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要約

後成の要因は遺伝子発現を調節して B 細胞の機能を調節する遺伝的プログラムと対話できます。体外B 細胞刺激、qRT PCR とハイスループット マイクロ Rna シーケンスおよび mRNA シーケンスのアプローチを組み合わせて、B 細胞のマイクロ Rna と遺伝子発現のエピジェネティックな変調を分析できます。

要約

抗体は、体性 hypermutation (SHM)、クラス スイッチ組換え DNA (CSR) およびプラズマ細胞の分化を含むいくつかの重要な B 細胞の本質的なプロセスを通じて実行されます。近年、エピジェネティック修飾やヒストン脱アセチル化とマイクロ Rna (Mirna) などの要因が後成の要因の機能不全につながる発見されました、図形抗体を B 細胞遺伝的プログラムと対話する示されています。自己抗体の応答。エピジェネティックな変調器への応答における B 細胞におけるゲノム マイクロ Rna と mRNA 発現解析は、B 細胞の機能と抗体の応答のエピジェネティック制御を理解することにとって重要です。ここでは、CSR と形質細胞に分化する B 細胞を誘導、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤 (定) とこれらの B セルを扱うマイクロ Rna と mRNA の発現解析のためのプロトコルを示す.このプロトコルで直接次世代 mRNA シーケンス (mRNA seq) と miRNA seq 技術、ゲノムおよび定量的逆転写 (qRT) 読み取り順序のマッピングを使用して相補的 DNA (cDNA) シーケンス分析-PCR。これらのアプローチで、CSR とプラズマ細胞分化を受ける B 細胞、HDI、エピジェネティックな調節選択的にマイクロ Rna と mRNA 発現を調節して CSR とプラズマ細胞分化を変更を定義しました。

概要

エピジェネティックなマークや、DNA のメチル化、ヒストン修飾、(マイクロ Rna を含む)、非コード Rna などの要因、遺伝子式1を変更することにより細胞機能を調節します。エピジェネティック修飾免疫グロブリン クラス スイッチ DNA 組換え (CSR)、体性 hypermutation (SHM)、メモリー B 細胞や形質細胞、抗体と自己抗体により変調への分化などの B リンパ球の機能を調節します。応答2,3。CSR SHM が高い T に依存し、T 独立した抗原4B 細胞に誘導される活性化誘導シチジン アデノシンデアミナーゼ (援助、 Aicdaとしてエンコード) が批判的に必要です。クラス スイッチ/hypermutated の B 細胞は 1 (Blimp1、 Prdm1としてエンコード)5大量の B リンパ球による成熟タンパク質に批判的に依存しての方法で抗体を分泌する形質細胞に分化します。B 細胞の異常なエピジェネティックな変化異常抗体/抗体応答は、アレルギー反応や自己免疫1,4につながる可能性があります。B 細胞の内因、Mirna などどの後成の要因を理解すると、調節遺伝子発現は、ワクチン開発のために重要ではないが、潜在的な異常抗体/抗体応答のメカニズムを明らかにすることも重要です。

ヒストンのアセチル化と脱アセチル化されてヒストンのアセチルトランスフェラーゼ (帽子) とヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 通常触媒を用いるヒストン蛋白質のリジン残基の変更。これらの変更をクロマチンの増加または減少のアクセシビリティにつながる、さらに許可または DNA と遺伝子発現5,6,の変質するトランスクリプション要因または蛋白質の結合を妨げる7,8. HDAC の抑制剤 (HDI)、hdacs をしたの機能を阻害する化合物のクラス。ここでは、B 細胞の本質的な遺伝子発現プロファイルとその機構上 HDAC の規制に対処するため HDI (バルプロ酸) を使用しました。

