Completamente dispositivo automatizzato centrifuga Microfluidic per il rilevamento di proteine ​​Ultrasensitive da sangue intero

Riepilogo

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Abstract

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO₂ nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO₂ NF mat; transfer-printing of TiO₂ NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

Introduzione

Diverse piattaforme per la diagnosi della malattia sono stati sviluppati sulla base di materiali su scala nanometrica ^1,2, come nanofili, ³ nanoparticelle, nanotubi ^{4, 5} e nanofibre (NFS) ^6-8. Questi nanomateriali offrono ottime prospettive nella progettazione di nuove tecnologie per saggi biologici altamente sensibili per le loro proprietà fisico-chimiche uniche. Ad esempio, mesoporosa zinco nanofibre ossido sono stati utilizzati per la rivelazione sensibile femto-molare di biomarcatori cancro al seno. ⁹ Recentemente, nanomateriali a base di biossido di titanio (TiO ₂₎ sono stati esplorati per applicazioni bioanalitici ¹⁰ considerando la loro stabilità chimica, ¹¹ denaturazione proteica trascurabile , ¹² e biocompatibilità. ¹³ Inoltre, i gruppi idrossilici sulla superficie di TiO ₂ facilitare modificazione chimica e l'attacco covalente di biomolecole. ^14,15 modellato TiO ₂ thin film ¹⁶ o TiO ₂ nanotubi ¹⁷ sono stati utilizzati per migliorare la sensibilità di rilevazione di una proteina bersaglio, aumentando l'area superficiale; Tuttavia, il processo di fabbricazione è piuttosto complessa e richiede attrezzature costose. D'altra parte, NFS elettrofilate stanno ricevendo attenzione a causa della loro elevata area superficiale, così come processo semplice e di fabbricazione a basso costo; ^18,19 ancora, la caratteristica fragile o allentato del NF mat elettrofilate TiO ₂ rende difficile da gestire e integrazione con dispositivi microfluidici. ^6,20 Pertanto, le _TiO2 tappetini NF sono stati raramente utilizzati in applicazioni bioanalitiche, in particolare quelle che richiedono condizioni di lavaggio difficili.

In questo studio, per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una nuova tecnologia per il trasferimento del elettrofilate NF stuoie sulla superficie di un substrato bersaglio utilizzando uno strato adesivo polidimetilsilossano sottile (PDMS). Furthermore, abbiamo dimostrato con successo l'integrazione di elettrofilate TiO ₂ NF stuoie su un dispositivo microfluidico centrifuga in policarbonato (PC). Utilizzando questo dispositivo, una rivelazione sensibile alto, completamente automatizzato e integrato di proteina C-reattiva (CRP) e troponina I cardiaca (cTnI) è stata raggiunta entro 30 minuti da solo 10 ml di sangue intero. ²¹ A causa della combinata vantaggi delle proprietà della FN e la piattaforma centrifuga, il saggio esposti un'ampia gamma dinamica di sei ordini di grandezza da 1 pg / ml (~ 8 fM) a 100 ng / ml (~ 0,8 pm) con un limite inferiore di rilevamento di 0,8 pg / ml (~ 6 fM) per CRP e una gamma dinamica di 10 pg / ml (~ 0,4 pM) a 100 ng / ml (~ 4 nM) con un limite di rilevazione di 37 pg / ml (~ 1,5 pM) per cTnI. Questi limiti di rilevabilità sono ~ 300 ~ e 20 volte inferiore rispetto ai loro corrispondenti risultati convenzionali ELISA. Questa tecnica può essere applicata per la rilevazione di eventuali proteine ​​bersaglio, con anticorpi appropriati. Nel complesso, questo dispositivo could contribuiscono notevolmente alla diagnostica in vitro e saggi biochimici poiché può rilevare rare quantità di proteine ​​bersaglio con grande sensibilità anche da piccole quantità di campioni biologici; ad esempio, 10 ml di sangue intero. Sebbene abbiamo dimostrato solo la rilevazione di proteine ​​del siero utilizzando ELISA in questo studio, la tecnologia di trasferimento e l'integrazione dei elettrofilate NFs con dispositivi microfluidici potrebbe essere più ampiamente applicato in altre reazioni biochimiche che richiedono una grande superficie per alta sensibilità di rilevazione.

Protocollo

NOTA: Il sangue è stato prelevato da individui sani ed è stato raccolto in un tubo di raccolta del sangue. Consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i volontari.

