간단한 기계 절차 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍을 만드는 방법

요약

다음 문서에서는 효과적으로 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)의 지속 가능한 마우스 모델을 만들 수있는 쉬운, 재생 가능한 기술을 제공한다. 이 동물 모델 시험 및 윤부 줄기 세포 질환에 대한 치료 효능을 비교하기에 유용하다.

초록

윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)가 고장 나 각막 상피는 결막로 치환 한 후, 윤부 상피 줄기 세포의 상실의 상태이다. 환자는 재발 성 각막 결함, 통증, 염증, 시력의 손실을 겪고 있습니다.

이전 LSCD의 쥐 모델을 설명하고 다른 두 모델에 비교 하였다. 목적은 두 모방 인간 표현형 및 질병의 병태 생리학 연구와 새로운 치료법을 평가하는 것을 가능하게하기에 충분히 긴 지속 LSCD 일관된 마우스 모델을 제조 하였다. 여기서,이 기술은 더 상세하게 설명한다.

회전 버와 전동 도구는 각막 표면의 녹 반지를 제거하거나 환자의 군 날개 침대를 원활하게하기 위해 설계되었습니다. 원하는 LSCD 모델을 만들 수있는 적절한 장치입니다. 그것은으로, 작은 눈에 작업에 적절하게 좋은 팁과 쉽게 사용할 수, 사용하기 쉬운 도구입니다마우스입니다. 그 응용이 눈에 불필요한 외상 방지 종종 화학적 손상 모델의 경우와 같이 그것을 원하지 않는 손상을 초래하지 않는다. 무딘 스크레이퍼 반대로, 상기 기저막과 상피 세포를 제거한다. 이 프로토콜에서, 윤부 영역은 두 번으로 연마 한 후, 전체 각막 윤부 상피에서 윤부를 면도 하였다. 기질 부상을 방지하기 위해주의 상피가 이미 제거 된 후 각막 표면을 브러시하지 않도록주의한다.

서문

각막 상피 ​​세포는 각막의 명확성 및 완전성을 유지하기 위해 필요하다. 그것은 지속적으로 각막과 결막의 교차점에서 윤부 - 좁은 영역에 존재하는 상피 줄기 세포에 의해 수명이 다할 때까지 갱신됩니다. 이러한 자기 갱신 윤부 줄기 세포는 모두 일반적으로 부상 한 후, 각막 상피의 재생에 중요한 역할을한다. 이러한 줄기 세포의 일부 또는 전체 고갈 재발 성 각막 미란, 통증, 각막 흉터 및 신생 혈관, 술잔 세포의 모양을 초래할 것이다 치료, 각막 실명을 떠나는 경우. 이 조건은 윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)로 알려져 있고, 특발성 일 수있다; 유전; 나 때문에 화학 물질 또는 열 손상, 장기간 콘택트 렌즈 착용, 만성 염증 ^1-6에 인수했다.

LSCD에 대한 연구는 적절한 동물 모델을 필요로 그뿐만 아니라 모방 인간의 질병이 있지만 최소한으로 재현 및 지속다른 각막과 안구 구조에 손상 마운트. 이 모델은 치료를 평가하는 분자 및 세포 수준에서 질병의 메커니즘을 명확하게하는 것이 필요하다. 회전 숫돌을 사용하여, ^하나 앞에 설명한 바와 같이, 하나의 용이 상기의 이점을 제공하며 3 개월 이상 지속 LSCD의 마우스 모델을 개발할 수있다. 이 연구의 목표는 LSCD의 단순한 재현, 지속 가능한 마우스 모델을 제시하는 것입니다.

