マウスで輪部幹細胞欠損を作成するための単純な機械的手順

要約

次の記事では効果的に輪部幹細胞欠損（LSCD）の持続可能なマウスモデルを作成する簡単な、再現可能な技術を提供します。この動物モデルで試験し、輪部幹細胞疾患の治療の有効性を比較するのに有用です。

要約

輪部幹細胞欠損（LSCD）は、角膜上皮が結膜に置換された後輪部上皮幹細胞の機能不全または損失の状態です。患者は、再発性角膜欠陥、痛み、炎症、および視力の喪失に苦しみます。

以前は、LSCDのマウスモデルを説明し、2他のモデルと比較しました。目標は、両方の模倣、ヒトにおける表現型とは、疾患の病態生理を研究し、新しい治療法を評価することを可能にするのに十分長く続くLSCDの一貫性のマウスモデルを生成することでした。ここでは、技術は、より詳細に説明します。

回転バリでの電動工具は、角膜表面から錆リングを除去するために、または患者における翼状片のベッドを滑らかにするために設計されています。所望LSCDモデルを作成するのに適した装置です。それはのように、小さな目での作業のために、それが適切になる細かいチップで容易に入手できる、使いやすいツールですマウスインチそのアプリケーションは、眼への不必要な外傷を防止し、多くの場合、化学的損傷モデルの場合と同様に、それは、不要な怪我にはなりません。鈍スクレーパとは対照的に、基底膜と上皮を除去します。このプロトコルでは、輪部領域は2回擦過した後、全体の角膜上皮は、角膜縁から角膜縁に剃毛しました。間質損傷を避けるために、注意が上皮は既に削除された後に角膜表面を磨くしないように注意しました。

概要

角膜上皮は角膜の透明性および完全性を維持するために必要とされます。それは、常に角膜や結膜の接合部に輪部の狭いゾーンに存在する上皮幹細胞によって生涯を通じて更新されます。これらの自己再生輪部幹細胞が両方正常および損傷後、角膜上皮の再生に重要な役割を果たしています。これらの幹細胞の部分的または完全な枯渇は、再発性角膜びらん、疼痛、角膜の瘢痕化および血管新生において杯細胞の出現をもたらし、未処理の、角膜失明を残した場合であろう。この条件は、輪部幹細胞欠損（LSCD）として知られており、特発性であり得ます。遺伝性;または起因する化学的または熱的傷害、長期的なコンタクトレンズは着用し、慢性炎症^1-6に取得しました。

LSCDに関する研究は、適切な動物モデルを必要とするだけでなく、模倣、ヒトにおける疾患は、しかし、少なくともで、再現性と持続可能です他の角膜および眼の構造への損傷のマウント。このモデルは、治療を評価し、分子および細胞レベルでの疾患のメカニズムを解明することが必要です。 ¹前に説明したように、回転するバリを使用して、人は簡単上述の利点があり、少なくとも3ヶ月間持続するLSCDのマウスモデルを開発することができます。本研究の目的はLSCDの、簡単な再現性、持続可能なマウスモデルを提示することです。

回転バリが均等に根本的な間質^1を傷つけることなく、上皮を除去する便利なツールです。創傷治癒研究において中心角膜びらん^7,8を誘導するために使用されてきました。マウスでLSCDを作成するためにここに提示された技術は、以前に報告されていません。以前より回復Oで、不均一で傷害特に輪部と複数の変数の表現型^1、9時鈍いスパチュラ結果と上皮を削る方法を導入F正常な角膜上皮^1。鈍スクレーパと異なり、回転バリがよく^7、8、10などの上皮基底膜を除去します。幹細胞を切断するための他の報告された方法は、下にある眼の構造への不要な損傷を引き起こすことができるだけでなく、有意な炎症およびその後の角膜の混濁またはにつながるだけでなく、水酸化ナトリウム、N-ヘプタノール、及び塩化ベンザルコニウムのような化学物質の使用を含みます上皮の扁平上皮化生^11-15。回転バリは、これらの重篤な合併症に関連付けられていません。外科的に輪部上皮を除去し、単独で、または化学物質^10、11、16を使用して、実行することがより困難であり、小さな目と（マウスなどの）薄い輪部上皮を有する動物における最良の選択肢ではありません。また、驚くべきことに、limbectomyはまだ¹⁰の背後にある輪部上皮の一部を残すことができます。

以下に記載された技術は、血管新生のANとLSCDになります患者における完全なLSCDの提示を模倣し、少なくとも3ヶ月¹持続dはconjunctivalization。これは、マウスにおけるLSCDまたは創傷治癒の病態生理、免疫学、および潜在的な治療法を研究することを目指している人に適しています。おそらく、いくつかの修正を加えて、この手順は、ラットまたはウサギ¹⁰で行うことができます。回転バリが効率的に上皮を除去するように、角膜上皮摩耗/創傷および関連する治療または分子生物学的研究に関連する任意の研究に利用され得ます。