1. Realizzazione di _TiO2 NF Mat

1. Preparazione della soluzione di precursore ²²
   1. Sciogliere 1.5 g di titanio tetraisopropoxide (TTIP) in una miscela di etanolo (99,9%, 3 ml) e acido acetico glaciale (3 ml) e miscelare la soluzione a temperatura ambiente (25 ° C) per 30 minuti su un agitatore magnetico.
   2. Sciogliere 11% in peso di polivinil pirrolidone (PVP) in 3,64 g di etanolo (99,9%) e agitare la soluzione a 65 ° C per 1 ora con un agitatore magnetico a piastra calda.
   3. Combinare e mescolare le due soluzioni a 65 ° C per 4 ore su un agitatore magnetico a piastra calda.
2. electrospinning
   1. Caricare la soluzione preparata in una siringa collegata ad un ago di acciaio inox da 200 micron diame internoter. Versare la soluzione direttamente nella siringa dopo aver rimosso lo stantuffo.
   2. Introdurre la soluzione costantemente ad una velocità di flusso di 0,3 ml / h per 10 min su un Si fetta (2 cm x 2 cm) posto su un substrato a massa ad una tensione continua elevata (15 kV). Durante l'elettrofilatura, impostare la distanza tra l'ago e il substrato a massa a 10 cm.
3. Calcinazione del tappeto NF
   1. Posizionare il tappetino NF in un forno e aumentare la temperatura fino a 500 ° C con una velocità di rampa di 3 ° C / min in condizioni di alto vuoto (5 x 10 ^-5 torr).
   2. Mantenere la temperatura a 500 ° C per 3 ore. Raffreddare la temperatura dei campioni alla RT (25 ° C) nel forno.

2. Integrazione del _TiO2 NF Mat in un Microfluidic disco centrifugo

1. Realizzazione di un disco
   1. Utilizzare il software di progettazione 3D (ad esempio, SolIDWorks o simile) per raffigurano camere, canali o valvole di ogni strato di disco. Convertire i file di progettazione di codice a controllo numerico computerizzato (CNC) utilizzando il codice che genera il software (ad esempio, Edgecam o simili). Utilizzare i software in base al manuale di istruzioni ^23,24. Nota: Le dimensioni del canale tipici usati in questo dispositivo sono 1,0 millimetri x 0.3 mm (larghezza x profondità).
   2. Aprire il software di funzionamento della fresatrice CNC (ad es., DeskCNC o simili) e caricare il codice CNC al software operativo e selezionare la seguente nell'ordine: "AUTO" -> "G codice aperto" -> Selezionare il codice CNC generato.
   3. Fissare la piastra PC sulla fresatrice CNC: utilizzare 1 piastre mm PC per lo strato superiore e piastre PC 5 mm per lo strato del disco. Eseguire la fresatrice CNC per tagliare ogni strato del disco facendo clic sul pulsante "Start".
2. Trasferimento di _TiO2 NF tappetino sul disco
   1. Inserire un substrato di silicio e una piccola capsula di Petri contenenti 40 ml di (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-triclorosilano in una camera a vuoto sotto vuoto per 30 min. Il fluorosilane vaporizza e viene rivestita sul substrato.
   2. Mescolare polidimetilsilossano (PDMS) pre-polimero con un agente indurente in un rapporto di 10: 1 e degasare in una camera a vuoto. Spin-coat PDMS su un substrato di silicio a 650 rpm per 60 sec.
   3. Curare il PDMS stesi su substrato di silicio in stufa a 65 ° C per 10 minuti per ottenere uno stato aderente.
      NOTA: Tempo di polimerizzazione può essere variata a seconda delle condizioni ambientali, e la forza di adesione può essere una prova di virata utilizzando un reometro.
   4. Trasferire il tappetino _TiO2 NF preparato da electrospinning e calcinazione sul silicio PDMS-rivestite utilizzando una pinzetta. Quindi, applicare manualmente una pressione conforme sul _TiO2 NF tappeto trasferito con un oggetto piatto (ad es., Vetrino) e rimuovere l'oggetto. Metterequesto campione in forno a 65 ° C per 4 ore oppure a 80 ° C per 1 ora per curare completamente lo strato PDMS.
   5. Coat camere di reazione vincolanti il disco con 20 microlitri del / indurimento miscela agente PDMS (10: 1), che agisce come uno strato adesivo per fissare TiO ₂ NF stuoia sul disco.
   6. Versare 50 ml di etanolo (99,9%) del TiO ₂ NF mat sullo strato PDMS, tagliare il tappetino NF con una foratura di diametro di 6 mm, e trasferire il taglio TiO ₂ NF tappetino per camere di reazione di legame rivestite con 20 microlitri dei PDMS nel passaggio precedente.
      NOTA: In questo passaggio, etanolo sarà utile per scollegare il NF stuoia taglio TiO ₂ dal substrato di Si.
   7. Incubare la NF stuoia disco integrato TiO ₂ in forno a 65 ° C per 4 ore oppure a 80 ° C per 1 ora per curare completamente il PDMS.
3. Modifica della superficie del TiO ₂ NF mat sul disco
   1. Prepare 1% v / v soluzione di (3-glicidossipropil) silano methyldiethoxy (GPDES) in etanolo (99,9%).
   2. Trattare il disco integrato _TiO2 NF tappeto con plasma di ossigeno a 140 W, il flusso di ossigeno 50 sccm per 180 sec. Dispensare 100 ml di soluzione di GPDES su ogni tappeto nanofibre e incubare a RT (25 ° C) per 2 ore.
   3. Lavare il substrati brevemente dispensando etanolo (99,9%) con una bottiglia di lavaggio, quindi rimuovere l'etanolo completamente invertendo il disco e assorbente contro un panno pulito. Polimerizzare a 80 ° C per 1 ora. Lavare due volte con etanolo (99,9%) nello stesso modo come sopra, per rimuovere le fisicamente adsorbite e non legati molecole GPDES.
   4. Asciugare con un flusso di azoto, a secco sotto vuoto.
      NOTA: Il disco può essere conservato in un contenitore sigillato a RT (25 ° C) fino al momento dell'uso.
4. Immobilizzazione di anticorpi sulla superficie
   1. Fare una soluzione di 200 mg / ml di anticorpi di cattura (monoclonale anti topohsCRP umana o monoclonale di topo anti-cTnI) diluendo gli anticorpi con tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,4). Dispensare 5 ml di soluzione su ogni tappeto NF in un disco utilizzando una micropipetta. Vedi l'elenco dei materiali per ulteriori informazioni sui anticorpi.
   2. Conservare i dischi in una camera umidificata e incubare a 37 ° C per 4 ore. Lavare gli anticorpi rivestiti NF tappeto con lo 0,1% tampone BSA-PBS. Riempire la camera con 100 ml di tampone di lavaggio utilizzando una micropipetta, rimuovere il buffer aspirando o decantazione. Infine, capovolgere il disco e asciugare contro un panno pulito, e poi montare il disco.
5. gruppo disco
   1. Disegnare il disegno del disco su nastro biadesivo utilizzando un programma CAD (ad esempio, AutoCAD o simili). Caricare il disegno CAD al plotter da taglio.
   2. Tagliare il nastro biadesivo con il plotter da taglio. Stacchi un strato di protezione di doppio nastro adesivo e fissare it sulla parte superiore dello strato disco. Staccare l'altro strato di protezione e fissare lo strato superiore sullo strato disco.
   3. Caricare il disco preliminarmente riuniti nella pressa e allineare con precisione i livelli superiore / adesivi / disco utilizzando segni di allineamento in ogni strato per collegare ciascuna valvola, canale, e le camere. Applicare una pressione conforme utilizzare la macchina di pressatura.

