着し、未結合GPDES分子を除去するために、同様にエタノール（99.9％）で2回洗浄します。
    4. ドライ真空下、窒素気流で乾燥ブロー。
      注：ディスクは使用するまで室温（25℃）で密閉容器に保存することができます。
  4. 表面上の抗体の固定化
    1. 捕捉抗体の200μg/ mlの溶液を作製（モノクローナルマウス抗ヒトのhsCRPまたはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）緩衝液（pH7.4）で抗体を希釈したモノクローナルマウス抗のcTnI）。マイクロピペットを用いて、ディスク内の各NFマット上に溶液5μLを分注します。抗体の詳細については、材料のリストを参照してください。
    2. 加湿チャンバー内のディスクを保持し、4時間37℃でインキュベートします。 0.1％BSA-PBS緩衝液でNFマットコーティングされた抗体を洗ってください。マイクロピペットを用いて洗浄バッファー100μlでチャンバーを埋める、吸引またはデカンテーションによってバッファを削除します。最後に、ディスクを反転し、クリーンワイプに対してそれをブロットして、[ディスクを組み立てます。
  5. ディスクアセンブリ
    1. CADプログラム（ 例えば 、AutoCADのまたは類似）を使用した両面粘着テープ上のディスクのデザインを描画します。カッティングプロッタへのCAD設計をロードします。
    2. カッティングプロッタを使用して、両面粘着テープをカットします。両面接着テープの1の保護層をはがし、私を添付ディスク層の上にトン。他の保護層をはがし、ディスク層の上にトップ層を添付してください。
    3. プレス機であらかじめ組み立てられたディスクをロードし、正確に各バルブ、チャネル、およびチャンバを接続するために各層に整列マークを使用して、トップ/接着剤/ディスク層を合わせます。プレス機を使用してコンフォーマルな圧力を適用します。

3.イムノアッセイ

  1. マイクロピペットを用いて、1％BSA-PBS緩衝液でチャンバーを記入し、37℃で1時間ディスクをインキュベートします。マイクロピペットを用いて吸引によりバッファを削除してください。未反応部位をブロックするために、ディスク内のタンパク質の非特異的吸着を低減するために、この手順を実行します。
  2. マイクロピペットを用いて、チャンバーを充填し、吸引することにより、0.1％BSA-PBSで2回洗浄します。
    注：この段階でディスクを使用するまで4℃で保存することができます。
  3. 負荷micropipettを使用してディスク上のCRP検出のための抗原スパイク全血またはCRP無血清10μlの電子。較正グラフを作成するための、100 ng / mlで、1 pg / mlでのCRPの濃度を使用します。そして、のcTnI 10 pg / mlでの100 ng / mlで。
    注：μMの範囲である全血におけるCRPの高いレベルに起因して、CRP無血清は、デバイスの低検出限界を示すために使用されました。
  4. 赤血球を分離するために60秒間3600回転（391 XG）でディスクをスピン。
  5. 3秒間2,400 rpmでディスクを回転させることにより、HRPと結合した検出抗体の8μLを含むチャンバーにレーザー照射によるバルブ＃1、上清の血漿の転送4μlを開きます。
    注：ディスク操作の弁作動および可視化のための一般的なプロセスは、以前の報告書に詳細に記載されている21。
  6. タンパク質および検出抗体の結合のために5秒間混合モード（15 Hzの秒-1、15°）を適用します。
  7. オープンバルブ＃2、および結合反応室にステップ6で調製した混合物を転送（2,400 rpmで、3秒）。その後、混合物とTiO 2のNF上の結合抗体間の免疫反応を達成するために20分間混合モード（60 Hzの秒-1、2°）を適用します。反応後、開弁＃3と廃棄室（2400 rpmで、10秒）に残留混合物を移します。
  8. バルブ＃4を開いて、ディスク（2400 rpmで、4秒）を回転させることにより結合反応室に洗浄緩衝液（600μl）を転送します。その後、チャンバー内でのTiO 2のNFを洗浄するために120秒間混合モード（30 Hzの秒-1、30°）を適用します。
  9. ステップ3.8の同じ条件に従うことによって、二回以上のTiO 2のNFを洗浄し、20秒間2,400 rpmでディスクを回転させることによって、完全に残留洗浄バッファーを削除します。そして、バルブ＃5を閉じます。
  10. 化学発光反応のために、弁＃6及び紡糸を開くことによって、結合反応チャンバーに化学発光基質溶液を移送した後、1分間混合モード（30ヘルツ秒-1、2°）を適用その後10秒間、2400 rpmでディスク。
  11. バルブ＃7を開き、10秒間2,400 rpmでディスクを回転させることにより検出チャンバに反応した基質溶液を移します。
  12. 光電子増倍管（PMT）モジュール装備検出システムを使用して、反応基質溶液からの化学発光シグナルを測定します。
    注：ステップモータ、光学機械部品、並進ステージ、および市販のPMT：検出システムは、次の部品を使用して、カスタムビルドマシンです。光学機械部品やステップモータ装置を保持するように組み立てられ、モータは、ディスクを回転させることができます。検出は光学機械部品に固定されたPMTによって実行され、それは、デバイスの検出チャンバの上方に配置されています。ステップモータを操作することによって、検出チャンバは、右のPMTの検出ゾーンの下に並んでいます。

