ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析

要約

このプロトコールは、2％エタノールで24時間処理したゼブラフィッシュ幼虫からの肝臓の組織学的分析を記載する。このような急性エタノール処理は、肝臓脂肪症および肝臓血管系の腫脹をもたらす。

要約

アルコール性肝疾患（ALD）は、急性または慢性のアルコール乱用による肝臓の損傷を指す。これは、アルコール関連の罹患率および死亡率の主要な原因の1つであり、米国では200万人を超える人々に影響を与える。アルコール誘発肝障害の根底にある細胞および分子メカニズムのより良い理解は、ALDの有効な治療法を開発するために重要である。ゼブラフィッシュの幼虫は、2％エタノールへのわずか24時間の曝露後に肝脂肪症および線維形成を示し、急性アルコール性肝障害の研究に有用である。この研究は、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理の手順を記述し、それが肝臓血管の脂肪症および腫脹を引き起こすことを示している。ゼブラフィッシュの幼虫肝臓の組織学的分析のために最適化されたヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色の詳細なプロトコールも記載されている。 H＆E染色は、免疫蛍光よりもいくつかのユニークな利点があります。細胞外成分を同時に検出することができ、脂肪症および線維症などの肝障害を容易に検出することができる。毒素およびウイルス誘発肝臓損傷ならびに遺伝性肝疾患のモデリングにおけるゼブラフィッシュの使用が増加していることを考えると、このプロトコールは、これらの研究すべてにおいて実施された組織学的分析の参考となる。

概要

アルコール過多によって引き起こされるアルコール性肝疾患（Alcoholic Liver Disease：ALD）は、アルコール関連の罹患率および死亡率の主要な原因である。米国では、肝疾患の死亡のほぼ半分がアルコール^1を含み、ALDは3回の肝臓移植^2のほぼ1つを担っている² 。 ALDには広いスペクトルがあります。肝細胞における過剰脂質蓄積を特徴とする脂肪症は、飲酒の初期段階で起こり、アルコール使用の停止時に可逆的である。遺伝的および環境的要因および継続的アルコール摂取の影響下で、肝臓脂肪症はアルコール性肝炎および結局は肝硬変に進行することがある³ 。げっ歯類のALDモデルを用いた研究では、この疾患に対する十分な洞察が得られているが、限界がある（文献³ ）。アルコール飼料の経口給餌は、げっ歯類^{4 、5} 。炎症および線維化の発症には、侵襲的かつ技術的に挑戦的な第2の傷害^6,7または慢性胃内注入が必要である^8,9 。また、腸骨ジストロフィーは、慢性および急性のアルコール処置10,11,12,13,14,15の両方に応答して肝損傷を発症する。特に、幼虫ゼブラフィッシュは、急性アルコール性肝臓損傷10,11,13,15を研究するための魅力的な補完的モデル生物である。ゼブラフィッシュの肝臓は機能的であり、エタノール代謝の主要な酵素を4日で産生するゼブラフィッシュ幼虫^{13,15 で}肝臓脂肪症および線維形成反応を誘発するには、エタノールを2％エタノールに24時間暴露すれば十分です。

2％エタノールで24時間処理すると、ゼブラフィッシュの幼虫^13の組織エタノール濃度が80mMになることが報告されている¹³ 。他の者は、幼虫がこの濃度を許容し、処置動物に見られる肝表現型がエタノール暴露に特異的であることを示した11,13,15,18。しかしながら、ヒトでは80mMがほぼ致命的であるため、エタノール処理されたゼブラフィッシュの肝組織像を評価し、人間との生理学的関連性を明らかにする。

