発生する感染性病原体の除去のための手洗いの有効性を試験する方法

要約

感染症の伝染を防ぐために手洗いが広く推奨されています。しかし、どのような手洗い方法が感染症病原体を除去するのに最も効果的であるかに関する証拠はほとんどない。我々は、微生物を除去する手洗い方法の有効性を評価する方法を開発した。

要約

感染症の伝染を防ぐために手洗いが広く推奨されています。しかしながら、一般的な手洗い方法の有効性については、匹敵する証拠はほとんど存在しない。さらに、手洗い法を比較して、感染性病原体を除去するのに最も効果的なものを決定する証拠はほとんどない。感染症発生時に使用される可能性のある手洗いのさまざまなアプローチの証拠を提供するための研究が必要です。ここでは、手から微生物を除去する際の手洗い方法の有効性およびすすぎ水中でのその持続性を評価するための実験方法が記載されている。ボランティアの手を最初に試験生物にスパイクし、次に各手洗い方法で洗浄する。一般に、代理微生物は、ヒト被験体を疾患から保護するために使用される。洗浄後にボランティアの手に残っている生物の数は、変更された「グローブジュース」法を用いて試験される。手はエルツ微生物を懸濁させ、膜濾過（バクテリア）またはプラークアッセイ（ウイルス/バクテリオファージ）による分析に利用できるようにスクラビングされる。手洗いから生成されたすすぎ水は、分析のために直接収集される。手洗い効果は、手洗い後に採取した試料と手洗いをしていない試料との対数減少値を比較することによって定量化する。すすぎ水の持続性は、様々な手洗い方法からのすすぎ水サンプルを、単に水で手洗いした後に採取したサンプルと比較することによって定量化される。この方法は、ヒトボランティアの安全性を維持するために代理生物を使用する必要性によって制限されるが、 インビトロ研究では複製が困難で手洗いの有効性に関する研究ギャップやリンスにおける感染性生物の持続性を補う水。

概要

手洗いは、下痢や呼吸器疾患を含む、特に糞便 - 口腔または空中経路によって伝播される病気の拡大を防ぐために広く推奨されている¹ 。驚くべきことに、石けんと水（HWWS）による手洗いとアルコールベースの手指消毒剤（ABHS）による手洗い方法の有効性に関する比較可能な証拠はほとんどなく、生物を手から取り除く。初期の研究では、手洗い法とは対照的に手洗いの機械的作用が、ほとんどの生物の除去の原因となる可能性があることが分かっている2,3。さらに、手洗い法が最も効果的であるという比較の証拠はほとんどない。非公式の文献レビューでは、石鹸と手の消毒剤の有効性を生物の除去に比較した14の研究が確認された。これらの研究のうち、5人はABHSがより有効であることを見いだした^{4 、}

この限られた証拠は、どの方法がアウトブレイクの状況に最も適切かについて不確実性をもたらしている。例えば2013年から2016年にかけての西アフリカでのエボラウイルス病（EVD）発生時に、いくつかの大規模な国際的対応者が、HWWS、ABHS、または0.05％塩素溶液に関する矛盾した推奨を提供した。世界保健機構（WHO）はHWWSまたはABHS（手が目に見えて汚れていない場合）を推奨しているが、手洗いには0.05％塩素溶液を使用することをMSCは推奨している。 WHOは、他の選択肢がない限り、塩素を使用すべきでないと述べている。なぜなら、それは皮膚18,19,20,21,22によって発せられる塩素要求のため他の方法よりも効果が低いからである。さらに、塩素溶液は、一般に、高濃度の次亜塩素酸塩（HTH）、局所的に生成され安定化された次亜塩素酸ナトリウム（NaOCl）、および苛性ソーダ（ジクロロイソシアヌレート（NaDCC））。西アフリカでのEVD流行に対応してWHOによって委託された体系的なレビューでは、最近、手洗いと塩素による比較の有効性を調査したわずか4件の研究しか見つかりませんでした²³ 。これらの研究でも矛盾する結果が得られましたが、これらの研究では、エボラウイルス10,24,25,26,27に類似した手洗いまたは調査された微生物について、0.05％の推奨塩素濃度を使用していませんでした。したがって、勧告はエビデンスベースであるとは認められず、どの勧告が最も効果的であるかは不明であった。