3. Immunoassay

1. Riempire le camere con 1% tampone BSA-PBS utilizzando una micropipetta e incubare il disco a 37 ° C per 1 ora. Rimuovere il buffer mediante aspirazione utilizzando una micropipetta. Eseguire questo passaggio per bloccare i siti non-reagito e per ridurre l'adsorbimento non specifico di proteine ​​in un disco.
2. Lavare due volte con 0,1% BSA-PBS compilando ed aspirando le camere con una micropipetta.
   NOTA: A questo punto il disco può essere conservato a 4 ° C fino all'utilizzo.
3. Carico 10 ml di antigene-spillo sangue intero o nel siero privo di CRP per il rilevamento CRP sul disco utilizzando un micropipette. Per rendere i grafici di calibrazione, utilizzare concentrazioni di CRP da 1 pg / ml a 100 ng / ml; e cTnI da 10 pg / ml a 100 ng / ml.
   NOTA: A causa dei livelli elevati di CRP nel sangue intero, che è di solito nella gamma micron, senza siero-CRP è stato utilizzato per dimostrare il limite di rilevamento basso del dispositivo.
4. Girare il disco a 3.600 rpm (391 xg) per 60 sec per separare i globuli rossi.
5. Aprire il rubinetto # 1 per irraggiamento laser, e il trasferimento di 4 ml di plasma surnatante alla camera contenente 8 ml di ricerca degli anticorpi coniugati con HRP facendo girare il disco a 2.400 giri al minuto per 3 sec.
   NOTA:. I procedimenti generali per l'azionamento della valvola e la visualizzazione di funzionamento del disco sono descritti in dettaglio in una precedente relazione ²¹
6. Applicare una modalità di miscelazione (15 Hz s ^-1, 15 °) per 5 secondi per il legame degli anticorpi della proteina e rilevamento.
7. Aprire la valvola # 2, e trasferire il composto preparato al punto 6 alla camera di reazione di legame (2.400 rpm, 3 sec). Quindi, applicare una modalità di miscelazione (60 Hz s ^-1, 2 °) per 20 minuti per ottenere un immunoreaction tra la miscela e gli anticorpi leganti sui TiO ₂ NFs. Dopo la reazione, valvola aperta # 3 e trasferire la miscela residua nella camera di scarico (2.400 rpm, 10 sec).
8. Trasferire il tampone di lavaggio (600 microlitri) alla camera di reazione di legame aprendo la valvola # 4 e girare il disco (2.400 rpm, 4 sec). Quindi applicare una modalità di miscelazione (30 Hz s ^-1, 30 °) per 120 secondi per lavare i _TiO2 NFs nella camera.
9. Lavare le _TiO2 NFs altre due volte seguendo stessa condizione di passo 3,8, e rimuovere completamente il tampone di lavaggio residua facendo girare il disco a 2.400 rpm per 20 sec. Quindi, chiudere la valvola # 5.
10. Per la reazione chemiluminescente, applicare un metodo di miscelazione (30 Hz s ^-1, 2 °) per 1 min dopo il trasferimento della soluzione di substrato chemiluminescente alla camera di reazione di legame aprendo la valvola # 6 e filaturail disco a 2400 rpm per 10 sec successivamente.
11. Trasferire la soluzione di substrato reagito alle camere di rilevamento aprendo la valvola # 7 e girare il disco a 2.400 rpm per 10 sec.
12. Misurare segnali chemiluminescenza dalla soluzione di substrato reagito utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT) sistema di rilevamento attrezzato modulo.
    NOTA: Il sistema di rilevamento è una macchina su misura utilizzando i seguenti componenti: motore di punto, i componenti ottico-meccanici, fasi di traduzione e disponibile in commercio PMT. Le parti optomechanical e il motore passo sono assemblati per tenere il dispositivo, e il motore può ruotare il disco. La rilevazione viene eseguita da PMT fissato sulle parti optomeccanici, e si trova sopra le camere di rilevamento del dispositivo. Manipolando il motore passo-passo, le camere di rilevamento sono allineati proprio sotto la zona di rilevamento di PMT.