ゼブラフィッシュの幼虫の急速な外部発生および半透明は、肝臓内のアルコールの作用をリアルタイムおよび固定サンプルで特徴付けることを可能にする。細胞型特異的蛍光トランスジェニック系統の利用可能性と共焦点顕微鏡法の最近の進歩により、異なる肝細胞型が急性エタノール処理11,15に応答して形態および挙動をどのように変化させるかの研究が容易になる。しかし、蛍光トランスジェニックゼブラフィッシュの共焦点イメージングは​​、肝臓組織学を研究する場合、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を完全に代用することはできない。トランスジェニックゼブラフィッシュを用いて全ての肝臓細胞型を同時にマーキングするには、個々のトランスジェニック系統を作製する必要があり、それぞれが固有のフルオロフォアを有する肝臓細胞型を標識する。異なるトランスジェニック背景を同じ魚に導入するには、ブリーディングが必要ですg世代を必要とし、時間とコストがかかる。細胞外マトリックス成分を検出するためには、さらなる免疫蛍光染色が必要である。一方、H＆E染色は、同時に全ての肝臓細胞型および細胞外マトリックス成分を標識し、肝臓の概要を提供する。さらに、肝細胞死、脂肪症および線維症などの肝疾患のいくつかの組織病理学的特徴を容易に明らかにする。 H＆Eは哺乳動物の肝臓組織学におけるルーチンの染色であるが、ゼブラフィッシュの肝臓研究では一般的に使用されておらず、プロトコールはあまり確立されていない。

この研究は、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理およびH＆E染色によるフォローアップ組織学的分析のためのプロトコールを記載する。 H＆E染色プロトコールは、肝臓の発達および機能に関するすべての研究に使用することができる。さらに、パラフィン切片は、免疫組織化学ならびに他の特別なスタチンのために使用することができるTrichrome stain、reticulin stain などの肝臓の病理学的特徴

プロトコル

AB WT成体および幼虫ゼブラフィッシュは、実験動物のケアおよび使用のためのガイド（National Institutes of Health刊行物86-23、1985年改訂）に従って、標準的な条件下で維持された²¹ 。それらの使用はシンシナティ児童病院メディカルセンター（CCHMC）の機関動物管理および使用委員会によって承認された。