Mirna が小さく、非コード Rna 約 18 に 22 ヌクレオチド長でいくつかの段階を経て生成されます。miRNA 宿主遺伝子が書き換えられるとヘアピン プライマリ マイクロ Rna (Mirna-pri)。彼らは、pri Mirna が処理されてさらに Mirna 前駆体 (pre-Mirna) に細胞質にエクスポートされます。最後に、pre miRNAs の胸の谷間を経て成熟 Mirna が形成されます。miRNAs そのターゲット Mrna6、7の 3' 非翻訳領域内の相補的なシーケンスを認識します。転写後サイレンシングは、miRNAs は、増殖・分化・ アポトーシスの10、11などの細胞の活動を調節します。複数 miRNAs 同じ mRNA をターゲットすることができますので、1 つの単一のマイクロ Rna が複数の Mrna を対象可能性のある個々 の値は、miRNAs の集合的な効果を理解するマイクロ Rna 発現プロファイルのコンテキストのビューを持つことが重要です。miRNAs B 細胞の発達と周辺分化段階特異 B 細胞の分化、抗体応答、自己免疫1,4,9に関与することが示されています。3' UTR AicdaとPrdm1miRNAs8の対象にできるいくつか検証済みまたは予測の進化上保存されたサイトがあります。

エピジェネティックな変調では、ヒストンの転写後修飾および Mirna を含む遺伝子式9の細胞型と細胞の段階に特異的パターンを表示します。ここでは、我々 は miRNA と mRNA 発現、CSR およびプラズマ細胞の分化の HDI を介した変調を定義する方法を説明します。CSR と形質細胞分化を受ける B 細胞を誘導するためのプロトコルが含まれますHDI; と B 細胞を治療のためqRT PCR、seq、マイクロ Rna と mRNA seq10、11,12,8,13マイクロ Rna と mRNA 発現を分析するため。