手洗いの介入は流行病の伝染を予防するための重要なツールであるため、感染病原菌の感染を予防するための手洗いアプローチを比較するためには、さらなる研究が必要です。これらのh洗濯推奨は証拠に基づいていなければならない。したがって、代理人または非感染性病原体を用いて実施される手洗い効力およびすすぎ水の持続性を試験する方法が開発された2,28,29。エボラウイルスの代理としてPhi6を使用し、共通指標生物として大腸菌（Escherichia coli）を使用した試料の結果をここに示す。このプロトコールでは、手洗いの有効性およびすすぎ水の持続性試験が提示される。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

倫理声明：ここに記載されている研究（エボラの代理人としてのPhi6とE.coli ）は、タフツ医療センターとタフト大学の保健科学キャンパス（＃12018）の施設審査委員会によって承認されました。ハーバード大学はTufts Institutional Review Boardにレビューを譲渡しました。

注：このプロトコルを開始する前に、2つのステップを完了する必要があります。第一に、ヒト被験者に安全に使用される研究対象の病原体のバイオセーフティーレベル1（BSL-1）代理または非感染バージョンを特定し、選択する必要がある³⁰ 。生物がヒト志願者の素手に接種するのに使用されるので、このプロトコールにはBSL-1代理または非感染病原体が必要である。第二に、ボランティアを募集したり、実験を開始する前に、地元のインスティテュート・レビュー・ボードの承認を得て、ヒト対象者との研究を行う必要があります。このプロトコルの多くの側面は、関心のある研究課題の具体的なニーズ。

1.適格者を募集する

1. ボランティアを募集するには、掲示板にチラシを掲示し、参加したいと思うかもしれないメンバーにメールを送ってください。これらの発表には、調査目的、連絡先情報、および適格基準が含まれている必要があります。
2. ボランティアと会い、資格を評価してください。ボランティアが18歳から65歳の間で、現在妊娠していないか、抗生物質を服用していないこと、および皮膚損傷/障害、手洗い剤に対する既知のアレルギー、または衛生に関する精神的健康問題の既往がないことを確認します。
3. 適格ボランティアに同意書を読ませてもらう。彼らが提出した質問に答え、ボランティアと捜査官に2部のフォームに署名させる。 1つのフォームを保持し、ボランティアに提供してください。
4. 人口統計情報、人に関する質問を含むベースライン調査を管理する皮膚状態の履歴、最近の手洗い行動に関する情報が含まれる。皮膚炎、皮膚傷害、またはベースライン皮膚異常の兆候がないか手を調べる³¹ 。
5. 関心のある生物（土壌負荷試験と無し試験）ごとに2回の試験セッションを行うようにボランティアをスケジュールします。ボランティアに、個人用製品の使用から混乱を避けるために、試験前に7日間のウォッシュアウト期間中に抗菌製品を使用しないように指示する。
   1. 通常の製品の代わりに使用する抗菌製品（シャンプー、コンディショナー、および石鹸）をボランティアに提供します。頑丈なビニール手袋を用意し、家庭用クリーニング製品などの製品を使用するときは、被服に身に着けるよう指示します。