1.ソリューションの準備

1. 卵の水を準備する。
   1. 市販の海塩40gを1リットルの二重蒸留水（ddH ₂ O）に溶解してストック塩溶液を調製する。すべての塩が完全に溶解するまでかき混ぜる。
   2. 100mLのddH ₂ Oに0.1gの粉末を加えることによって0.1％メチレンブルー溶液を調製する。
      注意：メチレンブルーは、目や皮膚に触れた場合には刺激剤です。粉体を取り扱うときは、常にラボコートと手袋を着用してください。
   3. 28.125mLのストック塩をこのように混合する。溶液と7 mLのメチレンブルー溶液を50 mLコニカルチューブに入れます。よく混ぜます。この混合物を15LのddH ₂ Oに加える。十分に振盪し、室温で保存する。
2. 100mlのddH ₂ Oに12.1gのトリス粉末を添加して100mlの1M Tris-HClを調製する。塩酸（HCl）を用いてpHを9.0に調整する。
   注意：HClを吸入すると、重度のやけどや粘膜刺激を引き起こすことがあります。常にラボコートと手袋を着用し、ケミカルフードでストックボトルを取り扱う。
3. 0.4％トリカイン（エチル3-アミノベンゾエートメタンスルホネート）溶液を調製する。
   1. 2gのトリカイン粉末を489.5mLのddH ₂ Oに溶解する.10.5mLのTris-HCl、pH9溶液を加える。全ての粉末が溶解するまで攪拌棒で混合する。 pH 7.0に調整する。
      注意：トリカインパウダーは呼吸器の刺激物となります。粉末を取り扱うときは、常に埃マスクを着用してください。
   2. 45mLのトリカイン溶液を50mLコニカルチューブに分注する。ソルティオを保つ直ちに使用する場合は4℃で、長期保存する場合は-20℃で保存してください。
4. ガラス製の瓶中で95％エタノール30mL、37％ホルムアルデヒド10mL、氷酢酸2mLおよびddH ₂ O20mLを混合することにより、Dietrichの固定剤を調製する。旋回させてよく混合し、室温で保存する。
   注意：ホルムアルデヒドは発癌物質と思われ、ホルムアルデヒドを含む溶液は化学フードで使用する必要があります。氷酢酸は、重度の皮膚の火傷および眼の損傷を引き起こす可能性がある。常にラボコートと手袋を着用し、ストック溶液をケミカルフードで取り扱います。ホルムアルデヒド、氷酢酸、および95％エタノールはすべて可燃性液体であり、指定の可燃性キャビネットに保存する必要があります。
   注：Dietrich固定液は室温で1年間安定です。
5. 塩化ナトリウム（NaCl）80g、塩化カリウム（KCl）2g、リン酸二ナトリウム（Na ₂ HPO ₄ ）14.4g、および2を加えて、10倍リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液1Lを調製する。4gのリン酸一カリウム（KH ₂ PO ₄ ）を800mLのddH ₂ Oに添加する。水酸化ナトリウム（NaOH）を用いてpH7.4に調整し、1Lの最終容量にddH ₂ Oを加える。 1分間パージし、121℃で20分間インキュベートする液体サイクルでオートクレーブした後、この溶液を室温で保存する。
6. 100mLの10倍PBS溶液をddH ₂ O 900mLで希釈して1LのPBS 1Lを調製する。オートクレーブ後、振盪して室温で保存する。
7. 胚をマウントするためにガラス培地ボトルに3％アガロースを調製する。
   1. 3gのアガロースを100mLのddH ₂ Oに加え、渦巻き混合する。アガロースを溶解するためにマイクロ波で混合物を加熱し、沸騰が最小限であることを確実にするために加熱中に注意深く観察する。
      注意：短い加熱にもかかわらず、電子レンジから取り出したときにボトルが熱くなる可能性があります。電子レンジからボトルを取り外すには、保護手袋またはミットを使用してください。
   2. 電子レンジからボトルを取り出します。穏やかに旋回しながら、完全に溶解していない結晶を探します。結晶がない場合、その溶液は使用の準備ができている。 3％アガロースを室温で保存し、使用前に再度加熱する。
8. ハリスヘマトキシリン原液を濾過して、沈殿した固形物を除去する。
   1. フィルターが円錐を作るように、コーヒーフィルターを半分に折りたたみます。液体がフィルタを通過するようにサイドパネルを開き、ゴミを引っ掛けます。
   2. フィルターを漏斗の中に置き、漏斗をガラス媒体ボトルに入れる。徐々にストックヘマトキシリンをフィルターに注ぎます。
      注意：ヘマトキシリンは、眼に入った場合、摂取した場合、吸入した場合には危険です。常にラボコートと手袋を着用し、ストック溶液をケミカルフードで取り扱います。
9. 250mLのddH ₂ Oに125μLの12N HClを添加することにより0.05％HClを調製する。
10. エオシンY-フロキシンB溶液混合物を25mLの1％e1％リン酸B（aq）2.5mL、95％エタノール195mLおよび氷酢酸1mLをガラス瓶中に入れた。旋回させてよく混合し、RTで保存する
    注意：Eosin Yは、眼に入った場合、摂取した場合、および吸入した場合には危険です。常にラボコートと手袋を着用し、ストック溶液をケミカルフードで取り扱います。
11. 98mLの卵水に2mLの純エチルアルコールを加えて2％エタノールを調製する。
    注意：エチルアルコールは眼に刺激性があります。エチルアルコールを取り扱うときは、常に適切な保護具を着用してください。それはまた可燃性であり、それに応じて取り扱われ、保管されるべきである。
    注：急性エタノール処理を行う前に毎回新鮮な2％エタノールを調製してください。