プロトコル

プロトコルの制度的ケアとテキサス大学サンアントニオ校の利用委員会の動物のケアのガイドラインに従います

。

1 CSR、プラズマ細胞分化、HDI 処理マウス B 細胞の刺激

  1. 脾臓細胞懸濁液の準備
    注: マウスを除いて層流フードのすべての手順を実行します。安楽死と郭清。
    1. 、特定病原体フリー c57bl/6 j マウス (8-12 週齢) の CO 2 吸入により安楽死
      2. 。
    2. は、上向き腹部解離性基板上にマウスを置きます。18 ゲージ 1.5 で注射針を使って、マウスのすべての 4 フィートをピンします
      3. 。
    3. 70% エタノールに浸したワイプを使用して皮膚を消毒します
      4. 。
    4. (鉗子と解剖はさみ) (肝臓のすぐ下、腹部の左側) に脾臓を視覚化する胸郭のすぐ下の皮膚をカットするオートクレーブの手術器具の 1 つのセットを使用します
      5. 。
    5. を使用して、別の滅菌鉗子と脾臓を優しく鉗子でクランプし解離性大のすべての接続組織を切断、胃の大彎側下にある脾臓を抽出するはさみはさみ。すべての接続組織を削除することを確認します
      6. 。
    6. は、完全 RPMI1640 培地の 1,000 μ L を含む 1.5 mL 遠心チューブに脾臓を配置 (RPMI 1640 培地を添加した 10% 熱不活化牛胎児血清 (FBS)、2 mM L-グルタミン 100 μ g/mL ペニシリン、100 μ g/mLストレプトマイシン、0.25 μ g/mL アムホテリシン B、50 μ M β-メルカプトエタノール).
    7. は、50 mL ポリプロピレン製円錐形遠心管に 70 μ m の細胞ストレーナーを配置し、セル ストレーナーに遠心チューブから脾臓を注ぐ。15 mL ポリプロピレン製円錐形遠心チューブの先端を使用して、こし器を通して、脾臓を軽くマッシュします。15 に 20 ml の完全培地のセル ストレーナーをすすいでください
      8. 。
    8. 350 x g は 5 分、破棄上澄みでセル スピンダウン
      9. 。
    9. は、脾臓細胞懸濁液から赤血球を削除します。ACK の換散バッファー (脾臓あたり 5 mL) の細胞ペレットを再懸濁します。時折揺れで室温で 4 分間インキュベートし、25 ml の完全培地の癒す
      10. 。
    10. スピン 5 min のための 350 x g でセルと上澄みを廃棄します。1 または 10 の mL の完全培地で細胞ペレットを再懸濁します。診断の実行可能なセルをカウントします
      11. 。
  2. B 細胞分離
    注: 製造元に続く負の淘汰によって特定の B 細胞 ' の指示。非 B 細胞が非 B 細胞 (CD4、CD8、CD11b, CD43、CD49b、CD90.2、Ly-6 C/G (グラム-1)、および TER119) とストレプトアビジン コーティングした磁性粒子に対するビオチン化抗体を除去対象します。
    1. 1 x 10 8 セル/mL の完全培地滅菌 5 mL (12 × 75 mm) ポリスチレン中での 0.25 を 2 mL 細胞懸濁液の準備丸底チューブ。正常ラット血清 (50 μ L/mL) をサンプルに追加します
      2. 。
    2. 追加 50 μ L/mL 分離のサンプルにカクテル。軽くピペッティングにより細胞をミックス アップし、ダウンの 2 - 3 倍で 10 分間室温でインキュベート
    3. は、75 μ L/mL ストレプトアビジン コーティングした磁性粒子をサンプルに追加します。上下に軽くピペッティングして混合物をミックス 2 〜 3 回、2.5 分間室温でインキュベートします
      4. 。
    4. は、完全 RPMI 1640 培地を追加します。優しく上下に 2 - 3 回をピペッティングにより細胞をミックスします
      5. 。
    5. 磁石入り (蓋) なしチューブを置き、上清を新しい 15 mL の円錐管にそのまま B 細胞を含むオフ 2.5 分注ぐのため室温でインキュベートします
      6. 。
    6. は、検定とトリパン ブルー染色を使用して実行可能なセルを数えます。B220 など CD19 B 細胞の表面のマーカーのフローサイトメトリー分析による B 細胞の純度を評価します
      7. 。
  3. B 細胞刺激と HDI 治療
    1. 10 6 セル/mL x 0.3 の最終的な集中で完全な RPMI 1640 中浄化された B 細胞を再懸濁します
      2. 。
    2. は、細胞培養のための 48 ウェル細胞培養プレートを使用します。各ウェルの精製された B 細胞懸濁液 (10 6 セル/mL x 0.3)、大腸菌 IL-4 (最終濃度が 5 ng/mL)、および 0 から LPS (3 μ g/mL 最終濃度) または 500 μ M HDI (バルプロ酸; 1 mL を追加します。VPA).
    3. QRT PCR および高スループット mRNA および miRNA 配列解析のための 60 の h またはフローサイトメトリー解析のため 96 h の CO 2 を 37 ° C、5% で細胞をインキュベートします
      4. 。
  4. CSR と形質細胞分化のフローサイトメトリー解析
    1. 文化の 96 時間後を上下に数回セルをピペッティングして各ウェルから細胞をデタッチします。1.5 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。ベンチトップ遠心分離機を使用して 5 分間 350 x g で細胞をスピンし、上澄みを廃棄します
      2. 。
    2. 1 %bsa と 0.5 ng/mL フルオレセイン (FITC)-を含む HBSS バッファーの 100 μ L で細胞を再懸濁します 抗 - マウス IgM 抗体 (Ab) , 0.2 ng/mL アロフィコシアニン (APC) 共役ヤギ-共役ラット抗マウス IgG1モノクローナル Ab (mAb)、0.2 ng/mL フィコエ リスリン (PE)-2 ng/mL 7-aminoactinomycin、0.2 ng/mL PE Cy7 共役ラット抗マウス CD138 mAb ラット抗マウス B220 mAb を共役 D (7 AAD).
    3. 30 分間室温で暗闇の中で蛍光色素標識された抗体 (ステップ 1.4.2) で細胞をインキュベート
    4. 1 ml 1 %bsa を用いた HBSS のセルを洗浄しています
      5. 。
    5. でベンチトップ遠心分離機および破棄上清を使用して 5 分間 1,500 × g 細胞スピンダウン
      6. 。
    6. は 300 μ L と 1% BSA HBSS の細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を丸底ポリスチレン管に転送します。光の露出を避けるために箔でチューブをカバーします
      7. 。
    7. 単一細胞懸濁液に流れフローサイトメトリー分析を実行します。各補正のサンプルの 50,000 イベントおよびその他のサンプルの 250,000 のイベントを収集します。装置ソフトウェアを使用してデータを分析します
      8. 。
    8. は、パルス形状ゲート (FSC FSC A と SSC A x SSC H x H) を用いた破片やダブレットを排除します。適切なゲートの死んだ細胞を除外する 7 AAD にプロットします
      9. 。