結果

高感度で全血から、このプロトコルは、タンパク質の検出のための完全に自動化された遠心マイクロ流体デバイスを使用することで調製しました。 TiO 2のNFマットは、エレクトロスピニング及び焼成の方法により調製しました。所望の直径、形態、及び厚さのNFSを製造するために、そのような流量、電圧、紡糸時のような電界紡糸条件を最適化しました。条件...

ディスカッション

TiO 2のNF統合ディスク上のアッセイは、血液の非常に低い量で存在する低豊富なタンパク質の超高感度検出のための、迅速、安価で便利な技術です。この技術は、少量の試料（10μL）を使用することの利点を有しており、同時に複数のサンプルの分析に適しています。これは、多重免疫測定装置として大きな可能性を提供します。デバイスは、従来のELISAに必要とされる血漿分離のよ?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

この作品は、韓国国立研究財団（NRF）の助成金（2013R1A2A2A05004314、2012R1A1A2043747）、韓国の医療技術のR＆Dプロジェクト、保健福祉省（A121994）と韓国政府が資金を提供し、IBS-R020-D1からの助成金によってサポートされていました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Si waferLG SILTRONPolished Wafer, test gradeDia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC) Daedong PlasticPCS#6900Thickness (mm) = 1 and 5 
Titanium tetraisopropoxide, 98%,Sigma-Aldrich205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000Sigma-Aldrich437190
Acetic acidSigma-Aldrich320099
Anhydrous ethanolSigma-Aldrich459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilaneSigma-Aldrich448931
PDMS and curing agentDow CorningSYLGARD 184
GPDESGelest IncSIG5832.0 
EthanolJ T Baker
FE-SEMFEINova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopyThermoFisherK-alpha
3D modeling machineM&I CNC Lab, KoreaCNC milling machine
Wax-dispensing machineHanra Precision Eng. Co. Ltd., KoreaCustomized
Double-sided adhesive tapeFLEXcon, USADFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotterGraphtec Corporation, JapanGraphtec CE3000-60 MK2
Spin coaterMIDASSPIN-3000D
Furnace (calcination)R. D. WEBB COMPANYWEBB 99
Rheometer (Tack test)Thermo ScientificHaake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma systemFEMTOCUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRPHytest Ltd., Finland4C28(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnIHytest Ltd., Finland4T21(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRPAbcam plc., MAab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnIAbcam plc., MAab24460(clone # 16A11)
hsCRPAbcam plc., MAab111647
cTnIFitzgerald, MA30-AT43
Bovine AlbuminSigma-AldrichA7906
PBSAmresco IncE404
Blood collection tubesBD vacutainer367844K2 EDTA 7.2 mg plus blood
collection tubes
SuperSignal ELISA femtoInvitrogen37074
Modular multilabel plate readerPerkin ElmerEnvision 2104
Disc operating machineHanra Precision Eng. Co. Ltd., KoreaCustomized
Photomultiplier tube (PMT)Hamamatsu PhotonicsH1189-210
AutoCADAutoDeskVersion 2012Design software
SolidWorks 3D CAD software SOLIDWORKS Corp.Version 20133D Design software,
EdgecamVero softwareversion 2009.01.06928Code generating software
DeskCNCCarken Co.version 2.0.2.18CNC milling machine software

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