2.ゼブラフィッシュ幼虫における急性エタノール処理の実施

1. 胚を生成するには、1匹の野生型のオスと1匹のWTのメスの魚を交配して交配する。相手タンクにプラスチック製の仕切りを差し込んで分けてください。
   注：セット魚がうまく供給されるように、1日の最終的な給餌後に交配する。
   1. 翌朝の午前8時に、ディバイダを引っ張ってペアを合わせます。
   2. 1時間後、成魚を元のタンクに戻す。胚を含む水をストレーナーに注ぐことによって胚を収集する。 100ミリリットルのペトリ皿でストレーナーを回転させ、卵の入った洗濯瓶を用いて胚を皿に洗う。 28℃のインキュベーターに胚と皿を置きます。
   3. 胚が少なくとも4細胞期（1hpf）に達したら、パスツールピペットで水中の未受精の胚と破片を取り除き、28℃のインキュベーターに受精した胚を入れます。受精後96時間まで28℃でインキュベーター内の胚を維持する。
   4. トリカイン溶液を卵の水に1〜10（容量/容量）の割合で加えることによって、幼虫の魚を麻酔する。
   5. 膨らんだ水泳膀胱を持つ40頭の96 hpf幼虫を選択してくださいパスツールピペットを使い、2つの新しいペトリ皿に均等に分けます。
   6. 可能な限り多くの残留卵を取り出してください。 mLあたり1匹の幼虫の密度で、2％エタノールを含む卵の水を1つの皿に加える。他の皿に同量の卵の水を加えてコントロールにします。
   7. コントロールおよびエタノール処理した幼虫を魚の部屋に24時間放置する。
      注：14時間の光/ 10時間の暗サイクルを有する魚の部屋でエタノール処理を行うと、インキュベーター内の暗所で実験を行うよりも一貫性があり頑強な肝障害が生じる。
   8. チューブあたり20匹以下の幼虫を有する1.5mL遠心分離管内の幼虫を収集する。
   9. できるだけ多くの液体を幼虫から除去し、ケミカルフード内に少なくとも1mL（10倍組織量）のDietrich固定剤を添加する。魚を室温で少なくとも24時間ナッターで固定する。
      注：魚は数週間、Dietrichの固定剤で安定しています。

3。組織カセットの調製および処理

1. カセットあたり必要な数の組織カセットと2つの青色生検パッドを設定します。 1つの生検パッドを各カセットの底に置きます。各カセットに鉛筆でラベルを付けると、サンプルがはっきりと識別できます。
   注記：後の手順でラベルが失われるため、ペンまたはマーカーを使用してカセットにラベルを付けないでください。
2. 3％アガロースに幼虫を埋め込んで、すべてのサンプルの一貫した配向を確実にする。
   1. 固定液を化学フード内のチューブから取り出し、1x PBS 1mLでそれぞれ5分間3回幼虫を洗浄する。洗浄中にチューブを室温でナッターに置きます。
   2. 洗浄中、調製した3％アガロースをマイクロ波を用いて水中で加熱して固体を融解する。一度に30秒間加熱し、沸騰を最小限に抑えるよう注意深く観察する。穏やかに攪拌しながら90℃に設定したホットプレート上に液体アガロースを保つ。
   3. 移送ピペットを使用して、最大8リットルarvaeをプラスチックの組織学的型に加え、できるだけ多くのPBSを除去する。チップを切断した移送ピペットを使用して、3％アガロースでモールドを完全に満たします。
   4. インスリン注射器を使用して、幼虫をモールドの中心に集め、それらを底に押します。矢状断面では、頭部を金型の頂部に向けて、幼虫を一列に配置する。肝臓が一貫した方向に向くようにするには、体の左側が下を向くように幼虫を回し、型の底に平らにします。
      注：肝臓は体の左側に位置するため、肝臓に到達する前に切断する必要のある部分の数を最小限に抑えます。可能な限り幼虫を互いに接近させてください。
   5. 金型を側面に4〜5分間セットして、アガロースを完全にセットする。金型からアガロースブロックを取り出し、幼虫の周りのアガロースをトリミングするためにかみそりの刃を使用してください。ブロックを端に立て、厚さを半分に切断する最終ブロックは約2〜3mmの厚さであること。
   6. 小さなアガロースブロックを準備した組織カセットに移し（ステップ3.1）、2番目の生検パッドをブロックの上に置きます。カセットを閉じ、ddH2O中に新たに調製した70％エタノールを含むシール可能な容器に、完全に組み立てたカセットを入れる。
      注意：カセットを直ちに処理しない場合は、4℃の容器内に70％エタノールを入れて固定を忘れないようにしてください。カセットは4℃で3日間安定です。
3. 組織処理
   注：サンプルは、パラフィンでカセットを処理するための組織プロセッサーを備えた組織学または病理検査室に提出することができます。パラフィンがアガロースに完全に浸透できるように、短いプログラムではなく標準のO / N処理プログラムを要求します。
   1. 組織のカセットを、アルコールの量を増やしながらエタノールの希釈系列に移すことによって処理する。次のように組織を脱水する：70％エタノール2回、各45分; 80％エタノール、45分; 95％エタノール、2回、各45分; 100％エタノール、2回、各45分。
   2. パラフィンが組織に浸透するようにアルコールを溶媒（100％キシレン、2回、それぞれ45分間）と交換する。
      注意：キシレンは刺激性があり、吸入すると有害です。必ず化学フードを使用してください。キシレンは可燃性であり、したがって保管する必要があります。
   3. パラフィンO / N中のカセットをインキュベーター内で60〜65℃でインキュベートする。包み込むまでカセットを暖かく保つ。
4. 処理されたアガロースブロックをパラフィンに埋め込む。
   1. 埋め込み機の温かい引き出しから1カセットを取り出し、カセットの蓋と上部生検パッドをカセットから取り外します。組織パラダイムを液体パラフィンで満たし、包埋装置の温かいプレートに保持する。
   2. 温かい鉗子を使用して、カセットからアガロースブロックを拾い上げるeをパラフィンで組織型に移す。表面に最も近い魚のアガロースブロックの側面が下を向いていることを確認します。ボトム生検パッドを取り除き、組織学的モールド全体を包埋機のクールプレートに移す。
   3. 鉗子を使用して、アガロースブロックを金型の中央に素早く配置します。金型の底にブロックを置きます。ブロックが適切に配置されたら、カセットの底を組織学的モールドの上に置き、液体パラフィンで途中まで充填します。 4°Cプレートに直接モールドを置き、パラフィンを凝固させるためにブロックを少なくとも10〜15分間妨害しないでください。最初のブロックが設定されている間、残りのブロックに対してこのプロセスを繰り返します。
   4. すべてのブロックにパラフィンをセットしたら、パラフィンブロックから組織学的モールドを軽く押して緩めます。これらのパラフィンブロックは、室温で無期限に貯蔵することができる。