2.緊急時対応（ソープ、ABHS、0.05％HTH、NaDCC、およびNaOCl溶液）で一般的に使用される手洗い溶液の準備

注：塩素溶液は調製することができます実験の12時間前までに保存されますが、12時間を超えて保存されると劣化します。

1. テストが実施されている状況に関連する石鹸を選択し、購入する。
   注：ほとんどの場合、開発途上国における感染症の緊急事態の場合、これは石鹸です。
2. テストが実施されている状況に関連するABHSソリューションを選択して購入します。
   注：選択されたABHSは、有効性を保証するために、70％以上のエチルアルコールの状況を有するべきである。
3. 0.05％の次亜塩素酸カルシウム（Ca（ClO） ₂ ）溶液を、超純水に顆粒状のCa（ClO） ₂粉末を加えることによって調製する。被験者の数に基づいて必要とされる溶液の量を決定する。
   1. 以下の式を使用して、所定のパーセントの利用可能な塩素を用いて所与の容量の水中に所望量の溶液を調製するのに必要な粉末の量を決定する：
      /files/ftp_upload/55604/55604eq1.jpg "/>
      注：Ca（ClO） ₂粉末は、一般に60〜80％の利用可能な塩素を有する。
4. 超純水に顆粒状のNaDCCパウダーを加えて0.05％ジクロロイソシアヌレート酸ナトリウム（NaDCC）溶液を調製する。
   1. 以下の式を使用して、所定のパーセントの利用可能な塩素を用いて所与の容量の水中に所望量の溶液を調製するのに必要な粉末の量を決定する：
      
      注：NaDCCパウダーは、一般に、約50％の利用可能な塩素を有する。
5. 高純度の水に次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加して安定した0.05％NaOCl溶液を調製する。
   1. メーカーの指示に従って滴定試験法を用いてNaOCl原液の濃度（5〜8％になる可能性がある）を確認する（ 例えば、ヨウ素滴定;ggestedキット）。
   2. 試験方法の結果を用いて、次の式を使用して水に加える溶液の量を計算する：
      
6. 電気塩素化装置、超純水、実験室用塩化ナトリウム（NaCl）を用いて生成した次亜塩素酸ナトリウム溶液を超純水に加え、安定化0.05％NaOCl溶液を調製する。
   1. 製造者の指示に従って電気塩素を使用して、超純水およびNaClで1％塩素溶液を調製する。
   2. NaOCl原液^32の濃度を確認するために、滴定試験法（ 例えばヨウ素滴定）を使用する。
   3. 試験の結果を使用して、次の式を使用して水に添加する溶液の量を計算します。
      
7. cを確認する（ 例えば、ヨウ素滴定法）を用いて塩素手洗い溶液のそれぞれの濃度を測定し、目標濃度（0.045-0.055％）の10％誤差以内になるまで水または塩素源粉末/溶液を添加することによって溶液を調整する。

