JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol 24 saat boyunca% 2 etanol ile işlenmiş zebrafish larva karaciğerlerinin histolojik analizlerini tanımlamaktadır. Böyle akut etanol tedavisi hepatik steatoz ve hepatik vaskülatürün şişmesi ile sonuçlanır.

Özet

Alkolik Karaciğer Hastalığı (ALD), akut veya kronik alkol bağımlılığı nedeniyle karaciğerde hasar anlamına gelmektedir. Alkolle ilişkili morbidite ve mortalitenin başlıca nedenleri arasındadır ve Birleşik Devletler'de 2 milyondan fazla kişiyi etkilemektedir. ALD'ye etkili tedavi geliştirmek için alkolle indüklenen karaciğer hasarının altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması önemlidir. Zebra balığı larvaları akut alkollü karaciğer hasarının çalışması için yararlı olan% 2 etanolün sadece 24 saat maruz kaldıktan sonra hepatik steatoz ve fibrojenez sergilerler. Bu çalışma, zebra balığı larvalarında akut etanol tedavisi için prosedürü açıklamakta ve hepatit kan damarlarında steatoz ve şişmeye neden olduğunu göstermektedir. Hematoksilin ve Eozin (H & E) boyama için zebra balığı iri karaciğerinin histolojik analizi için optimize edilmiş ayrıntılı bir protokol de açıklanmaktadır. H & E boyaması, immünofloresansa kıyasla birçok benzersiz avantaja sahiptir, çünkü tüm canlıları işaretlemektedirEr hücreleri ve hücre dışı bileşenleri aynı anda tespit edebilir ve steatoz ve fibroz gibi hepatik hasarı kolayca tespit edebilir. Toksik ve virüs kaynaklı karaciğer hasarının ve kalıtsal karaciğer hastalıklarının modellenmesinde zebra bibinin artan kullanımı göz önüne alındığında, bu protokol bu çalışmaların tamamında yapılan histolojik analizler için bir referans görevi görür.

Giriş

Alkol tüketimi nedeniyle oluşan Alkolik Karaciğer Hastalığı (ALD), alkol ile ilişkili morbidite ve mortalitenin ana nedenidir. Amerika Birleşik Devletleri'nde karaciğer hastalığının ölümlerinin yaklaşık yarısında alkol 1 ve ALD 3 karaciğer naklinde neredeyse 1'den sorumludur 2 . ALD geniş bir spektruma sahiptir. Hepatositlerde aşırı lipid birikimi ile karakterize olan steatoz, ağır içmenin erken evresinde ortaya çıkar ve alkol kullanımının durması üzerine geri döndürülebilir. Genetik ve çevresel faktörlerin etkisi altında ve devam eden alkol alımıyla hepatik steatoz alkolik hepatite ve nihayetinde siroza ilerleyebilir. Kemirgen ALD modellerini kullanan çalışmalar, hastalığa dair önemli bilgiler sağlamıştır, ancak sınırlamaları vardır (referans 3'de gözden geçirilmiştir). Bir alkol diyetinin oral yemi sadece kemirgenlerde steatoza neden olur 4 , </ Sup> 5 . İnflamasyon ve fibroz gelişiminde 6 , 7 ya da invaziv ve teknik açıdan zorlayıcı olan kronik intragastrik infüzyon ikinci bir hakaret gerektirir ( 8 , 9) . Teleost zebrafish ayrıca hem kronik hem de akut alkol tedavisine yanıt olarak karaciğer hasarını geliştirir 10,11,12,13,14,15. Özellikle larval zebra balığı, akut alkollü karaciğer hasarının 10 , 11 , 13 , 15 incelerken çekici bir tamamlayıcı model organizmayı temsil eder. Zebra balığı karaciğeri fonksiyoneldir ve etanol metabolizması için 4 gün boyunca anahtar enzimler üretir(Dpf) 13 , 16 , 17.Etanol doğrudan suya eklenebilir ve 24 saat süreyle% 2 etanol ile maruz bırakılması, zebrafish larvalarında hepatik steatoz ve fibrojenik yanıtları indüklemek için yeterlidir 13,15.

24 saat süreyle% 2 etanol ile işlemden geçirildiğinde zebra balığı larvaları 13'de 80 mM'lik bir etanol etanol konsantrasyonu ortaya çıktığı bildirilmiştir. Diğerleri larvaların bu konsantrasyonu tolere ettiğini ve tedavi edilen hayvanlarda görülen karaciğer fenotiplerinin etanol maruziyetine özgü olduğunu 11 , 13 , 15 , 18 göstermiştir. Bununla birlikte, 80 mM, insanlarda 19 ölümcül olduğu için, etanol ile işlemden geçirilmiş zebra balığı ve karaciğer histolojisini değerlendirmek önemlidirİnsanlara fizyolojik olarak uygunluğunu söyleyin.