2。高スループット mRNA Seq

文化
  1. 後 60 h メーカーに続く小さな RNA を回復できるトータル RNA 分離キットを使用して 2-4 × 10 6 セルからの総 RNA の抽出 ' の指示。DNase を含む私の治療ステップです
    2. 。
  2. 次の製造業者のバイオアナライザーを用いた RNA の整合性を確認 ' の指示
    3. 。
  3. を使用して、高品質の総 RNA の 500-1,000 ng (RNA 整合性数鈴 > 8.0) RNA seq 商業 RNA と図書館準備サンプル p次のメーカー担当者キット ' の指示
    4. 。
  4. は、アダプターのそれぞれ 6 bp インデックス部分に基づく個々 の mRNA seq ライブラリをプールし、50 bp/シーケンスでライブラリをシーケンスします。メーカーによると高スループット DNA システムを使用して ' s プロトコル
    5. 。
  5. Fastq ファイルの各サンプルを生成する CASAVA をデマルチプレックスするシーケンスを実行した後。マッピングの読み取り、以前に概説した 11 としてのバイオインフォマティクス解析を実行します
    6. 。
  6. は、すべてのシーケンス読み取り自分の参照ゲノム (UCSC マウスのゲノムのビルド mm9) TopHat2 デフォルト設定 14 を使用して合わせます。HTSeq カウントを使用して、すべてのサンプルの遺伝子あたり数を得ることの配置から bam ファイルを処理します
    7. 。

3。高スループット miRNA Seq

  1. 高品質総 RNA の使用 100 ng 1 μ g の準備として手順市販の小さな RNA シーケンス キットを使用して、小さな RNA シーケンス ライブラリの準備のための 2.1
    2. 。
  2. Ligate 退化した 3 '、5 の上にアダプター ′ 商業ライゲーション キットを開始小さな RNA 分子の両端。退化の 5 を縛る '、3 の上にアダプター ′ 商業ライゲーション キットを開始小さな RNA 分子の両端。逆のトランスクリプションによって RNA を cDNA に変換し、市販キットと PCR 増幅による小さな RNA シーケンス ライブラリを増幅します
    3. 。
  3. は、最後の小さな RNA シーケンス ライブラリを分離するのに 6 %tbe ネイティブ ページのゲルを使用します。ブロモフェノール ブルー染料を追跡バンド ゲル (0.5 - 1 cm) の底に近づくまで、200 V で 1 X TBE バッファーでゲルを実行します
    4. 。
  4. ガラス板からゲルを外し、エチジウム ブロマイド (水に 0.5 μ g/mL) で 2-3 分ゲルは UV transilluminator または他のゲルのマニュアル楽器でバンドの視覚化のための清潔な容器にステインします
    5. 。
  5. カットきれいなかみそりを使用して ~ 150 bp のバンドをして 1.7 mL の管にそれを配置します
    6. 。
  6. 製造元ゲル抽出キットを使用して DNA を抽出します
    7. 。
  7. サイズ商業高感度 DNA 分析と最後のライブラリ メーカーあたり商業 dsDNA アッセイと濃度分布を確認 ' 指示します
    8. 。
  8. 増幅と後続のシーケンスを実行、メーカーごとの商業ハイスループット DNA シーケンス システムのライブラリをプール ' s プロトコル
    9. 。
  9. 、メーカーごとの各サンプルに対して fastq ファイルを生成する CASAVA と Demultiplex ' s プロトコル
    10. 。
  10. 各サンプルの小さな RNA シーケンス解析、小さな RNA の位置が合わせ、メーカーごとのちらつきを使用 ' s プロトコル。
    1. RRNA、プライマー、ミトコンドリアなどの汚染物質に配置し、読み取りを削除します
      2. 。
    2. 成熟 miRNA 配列にデータを配置します
      3. 。
    3. ヘアピン ループ シーケンス (miRNA 前駆体) にデータを配置します
      4. 。
    4. その他の小さな RNA シーケンス (fRNA データベースを使用して) 15 にデータを整列します
      5. 。
  11. すべてのサンプルは、定量化、別グループ/サンプル間の差分表現 Mirna を定義します。選択した Mrna または TargetScan 16、小宇宙 17、および PicTar などのオンライン miRNA ターゲット予測ツールを使用して選択の miRNA の対象にできる Mrna ターゲット Mirna を予測 18.
  12. 機能アノテーションまたは経路の解析が必要な場合提出する創意工夫パスウェイ解析 (IPA) に予測された遺伝子やダビデ
    13. 。