4.パラフィンブロックの分割

1. セクショニングする前日に、ミクロトームを用いてパラフィンブロックを顔にして、組織を覆う余分なパラフィンを除去する。パラフィンブロックの表面に組織が暴露されるまで、一度に5μmの厚さに切断する。切断されたすべてのセクションを停止して破棄します。 4°CO / Nで1x PBSでブロックを下に向けて浸します。
   注：ブロックは少なくとも8時間浸漬する必要があります。一日の終わりに浸漬を開始します。ブロックが1倍のPBSに長時間放置されていると、組織が腫れて歪んでしまうことがあります。
2. 1x PBSから一度に1ブロックを除去し、ミクロトームを用いて5μm切片を切断する。鉗子またはブラシを使用して、ブレードから最後の部分を静かに引っ張って、セクションからリボンを分離します。鉗子を使用して最後のセクションでリボンをピックアップし、42℃の水浴に移す。少なくとも5分間リボンを水面に浮かべてください。
   注：パラフィンに接触している間に鉗子が水に触れないようにしてください。そうしないと、パラフィンが鉗子に溶けて分離が非常に困難になります。必要に応じて、クリーンな鉗子を使用してセクションを小さなグループに分けて、スライドに簡単にフィットさせるようにしてください。セクション間の縫い目に静かに触れ、破損することなく分離を作成します。
3. 帯電したスライドを45度の角度で水の中に入れ、収集するセクションのグループの下に注意深く配置します。スライドを水から慎重に持ち上げて、セクションをスライドに取り付けます。
4. 糸くずのないティッシュを使用して、セクションから余分な水を取り除きます。スライドホルダーまたはボックスにスライドを置きます。所望の組織が採取されるまで、ブロックを切断し続ける。すべてのブロックに対してセクション処理を繰り返します。
5. パラフィンを溶かすためにスライドを55℃のインキュベーターまたはオーブンで3-16時間焼く。オーブンからスライドを取り出し、o染色が始まる前に冷ます。
   注：パラフィン切片は、ベーキングの前後の両方で無期限に室温で保存することができます。