3.生物と土壌負荷を準備し、接種を組み合わせる

注：以下のサブセクションでは、大腸菌およびPhi6を方法の説明のためのサンプル細菌およびウイルス生物として使用する。

1. 細菌については10×10 ₈ CFU / mL以上、ウイルスについては10×10 ⁷ PFU / mL以上の濃度で試験に使用する生物を調製する。
   1. 大腸菌を調製するには、大腸菌の非病原性菌株をLuria-Bertani（LB）寒天プレート上にストリークし、37℃で24時間インキュベートして単一のコロニーを得る。 4℃で保存する。
      注：これは、実験の数日前。
      1. 実験の開始の1日前に、プレートから単一のコロニーを選び、滅菌ループを用いて10mLのLBブロスに接種する。振盪しながら37℃で一晩インキュベートする。
      2. 実験の朝、一晩の培養物1mLを新鮮なLB培地20mLに加えることにより、新鮮な培養物を開始する。約2.5時間インキュベートして、10 ⁸ CFU / mLを超える細胞密度を達成する。
      3. 分光光度計を使用して、培養物の濃度を推定する。
         注：使用した大腸菌株の標準曲線から以前に確立された変換係数を使用し、10 ⁸ CFU / mLより高い濃度を確保してください。細胞密度が十分に高くない場合は、インキュベーターに培養液を戻し、準備が整うまで再度試験します。
   2. 膜ろ過³⁴を用いて濃度を確認する。
      注：連続希釈を行う。ろ過した溶液がプレート上に数えられるコロニーを生成するようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で培養する（正確な数は使用する培地に依存する）。
      1. 滅菌濾過漏斗および真空接続を用いて、炎および濾過マニホールドを設置する。エタノールでそれらを燃やすことによって鉗子を滅菌する。それらを使用して、グリッドが上になるように0.45μmフィルターをろ過マニホールドに置きます。少量の滅菌PBSでフィルターを濡らします。
      2. ファンネルをベースに置き、ピペット操作またはフィルターに直接注ぐことで処理されるサンプル溶液を加えます。試料全体が膜を通過するまで真空をかける。滅菌PBSで漏斗の側面をすすぎ、再び真空にかける。
         注：サンプルは100μL以上100mL以下でなければなりません。サンプルが10 mL未満の場合は、ろ過前に約20 mLのPBSをろ過ロートに加えてから、サンプルを均一にろ過しますル。
      3. 漏斗を取り外し、鉗子を火炎殺菌し、ベースからフィルターを持ち上げます。グリッドが上になるように、ペトリ皿のLB寒天上にフィルターを静かに置き、フィルターが表面と同一面になるようにします。プレートを逆さにし、37℃で24時間インキュベートする。
      4. 24時間後、インキュベーターからプレートを取り出し、 大腸菌コロニーを数える。 CFU / mLでろ過した溶液の濃度を計算するために、このデータと既知の希釈係数と溶液の容量を使用してください。
   3. 二重寒天オーバーレイ法³⁵を用いてPseudomonas syringae宿主中でPhi6を増殖させる 。
      1. 100μLのPhi6ストック懸濁液および100μlのP. syringae一晩培養液を、6mLの栄養ブロス酵母（NBY）軟寒天（0.3％）に直接加える。 NBY硬寒天（1.5％）を含むプレートに注ぎ、26℃で一晩インキュベートする。実験のために十分な接種材料を生産するのに十分なプレートを準備する約4mLのプレート当たりのウイルス懸濁液の収率を見積もる。
      2. 翌日、柔らかい寒天層の上に5mLのPBSを加える。室温で4時間放置し、ピペットで回収し、0.45μmのフィルターを用いてフィルターする。 4℃で保存する。
         注：このソリューションは、ウイルス接種剤として役立ちます。
   4. 濃度が10 ⁷ PFU / mLよりも大きいことを確認するためにプラークアッセイを使用する。 PBS中のウイルス懸濁液を段階希釈して、100μLがプレート上に数えられた数のプラークを生成するようにする。
      1. 適切な希釈サンプル100μLと一晩宿主培養物100μLを6mLのNBY軟寒天を含むチューブに直接ピペットで入れる。軟寒天をNBY硬寒天上に注ぎ、26℃で24時間インキュベートする。
      2. 翌日、インキュベーターからプレートを取り出し、1プレートあたりのプラーク数を数えます。このデータと既知の希釈factorおよび溶液の容量を測定し、ろ過された溶液の濃度をPFU / mLで計算する。
2. ヒトの血清を模倣するための三者土壌負荷を準備する。
   1. 7.80mg / mLのウシ血清アルブミン、10.92mg / mLのトリプトン、および2.52mg / mLのウシムチンを組み合わせて、必要な量の土壌負荷を生成する。土壌負荷を混合した後、0.22μmフィルターでろ過して滅菌します。使用するまで4℃で保管してください。タンパク質が変性するので、加熱殺菌しないでください。
3. 土壌負荷のない状態で、接種物を混合するために0.9％NaCl溶液を調製する。
4. 試験の直前に、細菌またはウイルス懸濁液68％および土壌負荷32％からなる接種物を調製する。例えば、ステップ3.1.1.2または3.1.3.2の細菌またはウイルス懸濁液1.02mLおよび土壌負荷（ステップ3.2.1）または0.9％NaCl溶液（ステップ3.3）のいずれかの0.48mLを使用する。スワールまたはボルテックスして穏やかに混合します。
   注：この1.5 mL各条件下で各ボランティアに接種物を使用するので、調製した接種物の総量が意図した数の試験に十分であることを確認する。

4.実験のためのボランティアの準備

注：その日に試験される生物および土壌負荷条件を決定する。同じボランティアが複数の条件をテストするために使用されてもよいが、各ボランティアは48時間以内に1回のテストのみを受けるべきである。