회전 버 균등 기본 기질 ^{1 부상없이} 상피를 제거하는 편리한 도구입니다. 이는 상처 치유 연구 각막 미란 ^{(7, 8)을} 유도하기 위해 사용되어왔다. 마우스에 LSCD를 작성하는 저작물을-제시 기술은 이전에보고되지 않았습니다. 이전보다 복원 오와 함께, 덜 유니폼 부상, 특히 윤부 및 더 많은 변수 표현형 ^{(1), (9)에} 무딘 주걱 결과와 상피를 긁어 방법을 소개F 정상 각막 상피 ^1. 무딘 스크레이퍼 달리 회전 버어도 ^{7, 8, 10} 등의 상피 기저막을 제거한다. 줄기 세포를 절단 할 수있는 다른보고 된 방법들은 근본적인 안구 구조에 불필요한 손상을 유도 할뿐만 아니라, 심각한 염증 및 이후 각막 혼탁 또는 원인이 아니라, 수산화 나트륨, N- 헵탄 및 염화 벤잘 코늄 등의 화학 물질의 사용을 포함 상피 편평 상피 화생 ^11-15. 회전 버 이러한 심각한 합병증과 연관되지 않습니다. 수술 단독으로 또는 화학 물질 ^{10, 11, 16를} 사용하여, 윤부 상피를 제거, 수행하는 것이 더 어렵다 작은 눈 (마우스 등) 얇은 각막 윤부 상피 세포와 동물에서 최고의 옵션이 아닙니다. 또한, 놀랍게도, limbectomy는 여전히 ¹⁰ 뒤에 윤부 상피의 일부를 남겨 둘 수 있습니다.

아래 설명 된 기술은 신생 혈관의와 LSCD가 발생합니다환자의 전체 LSCD의 프리젠 테이션을 모방하고 3 개월 이상 ¹ 지속 개발 conjunctivalization. 이 마우스에서 LSCD 또는 상처 치유의 병태 생리, 면역학, 잠재적 인 치료를 연구하는 것을 목표로하는 사람들에게 적합하다. 아마도, 일부 수정과,이 절차는 쥐 또는 토끼 ^(10)에서 수행 할 수 있습니다. 상기 회전 숫돌을 효율적 상피를 제거으로서, 각막 상피는 마모 / 상처와 관련된 모든 치료 또는 분자 생물학 연구에 관한 모든 연구에 이용 될 수있다.

프로토콜

동물에서 수행 모든 절차는 비전 연구에서 동물 사용을위한 비전 및 안과 문 연구 협회을 준수합니다. 6 개월 된 남성 / 여성 C57BL / 6J 야생형 마우스에 열네 4 ~ 사용 하였다 : 열 부상 모델 쥐와 대조군 4 개의 (unwounded 각막을).

1. 동물 준비

1. 는 A 100 ㎎ / ㎏의 케타민 복강 내 주사, 5 밀리그램 / kg 자일 라진 혼합물로 마우스를 마취. 마취 효과를 찍은 후, 마취의 깊이를 확인하기 위해 발가락을 꼬집어; 동물은 반응하지 않아야합니다.
2. 이전 각막 손상의 유무를 확인하기 위해 실험을 실시하기 전에 슬릿 램프 아래에서 눈을 검사한다.
3. 눈 상에 1 % 염산 tetracaine에 방울을 주입. 60 후 - 90 초, 감각의 부재를 확인하기 위해 각막 반사를 테스트합니다. Proparacaine 염산염 0.5 %를 대신 사용할 수있다.
4. 하면 각막 감각의 손실이특정 부드럽게 눈과 눈 주위의 머리에 5 % 포비돈 - 요오드 한 방울을 배치합니다. 1 분 후, 드롭 닦아 또는 공구 팁과 간섭 모발을 방지하기 위해 눈 주위의 머리에 확산.