4。量的な RT-PCR (qRT PCR) Mrna の miRNAs

  1. mRNA の qRT PCR 解析
    1. RNA の抽出 0.2 5 × 10 から 6 セル次、small RNA を回復することができます商業トータル RNA 分離キットを使用して、メーカー ' の指示。DNase を含む私の治療ステップです
      2. 。
    2. オリゴ dT プライマーを用いた最初繊維の cDNA の統合システムの総 RNA からの cDNA を合成します
      3. 。
    3. 次のプロトコルとリアルタイム PCR マスター ミックス × 2 を使用して、適切なプライマーを qRT PCR による cDNA を定量化: 95 ° C、15 s、40 サイクル 94 ° C の 10 s、60 ° C、30 s、および 30 のための 72 ° C s.
    4. 72 ° C の拡張段階のデータ集録を行い、95 72 から融解曲線解析を行う ° C
  2. miRNA の qRT PCR 解析
    1. 4.1.1 準備したサンプルから分注の RNA
      2. 。
    2. CDNA に RNA を逆転写。次のメーカー商業マイクロ Rna 逆転写キットを使用して ' の指示
      3. 。
    3. は、SYBR グリーン リアルタイム PCR マスター ミックスの 250 nM の成熟 miRNA の前方普遍的な逆プライマーと組み合わせてプライマーを用いたマイクロ Rna のリアルタイム PCR を実行します。 常温
      1. 融解 2 x PCR マスター ミックス、miRNA 固有前方プライマーおよび普遍的な逆プライマー。個々 のソリューションをミックスします
        2. 。 (96 ウェル PCR プレートで使用) 25 μ L あたりよく反応ボリュームの反応混合物の準備次のように
      2. :
        PCR マスター ミックス 12.5 μ L x 2
        miRNA 転送プライマー (2.5 μ M) 2.5 μ L
        普遍的な逆プライマー (2.5 μ M) 2.5 μ L
        RNase 無料 water5 μ L
      3. 96 ウェル PCR プレートに反作用の組合せの追加 22.5 μ L。個々 の板の井戸に cDNA テンプレート (50 pg 3 ng) の 2.5 μ L を追加します
        4. 。
      4. はしっかりと板フィルムをシールします。1,000 x g と部屋の温度で 1 分のプレートを遠心します
        5. 。
      5. リアルタイム サーマルサイクラーにプレートを置き、次のサイクリング プログラムを起動: 95 ° C、5 分、15 94 ° C の 40 のサイクル s、55 ° C、30 s、および 30 のための 72 ° C s.
    4. スプレッドシートを qRT PCR のデータ解析のための ΔΔCt メソッドを使用します。小型核・核小体 Rna Rnu6/RNU61/2 の式、Snord61/SNORD61、Snord68/SNORD68、Snord70/SNORD70 に関連する Mirna の発現をノーマライズします
      5. 。
  3. 統計解析
    1. ペアし、ペアの学生による p 値を決定するために統計分析を実行 ' s t - スプレッドシートを使用してテストし、p 値を考慮する < として 0.05大幅な
      2. 。

結果

組合と B 細胞を浄化のプロトコルを使用して (3 μ g/mL) と IL-4 (5 ng/mL) の 96 h は IgG1 に CSR の 30-40%、形質細胞分化の ~ 10% を引き起こすことができます。プラズマ細胞の分化は ~ 2% に減少に 10-20% に低下した CSR IgG1 を HDI (バルプロ酸 500 μ m) と治療後 (図 1)。HDI 抑制する CSR のさらに後組換え Iμ Cγ1 と成熟した VHDJHの減少数によって確認され?...