Risultati

Usando questo protocollo, un dispositivo di microfluidica centrifuga completamente automatizzato per il rilevamento di proteine ​​dal sangue intero ad alta sensibilità è stato preparato. TIO ₂ tappetini NF sono stati preparati da processi di elettrospinning e calcinazione. Al fine di realizzare NFS di diametro desiderato, la morfologia e lo spessore, condizioni quali la portata, la tensione, e il tempo spinning electrospinning sono stati ottimizzati. Se le condizioni non...

Discussione

Il saggio su TiO ₂ NF disco integrato è una tecnica rapida, economica e conveniente per la rilevazione ultrasensibile di basse proteine ​​abbondanti presenti in molto basso volume di sangue. Questa tecnica ha il vantaggio di utilizzare piccoli volumi di campione (10 microlitri) ed è suscettibile di analisi di campioni multipli simultaneamente. Questo fornisce un grande potenziale come dispositivo di multiplexing immunologico. Il dispositivo ha il vantaggio che non richiede Campione fasi di pretrattament...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Si wafer	LG SILTRON	Polished Wafer, test grade	Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC)	Daedong Plastic	PCS#6900	Thickness (mm) = 1 and 5
Titanium tetraisopropoxide, 98%,	Sigma-Aldrich	205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000	Sigma-Aldrich	437190
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Anhydrous ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	Sigma-Aldrich	448931
PDMS and curing agent	Dow Corning	SYLGARD 184
GPDES	Gelest Inc	SIG5832.0
Ethanol	J T Baker
FE-SEM	FEI	Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy	ThermoFisher	K-alpha
3D modeling machine	M&I CNC Lab, Korea		CNC milling machine
Wax-dispensing machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Double-sided adhesive tape	FLEXcon, USA	DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter	Graphtec Corporation, Japan	Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater	MIDAS	SPIN-3000D
Furnace (calcination)	R. D. WEBB COMPANY	WEBB 99
Rheometer (Tack test)	Thermo Scientific	Haake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma system	FEMTO	CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP	Hytest Ltd., Finland	4C28	(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI	Hytest Ltd., Finland	4T21	(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP	Abcam plc., MA	ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI	Abcam plc., MA	ab24460	(clone # 16A11)
hsCRP	Abcam plc., MA	ab111647
cTnI	Fitzgerald, MA	30-AT43
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
PBS	Amresco Inc	E404
Blood collection tubes	BD vacutainer	367844	K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes
SuperSignal ELISA femto	Invitrogen	37074
Modular multilabel plate reader	Perkin Elmer	Envision 2104
Disc operating machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Photomultiplier tube (PMT)	Hamamatsu Photonics	H1189-210
AutoCAD	AutoDesk	Version 2012	Design software
SolidWorks 3D CAD software	SOLIDWORKS Corp.	Version 2013	3D Design software,
Edgecam	Vero software	version 2009.01.06928	Code generating software
DeskCNC	Carken Co.	version 2.0.2.18	CNC milling machine software