2. 각막 상피를 연마

1. 수술 장갑과 가운을 착용 할 것. 멸균 회전 버 멸균 핀셋 : 필요한 도구를 준비합니다. 더 나은 제어를 위해, 구부러진 핀셋을 사용합니다. 절차 동안 멸균 시트에 도구를 놓습니다.
2. 절곡 핀셋을 사용하여, 비강 측으로부터 덮개를 잡아 부드럽게 눈 proptosing 의해 눈을 안정화. 너무 많은 압력을 사용하지 마십시오.
3. 수술 현미경 배로 멸균 회전 숫돌을 사용 윤부 주변 360 면도. 라운드 당 6 초 - 5의 속도로 윤부 주위에 이동합니다.
   주 : 버가 하나의 고정 속도를 가지고있다. 그러나, 기존의 속도로 회전하는 상기 "최종 너트"완전 체결한다.
4. 회전 버와 윤부하는 윤부에서 전체 각막 상피를 제거합니다. 더 나은 결과를 위해, 원형 방식으로 도구를 이동하고 각막 표면에 다소 평행의 팁의 측면에서 작동하도록 유지. 다시 칫솔질하지 않음으로써 상피 세포가 이미 제거 된 영역을 기질을 손상하지 않도록주의하십시오. 눈에 어떤 압력을 가하지 마십시오. 필요에 따라 브러쉬를 청소합니다.
5. 각막에 멸균 인산 완충 생리 식염수 방울을 주입하고 부드럽고 깨끗한 티슈로 모든 분리 된 상피 시트를 닦아.
6. 어떤 경우 나머지 상피 면도.
7. 수술하는 동안 마우스 꼬리에주의를 기울이십시오.
   참고 : 움직임이 발생하면, 마취 깊이가 퇴색하고 추가 주입이 필요합니다. 차 주입 볼륨의 3 분의 2로 한 세 번째는 충분합니다. 마취 약물 치료와 동물을 과다 복용하지 마십시오.
8. 또 다른 눈에 사용하기 전에 모든 도구를 소독.

3. 확인 완료 상피 제거

1. 각막에 1 ㎎ / ㎖ 플루 오레 신 나트륨 한 방울을 적용합니다. 30 초 후 각막을 청소하고 상피 세포의 완전한 제거를 확인하기 위해 코발트 블루 필터를 현미경으로 검사합니다.
   참고 : 상피 결손과 각막 영역이 녹색으로 가시화된다.

4. 후 작업 관리

1. 가열 담요에 동물을 넣고 복구 아래에있는 동안 (그 새장에, 예를 들면) 안전한 장소에 보관합니다. 의식이있는 사람의 회사에서 의식이없는 동물을 보관하지 마십시오.
2. 1 % 에리스로 마이신 안과 연고를 적용합니다. 이것은 또한 눈의 건조를 방지 할 수 있습니다. 응용 프로그램을 일주일 동안 항생제 매일 계속합니다.
3. kg 프레 노르 핀 피하 절차 후 다시 12 시간 후 / 0.1 mg을 주입한다. 이틀 동안 두 번 하루에 주사를 계속합니다.
4. 마취에서 완전히 회복 될 때까지 45 분 - 30 동물을 관찰한다.
   노트: 복부 표면에 호흡 근육의 가벼운 운동은 복구 아래에있는 동안 동물의 건강을 나타냅니다.

결과

이 기술을 수행 한 후 한 달 이내에, 각막의 100 %가 피상적 인 혈관 신생 개발 (그림 1A합니다. 사진 밝은 필드와 코발트 블루 필터에서 슬릿 램프에 연결된 카메라로 촬영했다). 눈의 18/20 (90 %)에서, 혈관 신생이 전체 각막 표면 (도 1A)을 포함했다. 2/20 (10 %)에서, 혈관 신생 3-4 각막 사분면에서 관찰 되었으나, 여전히 각막 중심에 도달했다.

토론

이 문서는 LSCD의 마우스 모델을 만들 수있는 재생 가능한 비교적 간단한 기술에 대해 설명합니다. 주목할 가치가이 모델의 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 먼저, 화학 ^{11, 12를 사용하는} 모델과는 달리, 부상 주로 하부 각막 기질 또는 다른 인공 구조물을 최소화 손상 표면 상피 (및 기저막)를 포함한다. 따라서, 절차가 복잡하고 어려워 윤부 줄기 세포를 대상으로하는 간섭의 결과를 평가?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover	Rumex International Co, Clearwater, FL	16-141	0.5 mm burr. Also available from other companies.
Surgical microscope	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M691
Digital camera	Nikon, Thailand
Nikon FS-2 slit lamp	Nikon, Japan
Polyclonal anti-CK12 antibody	Santa Cruz Blotechnology, CA,	SC-17101	1:100 concentration
Monoclonal anti-CK8 antibody	TROMA-I-s, Iowa City, IA	AB_531826	1:50 concentration