1. テストを開始する前に、ボランティアが7日間の抗菌ウォッシュアウト期間を遵守していることを口頭で確認し、皮膚に何らかの不具合や異常がないことを視覚的に確認して、ボランティアの資格があることを確認します。
2. 乱数発生器を使用して、各ボランティアに、このテスト日にサンプリングするために右手または左手のいずれかを使用するように割り当てます。手洗い条件が実行される順序を割り当てます。
   注：たとえば、ABHSは＃3に割り当てられ、3番目に実行されます。
3. 試験の開始時に一回 "洗浄洗浄"を行い、その後の各試験が同等の条件下で行われるように、汚れや油分を除去してください。
   1. クレンジングウォッシュを行うには、ブランクの接種物（LBブロスまたはPBSのみ）を使用し、手洗いをしないでサンプルを採取して、実験の各ステップ（以下のセクション5）を実行します。

5.実験手順

1. 各ボランティアの皮膚のpHを試験するために（変化を制御するために）、手のひら表面の皮膚および指と中指の間のウェブスペースに、平らに傾けられた皮膚pHプローブを置く。電極が皮膚に対して平らであることを確認する。 pH値を記録する。
2. 手をスパイクする。
   1. ボランティアに両手を一緒にカップさせてもらいましょう。慎重に750μLを各手掌にゆっくりとピペッティングすることにより、1.5mLの接種物で手をスパイクする。
   2. ボランティアは、できるだけ小さな摩擦を与えながら、手の表面が接種されるまで、両手を丁寧にこすります。
   3. ボランティアは、30秒間体を離して手を止めて、接種物を乾燥させます。接種物は完全に乾かないかもしれない。
3. 手を洗う。
   1. その後のすべての洗浄ステップでは、手のすすぎ水を大きなサンプル収集バッグに入れてください。このバッグに4.5mLの12％チオ硫酸ナトリウム溶液を添加し、2時間以内に塩素を接触させて中和する。
      注：チオ硫酸ナトリウムは、生物に及ぼす影響を管理するために、すべてのサンプル（塩素を含まないものも含む）に添加する必要があります。
   2. 接種後（セクション5.2）、指定された順序で次の方法で手を洗う。
      1. コントロールAの場合、手洗いのステップを実行せず、直接ステップ5.5。
      2. 対照Bについては、既知の流量の漏斗を通して室温（約21℃）で超純水のみで手を洗う。
         注：ここでは、1.5L / mの流速および500mLの水を使用した。
      3. 石けんで手洗いする場合は、10mLの超純水で手を湿らせます。ボランティアに石鹸で手を泡立て、20秒間手を振ってください。 1.5L / mの流速で漏斗を通して室温で超純水500mLを注いで手を洗う。
      4. すべての塩素溶液（ABHS、HTH、NaDCC、NaOClなど）については、200 mLの塩素溶液を1.5 L / mの流速で漏斗に注ぎ、ボランティアに完全に手を触れさせます。
4. 変更された手袋ジュース手順を使用してハンドリンス。
   1. 手洗いをした後、すぐに各ボランティアの手（ すなわち、右手または左手のtesti手順4.2でng）を、75mLの溶離液（ 例えば、 PBS）を含むサンプルバッグ中に入れ、手袋に入れる。バッグの上部を手首にしっかりとつかんでください。
      注：手洗いに使用される塩素を中和するのに十分なチオ硫酸ナトリウムを含むサンプリングには溶離液を使用してください。 PBSは、多くの生物に適した一般的に使用される溶離剤です。
   2. ボランティアは30秒間、溶液の中に手をこすりつけ、指の間と手のひらの下に手を触れてください。袋の外側から30秒間静かに手をマッサージして、手全体が溶出液中で完全にすすぎ落とされていることを確実にします。
   3. バッグを密封し、2時間以内に第6項に記載の適切なアッセイに従ってそれを処理する。
5. 汚染除去。
   1. 各手洗い方法でプロセスを繰り返す前に、ボランティアに石鹸と温水でシンクで手を洗ってもらいます。ボランティアをスプレーする70％エタノールでrs '手を両側に塗布する。それらを乾燥させる。
   2. 手順4.2（ 図1 ）でランダムに選択した手のみを使用して、各手洗い条件についてセクション5のすべてのステップを繰り返します。

6.定量

1. 選択された生物（ 例えば、上記のセクション3.1.2および3.1.4で説明した細菌の膜濾過またはウイルスのプラークアッセイ）に適したアッセイを実施する。
2. プレートを計数した後、分析の各試験について推定CFU / mLまたはPFU / mLを記録する（第3.1.2項および第3.1.4項）。