Zebra balığı larvalarının hızlı harici gelişimi ve yarı saydamlığı, karaciğerdeki alkolün gerçek zamanlı ve sabit numunelerde oluştuğunu karakterize etmeyi mümkün kılar. Hücre tipine spesifik fluoresan transgenik çizgilerin varlığı ve konfokal mikroskopide son gelişmeler akut etanol tedavisine yanıt olarak farklı karaciğer hücre tiplerinin morfolojilerini ve davranışlarını nasıl değiştirdiklerini araştırmayı kolaylaştırır 11,15. Bununla birlikte, floresan transgenik zebra bifsiğinin konfokal görüntülemesi, karaciğer histolojisini incelerken Hematoksilen ve Eozinin (H & E) boyamasının tamamen yerini alamaz. Transgenik zebra balığı kullanarak tüm karaciğer hücre tiplerini aynı anda işaretlemek, her biri bir karaciğer hücresi türünü benzersiz bir florofor ile etiketleyen bireysel transgenik çizgilerin üretilmesini gerektirir. Aynı balıkta farklı transgenik arka planlar getirmek breedin'i gerektirirG çok kuşaktır, bu da zaman alıcı ve maliyetlidir. Ekstra immünofloresan boyama, hücre dışı matris bileşenlerini saptamak için gereklidir. Öte yandan, H & E boyası, tüm karaciğer hücre tiplerini ve hücre dışı matris bileşenlerini aynı anda etiketlendirir, böylece karaciğer 20'ye genel bir bakış sağlar. Dahası, karaciğer hastalıklarının, hepatosit ölümü, steatoz ve fibroz gibi çeşitli histopatolojik özelliklerini kolayca ortaya çıkarmaktadır. H & E, memeli karaciğer histolojisinde rutin bir leke olmasına rağmen, zebra balığı karaciğer araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaz ve protokol daha az kuruludur.

Bu çalışma, zebra balığı larvalarında akut etanol tedavisi için ve H & E boyaması ile izlem histolojik analizleri için bir protokolü açıklamaktadır. H & E boyama protokolü, karaciğer gelişimi ve işlevi ile ilgili tüm araştırmalarda kullanılabilir. Ayrıca, parafin bölümleri immünohistokimyasal olarak ve diğer özel staTrichrome boyası, retikülin lekesi vb . Dahil karaciğer patolojisinde ins.

Protokol

AB WT erişkin ve larval zebra balığı, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (Ulusal Sağlık Enstitüsü, 86-23, 1985'de revize edilmiştir) uyarınca standart koşullar altında tutulmuştur; Bunların kullanımı, Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi (CCHMC) 'nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Çözümlerin Hazırlanması