パラフィン切片のヘマトキシリン染色およびエオシン染色

1. スライドを100％キシレンに15分間浸漬して脱パラフィンする;さらに15分間新鮮な100％キシレンに変更してください。
2. 液体がスライドからきれいに動くまで、次の一連の段階的エタノールに浸してスライドを再水和する。各溶液について、100％エタノール、100％エタノール、95％エタノール、95％エタノール、70％エタノール、50％エタノール、30％エタノール、および脱イオン水の各浸漬につき8-10回、2秒浸漬する。
   注記：このプロトコールはここで停止することができ、スライドは水中で数時間放置することができます。必要に応じて、スライドを4℃で水中に保存することができます。
3. スライドを100％濾過したHarrisヘマトキシリンに4分間入れる。直ちに脱イオン水でコンテナに戻してください。脱イオン水をtに流す彼はセクションから最も遠いコンテナの後ろのコーナーにいます。水がもはや紫色にならなくなるまで定期的に容器を空にする。
   注：セクションがスライドから外れる可能性があるため、水がスライドに直接流れないようにしてください。
4. グースネックライトを使用して、解剖顕微鏡でヘマトキシリン強度を素早くチェックします。スライドを乾燥させないでください。汚れが所望の強度に達した場合は、次のステップに進む。色が十分暗くない場合は、スライドを100％ヘマトキシリンに1分間置き、再度水洗を繰り返してから再度確認してください。
   注：ヘマトキシリンは、エオシン染色中に色が失われないように十分に暗くする必要があります。しかし、ヘマトキシリン染色が細胞質に見られる場合、切片は過剰染色される。
5. スライドを0.05％HClで2回浸漬し、直ちに清浄な脱イオン水で容器に戻します。水を空にして容器に水を2回補充する。
6. スライドを95％に転写するhanolを30秒間加えた後、95％エタノールで30秒間新しい容器に移す。
7. 2分間、スライドをエオシンY-phloxine B溶液に入れる。スライドを前の95％エタノール容器に戻し、解剖顕微鏡下で色の強度を素早くチェックする。染色が十分であれば、次のステップに進んでください。そうでない場合は、30秒間エオシン溶液に戻り、再度確認し、必要に応じて繰り返します。
   注：十分なエオシン染色は明るいピンクであり、ヘマトキシリン染色とは明らかに対照的である。顕微鏡の下で偽色が観察されないようにチェックするときは、スライドの裏側から溶液を拭き取ってください。エオシンは95％のエタノールで構成されているため、95％のエタノールで長時間放置すると色の濃さを確認しながら色の一部が溶出することがあります。
8. スライドを100％イソプロパノールに15秒間移す。新鮮な100％イソプロパノールと交換し、スライドをイソプロパノールの中に15秒間戻します。これを繰り返します。全部で6回のイソプロパノール洗浄を行う。
   注意：イソプロパノールは眼や呼吸器の刺激物です。常に適切な保護具を着用し、飛沫を避けるようにしてください。また、可燃性が高く、適切に保管して取り扱う必要があります。
   注：試薬を節約するために、最初の（最も淡い）イソプロパノール洗浄液のみを捨ててください。他の5つの洗浄液を1から5までのボトルに入れ、次の染色に再利用してください。洗浄を再使用するときは、「1」番のボトルから始めて、使用後に廃棄してください。 "2"を使用したら、ボトル "1"に注ぎます。最後の洗浄は常に新鮮なイソプロパノールでなければなりません。
9. スライドを100％キシレンに3分間入れる。一度に1つのスライドを取り外し、カバースリップを置きます。
   1. セクションをカバーするのに十分なマウント媒体を加え、100％キシレンに浸す。
      注：この手順は、マウントメディアの表面を滑らかにし、気泡を取り除きます。
   2. カバースリップを塗るスライドの底に。
      注：マウントメディアはスライドを所定の位置に引っ張ります。カバースリップがまっすぐでない、または完全に装着されていない場合は、静かに所定の位置にタップします。
   3. 細い線が見えるまでペーパータオル上の余分なマウント媒体を汚す。ティッシュワイプをキシレンに浸し、スライドの裏面を拭いて、滴り落ちた媒体を取り除きます。段ボールのような丈夫であるが可動性のある面にスライドを平らに置く。残りのすべてのスライドを同じ方法でカバーします。フード内でキシレンを10分間蒸発させる。
      注：キシレンで汚染された物質は、蒸気が漏れるのを防ぐために、フード内の密閉容器内で除去して廃棄しなければなりません。
10. RT O / Nで固化させてください。