7.分析

1. ステップ6.2の結果を使用して、各生物および土壌負荷状態、および各被験者および手洗い方法について、手の生物の対数減少値を計算する。
   1. 手洗い効果については、それぞれの細菌/ウイルスの濃度を比較するサンプルを手洗いしてA（手洗いなし）にする。すすぎ水の持続性については、各すすぎ水サンプルを対照B（水のみで洗浄）と比較する。次の標準式を使用します。
      ログ削減（手洗い ）=
      対数削減（すすぎ水 ）=
      注記：ログの減少は、ログ₁₀ （手洗いなし） - ログ₁₀ （手洗い付き）
2. 重要なモデルの手洗い方法と事後的TukeyのHSD試験との間の計算された対数減少値の有意差を評価するために、一方向反復測定分散分析（ANOVA）を使用して、有意差（p <0.05）ef "> 36。
   1. ANOVAを実行する前に、各データセットの真球性を評価します（ 例： Bartlett検定を使用）。試験で真球度が違反していると表示された場合は、補正（ 例 ：温室効果ガス補正）を適用してください³⁷ 。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

ここでは、プロトコル（ 図1 ）は18名のボランティアで完了し、各ボランティアは大腸菌とPhi6の両方を用いて試験した。土壌負荷の有無にかかわらず大腸菌による手洗い結果と土壌負荷によるPhi6との間に有意な差が見られた（ 図2および図3 ）。土壌負荷のない大腸菌では、HTH、Na...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

The method described here provides an approach for testing handwashing efficacy in a controlled laboratory setting. This method highlights the use of human volunteers and surrogate, non-infectious organisms. Using the method, it was possible to demonstrate differences in: 1) the efficacy of handwashing methods and 2) organism persistence in rinse water. The purpose of presenting this protocol is to provide a general framework that can be adapted to test a wide range of surrogate organisms and handwashing methods relevant...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soap bar	Dove	White Beauty Bar soap
Alcohol-based hand sanitizer	Purell	Advanced Instant Hand Sanitizer with 70% Ethyl Alcohol
HTH Powder	Acros Organics	300340010
NaDCC Powder	Medentech	Klorsept granules
NaOCl Solution	Acros Organics	419550010
Electrochlorinator	AquaChlor
Iodometric titrator	Hach	1690001
Bovine serum albumin	MP Biomedicals	NC0117242
Tryptone	Fisher	BP1421-100
Bovine Mucin	EMD Milipore	49-964-3500MG
0.22 µm Filter	EMD Milipore	GVWP04700
NaCl	Fisher	BP358-1
Skin pH probe	Hanna Instruments	H199181
Large Whirlpak Sample Bag	Nasco	B01447WA
Small Whirlpak Sample Bag	Nasco	B01323WA
Funnel bottle	Thermo Scientific	3120850001	You may drill an appropriately sized hole in the lid of a bottle to form a funnel that will dispense water at the appropriate flow rate
Ethanol	ThermoScientific	615090010	Mix with water to produce 70% ethanol
Spray bottle	Qorpak	PLC06934
E. coli	ATCC	25922
LB Broth	Fisher BioReagents	BP1426-2
LB Agar	Fisher BioReagents	BP1425-500
Sterile loop	Globe Scientific	22-170-204
Phi6	HER	102
Nutrient broth	BD Difco	BD 247110
GeneQuant 100 Spectrophotometer	General Electric	28-9182-04
Sodium thiosulfate	Fisher Chemical	S445-3
Membrane filter (47 mm, 0.45 µm)	EMD Millipore	HAWP04700
m-ColiBlue24 broth media	EMD Millipore	M00PMCB24
Petri dish with pad (47 mm)	Fisherbrand	09-720-500
Vacuum Manifold	Thermo Scientific/Nalgene	09-752-5
Filter funnels	Thermo Scientific/Nalgene	09-747
Pseudomonas syringae	HER	1102
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	10010031	Solution may also be mixed from source compounds according to any basic recipe