プロトコル

動物で行わすべての手順は、視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科文での研究のための協会に準拠しています。 6ヶ月齢のオス/メスC57BL / 6J野生型マウスへフォーティーン四を使用した：10損傷モデルのためのマウスと対照動物として4（無傷角膜を）。

1.動物の準備

1. 100mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジン混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔。麻酔が反映された後、麻酔の深さを確認するためにつま先をつまみます。動物が反応してはなりません。
2. 以前の角膜損傷がないことを確認するために実験を行う前に、スリットランプの下で目を点検します。
3. 眼に1％塩酸テトラカインの低下を植え付けます。 60後 - 90秒、感覚がないことを確認するために、角膜反射をテストします。プロパラカイン塩酸塩0.5％を代わりに使用することができます。
4. 角膜感覚の損失がある場合特定の、静かに目にし、目の周りの毛に5％ポビドンヨードのドロップを置きます。 1分後にドロップを拭き取るか、ツールチップに干渉から髪を防止するために、目の周りの毛の上に広げました。

2.角膜上皮擦過

1. 手術用手袋とガウンを着用してください。無菌回転バリと滅菌ピンセット：必要なツールを準備します。より良い制御のために、曲がったピンセットを使用しています。手順中に滅菌シート上のツールを配置します。
2. 曲がったピンセットを使用して、鼻側から蓋をつかみ、そっと目をproptosingことで目を安定させます。あまりにも多くの圧力を使用しないでください。
3. 手術用顕微鏡下で、二回滅菌回転バリを使用して、輪部領域の周囲360°を剃ります。ラウンドごとに6秒 - 5の速度で角膜輪部の周りに移動します。
   注：バリが1固定速度を持っています。しかし、それは確立された速度で回転するために、「先端ナットは「完全に締めてください。
4. 回転バリで角膜輪部に角膜輪部から全体の角膜上皮を削除します。より良い結果を得るために、循環方式でツールを移動し、それが角膜表面に多少の並列先端の側面で動作するように保持します。上皮はすでに削除されていない再ブラッシング領域によって間質を傷つけないように注意してください。眼の上の任意の圧力を加えないでください。必要に応じてブラシの先端を清掃してください。
5. 角膜上の滅菌リン酸緩衝生理食塩水のドロップを植え付けると柔らかいクリーニングティッシュで任意の切り離された上皮シートを乾いた布で拭き取ってください。
6. もしあれば、残りの上皮を剃ります。
7. 手術中にマウス尾に注意してください。
   注：任意の動きが発生した場合、麻酔の深さが薄れており、さらなる注入が必要です。一次注入量の三分の二の三分の一は十分なものでなければなりません。麻酔薬で動物を過剰摂取しないでください。
8. 別の目でそれらを使用する前に、すべてのツールを滅菌します。

3.完全な上皮削除の確認

1. 角膜に1mg / mlのフルオレセインナトリウムの低下を適用します。 30秒後に角膜をきれいにし、上皮の完全な除去を確認するために、コバルトブルーフィルターを用いて、顕微鏡下でそれを調べます。
   注：上皮欠損と角膜の領域が緑色に可視化されます。

4.ポスト操作のケア

1. 加熱毛布の上に動物を入れて、回復の下ながら（そのケージに、例えば ）安全な場所に保管してください。意識的なものの会社に無意識の動物を保管しないでください。
2. 1％のエリスロマイシン眼軟膏を適用します。これはまた、眼の乾燥を防ぐことができます。アプリケーションに一週間のための抗生物質の日常を続けます。
3. キロブプレノルフィン皮下処置後にし、再び12時間後/ 0.1ミリグラムを注入します。 2日間一日二回の注射を続けます。
4. 麻酔から完全に回復するまで、45分 - 30のための動物を観察します。
   注意：回復の下ながら、腹面に呼吸筋の軽度の運動は、動物の健康を示しています。

結果

この技術を実行した後ヶ月以内に、角膜の100％が（ 図1A。写真は、明視野下でのスリットランプとコバルトブルーフィルターに接続されたカメラで撮影された）表面的な血管新生を開発しました。目の18/20（90％）において、血管新生は、全角膜表面（ 図1A）が関与します。 2/20（10％）で、血管新生が3 4の角膜の象限で観察されたが、それは?...

ディスカッション

この記事では、LSCDのマウスモデルを作成するための再現性と比較的単純な技術が記載されています。注目に値するこのモデルのいくつかの重要な側面があります。まず、化学物質^11を使用^する機種^、12とは異なり、損傷は主に表面上皮（と基底膜）を含み、下層の角膜実質にまたは他の眼内構造への最小限のダメージで。従って、手順を複雑にし、それがより困難輪?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover	Rumex International Co, Clearwater, FL	16-141	0.5 mm burr. Also available from other companies.
Surgical microscope	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M691
Digital camera	Nikon, Thailand
Nikon FS-2 slit lamp	Nikon, Japan
Polyclonal anti-CK12 antibody	Santa Cruz Blotechnology, CA,	SC-17101	1:100 concentration
Monoclonal anti-CK8 antibody	TROMA-I-s, Iowa City, IA	AB_531826	1:50 concentration