ディスカッション

このプロトコルは、B 細胞クラス スイッチや形質細胞分化を誘導するために包括的なアプローチを提供します。エピジェネティックな変調、すなわち HDI; によってその影響を分析するにはこれらの細胞の mRNA および miRNA の表現に HDI の効果を検出します。これらのアプローチのほとんどは、ヒト B 細胞機能と mRNA/miRNA 発現の後成的要因の影響を分析する使用できます。定などのエピジェネテ?...

開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は、NIH 助成金 AI 105813 や AI 079705 (PC) に支えられた、(PC) にループス グラント ALR 295955 でループス研究ターゲット識別のための同盟および関節炎国立研究財団研究は (HZ) に付与します。TS は、xiangya の第 2 UT 医学サンアントニオ校の医学生の訪問プログラムのコンテキストで小児医療センター、第二 xiangya の第 3 病院、中央南大学、長沙、中国によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 miceJackson Labs664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine)Fisher ScientificMT 10-040-CV 
FBSHycloneSH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mLFisher Scientific - HycloneSV3007901 
β-MercaptoethanolFisher Scientific44-420-3250ML
Falcon Cell StrainersFisher Scientific21008-952  
Trypan Blue Stain 0.04%GIBCO/Life Technologies/Inv15250
ACK Lysis Buffer Fisher ScientificBW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line Counting ChamberFisher Scientific02-671-51B
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with CapFisher Scientific14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation KitStem Cell Tech19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box BD Biosciences 305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) AntibodyBioLegend 142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibodyBioLegend103222
7-AAD (1 mg)Sigma AldrichA9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibodyBiolegend103212
Mouse APC-IgG1 200 µgBiolegend406610
FITC anti-mouse IgM AntibodyBiolegend406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 AntibodyBiolegend103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2)Biolegend103208
HBSS 1XFisher ScientificMT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated Fisher ScientificBP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5)Sigma AldrichL2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free)BioLegend574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium saltSigma AldrichP4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety CabinetThe Baker CompanySG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator Thermo Scientific3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205Fisher Scientific15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test TubeFisher Scientific 14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-538-59A
1.7 mL Microtube, clearGenesee22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50mlFisher Scientific06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MTELMICM-6MT
Rotor 6MELMI6M
Rotor 6M.06ELMI6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet ControllerDrummond Scientific4-000-101
25 mL serological pipette tipsFisher Scientific89130-900
10 mL serological pipette tipsFisher Scientific89130-898
5 mL serological pipette tipsFisher Scientific898130-896
48-well platesFisher Scientific07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-RefrigeratedBeckman Coulter366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart BalanceBeckman Coulter366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, RefrigeratedBeckman Coulter369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed AngleBeckman Coulter368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17Fisher Scientific13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer Fisher Scientific02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50)Qiagen217004
Direct-zol RNA MiniPrep kitZymo ResearchR2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)Fisher ScientificBP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50)QIAGEN79254
NanoDrop 2000 SpectrophotometersThermo ScientificND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCRInvitrogen175013897
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-rad 172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25Fisher14-230-244
Microseal 'B' Adhesive SealsBio-RadMSB-1001
MyiQ Optics ModuleBio-Rad170-9744
iCycler ChassisBio-Rad170-8701
Optical KitBio-Rad170-9752
BD LSR II Flow Cytometry AnalyzerBD Biosciences
FACSDiva softwareBD Biosciences
FlowJo 10BD Biosciences
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2943CA
S200 Focused-ultrasonicatorCovarisS200
SPRIworks Fragment Library System I for IlluminaBeckman CoulterA288267
cBot Cluster Generation StationilluminaSY-312-2001
HiSeq 2000 Genome SequencerIlluminaSY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2IlluminaRS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep KitIlluminaRS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3Bioo Scientific5132-05
2200 TapeStationAgilentG2964AA

参考文献

  1. Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
  2. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
  3. Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
  4. Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
  5. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
  6. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  7. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
  8. White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
  9. Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
  10. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
  11. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
  12. Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
  13. Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
  14. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
  15. Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
  17. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
  18. Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).

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