6.ステンドグラスのイメージングと保存

1. コンパウンド倒立顕微鏡^18の画像セクション。
   注：スライドは部屋teに保管することができます無期限に

結果

10％緩衝ホルマリンおよび4％パラホルムアルデヒド（PFA）は、組織学的プラクティスに使用される最も一般的な固定剤の2つである。しかし、ゼブラフィッシュの肝臓組織の最適な固定結果は得られません（ 図1および表1 ）。 10％ホルマリンまたは4％PFAによる固定は、しばしば収縮をもたらし、肝臓と周囲組織との間に大きなギャ?...

ディスカッション

現在のプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理およびH＆E染色によるその後の組織病理学的分析の詳細な手順を記載している。急性エタノール処理は、ゼブラフィッシュ肝臓がアルコール代謝酵素を発現し始める段階であるため、受精後96時間以内に行わなければならない。 2％エタノールは、幼虫が^13,14を許容できる最大用量である。エタノー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	E & K Scientific	280150
15 mL conical tubes	VWR International	89039-664
50 mL conical tubes	VWR International	89039-658
95% ethanol (EtOH)	Decon Labs, Inc.	2801	Flammable
Acetic acid	Newcomer Supply	10010A	Irritant
Agarose	Research Products International	9012-36-6
Aluminum jar rack holder	Newcomer Supply	5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid	Corning	351029
Biopsy pads	Simport	M476.1
Charged slides	Fisher Scientific	12-550-16
Clear mounting media	Fisher Scientific	8310-16	Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts	Instant Ocean	SS15-10
Disposable microtome blades	Fisher Scientific	4280L
Dissecting microscope	Leica Biosystems	Leica Mz 95
Enclosed tissue processor	Leica Biosystems	ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set	Newcomer Supply	1082A
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023	Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization)	Sigma-Aldrich	252549	A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10%	Fisher Scientific	SF100-4	A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle	VWR International	16159-520
Harris hematoxylin	Poly Scientific R&D Corp.	s212	Irritant
Histology molds	Sakura Finetek USA Inc	4557
Hot plate/Stirrer	VWR International	47751-148
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific	A144	Irritant
Incubator	VWR International	97058-220
Insulin syringes	BD Medical	BD-309301
Inverted compound microscope	Carl Zeiss Microscopy	491912-9850-000
Isopropanol	Newcomer Supply	12094E	Flammable
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140	Irritant
Microtome	Leica Biosystems	Leica Jung BioCut 2035
Nutating mixer	VWR International	82007-202
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet	VWR International	53283-916
Pipette pump (10 mL)	VWR International	53502-233
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Razor blades	Grainger	4A807
Slide Staining Kit	Newcomer Supply	5300KIT
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher BioReagents	S318-500	Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter)	Adaptive Science Tools	L0906045in
Tissue cassettes	Simport	M505.12
Tissue embedding center	Sakura Finetek USA Inc	#5100
Tissue wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06666A
Transfer pipets	Fisher Scientific	137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich	A5040	Irritant
Tris base, primary standard and buffer	Sigma-Aldrich	T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth	Nalge Nunc International	2402-0750
Xylenes	Fisher Scientific	X3S-4	Irritant