  1. Yumurta suyu hazırlayın.
    1. Stok tuzu çözeltisini 40 g ticari deniz tuzunu 1 L iki damıtılmış suda (ddH2O) çözerek hazırlayın. Tüm tuzlar tamamen çözülene kadar karıştırın.
    2. 100 mL ddH2O'ya 0.1 g toz ilave ederek% 0.1 metilen mavisi çözeltisi hazırlayın.
      DİKKAT: Metilen mavisi, gözler veya cilt ile temasında bir tahriş edicidir. Tozla uğraşırken daima bir laboratuar önlüğü ve eldiven giyin.
    3. 28.125 mL stok tuzunu bu şekilde birleştirinÇözeltisi ve 7 mL metilen mavisi solüsyonu içine kondu. İyice karıştırın. Bu karışımı 15 L ddH2O'ya ilave edin. Iyice çalkalayın ve oda sıcaklığında saklayın.
  2. 100 mL ddH2O'ya 12,1 g Tris tozu ilave ederek 100 mL 1 M Tris-HCl'yi hazırlayın. Hidroklorik asit (HC1) kullanarak pH'ı 9.0'a ayarlayın.
    DİKKAT: HC1 solunduğunda ciddi yanıklara ve mukoza zararlılarına neden olabilir. Daima bir laboratuar önlüğü ve eldiven giyin ve stok şişesini bir kimyasal kaputa tutun.
  3. % 0.4 tricaine (etil 3-aminobenzoate metansulfonate) solüsyonu hazırlayın.
    1. 2 g tricaine tozu 489.5 mL ddH20 ile eritilir. 10.5 mL Tris-HC1, pH 9 solüsyonu ilave edilir. Tozun tamamı çözünene kadar bir karıştırma çubuğu ile karıştırın. PH 7.0'a ayarlayın.
      DİKKAT: Tricain tozu solunum yollarını tahriş edici olabilir. Tozla uğraşırken daima bir toz maskesi takın.
    2. 50 mL konik tüplere 45 ml tricaine solüsyonu alın. Çözümü saklaN derhal kullanım için 4 ° C'de ve uzun süreli depolama için -20 ° C'de.
  4. Dietrich fiksatifini 30 mL% 95 etanol, 10 mL% 37 formaldehit, 2 mL buzlu asetik asit ve 58 mL ddH20'nın bir cam medya şişesinde birleştirerek hazırlayın. Kavisle iyice karıştırın ve oda sıcaklığında saklayın.
    DİKKAT: Formaldehit şüpheli bir kanserojen olup formaldehit içeren herhangi bir solüsyon kimyasal bir kaputta kullanılmalıdır. Buzlu asetik asit şiddetli deri yanıkları ve göz hasarına neden olabilir. Daima bir laboratuar önlüğü ve eldiven giyin ve stok solüsyonunu kimyasal bir kaputa tutun. Formaldehit, buzlu asetik asit ve% 95 etanol hepsi yanıcı sıvılardır ve belirlenmiş bir yanıcı kabinde saklanmalıdır.
    NOT: Dietrich fiksatifi 1 yıldır RT'de sabittir.
  5. 80 g sodyum klorür (NaCI), 2 g potasyum klorür (KCI), 14.4 g disodyum fosfat (Na2HP04) ve 2 ilave edilerek 1 L 10x Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) çözeltisi hazırlayın.4 g monopotasyum fosfat (KH2PO4) ila 800 mL ddH20. Sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak pH 7.4'e ayarlayın ve 1 L son hacme ddH20 ilave edin. 1 dakika boyunca temizlenen ve 121 ° C'de 20 dakika inkübe eden bir sıvı döngüsünde otoklav sonrasında bu solüsyonu oda sıcaklığında saklayın.
  6. 100 mL 10x PBS solüsyonunu 900 mL ddH2O içinde seyrelterek 1 L 1x PBS'yi yapın. Sallayarak iyice karıştırın ve otoklavdan sonra oda sıcaklığında saklayın.
  7. Embriyo montajı için bir cam medya şişesinde% 3 agaroz hazırlayın.
    1. 100 mL ddH20'ya 3 g agaroz ekleyin ve döndürerek karıştırın. Mikrodalgayla karıştırarak, agarozu eritmek için karışımı ısıtın ve ısıtma sırasında az kaynama olduğundan emin olmak için dikkatle izleyin.
      DİKKAT: Şişe, kısa süreli ısıtmaya rağmen mikrodalgadan çıkarıldığında muhtemelen sıcıcaktır. Şişeyi mikrodalgadan çıkarmak için koruyucu bir eldiven veya eldiven kullanın.
    2. Şişeyi mikrodalgadan çıkarın.Nazikçe dönerken, tamamen çözünmeyen herhangi bir kristal arayın; Kristal yoksa, çözelti kullanıma hazırdır. RT'de% 3 agaroz saklayın ve kullanmadan önce tekrar ısıtın.
  8. Çökeltilmiş katıları çıkarmak için Harris hematoksilen stok solüsyonu filtreleyin.
    1. Filtrenin bir koni oluşturması için bir kahve filtresini yarıya kadar katlayın. Yan panelini, sıvının filtreden geçmesini sağlayacak şekilde açın, herhangi bir pisliğin yakalanmasına izin verin.
    2. Filtreyi huni içine yerleştirin ve huni cam bir medya şişesine yerleştirin. Hisse senedi hematoksilenini aşamalı olarak filtreye dökün.
      DİKKAT: Hematoksilin, göz teması, yutma ve solunduğunda tehlikelidir. Daima bir laboratuar önlüğü ve eldiven giyin ve stok solüsyonunu kimyasal bir kaputa tutun.
  9. 250 mL ddH2O'ya 125 uL 12 N HC1 ilave ederek% 0.05 HC1 hazırlayın.
  10. Eozin Y-phloxine B solüsyon karışımını, 25 mL% 1 eBir cam şişede 2.5 mL% 1 foliksin B (sulu), 195 mL% 95 etanol ve 1 mL buzlu asetik asit ilave edildi. Kavisle iyice karıştırın ve RT'de saklayın
    DİKKAT: Göz teması, yutma ve solunması halinde Eosin Y tehlikelidir. Daima bir laboratuar önlüğü ve eldiven giyin ve stok solüsyonunu kimyasal bir kaputa tutun.
  11. 98 mL yumurta suyuna 2 mL saf etil alkol ilave ederek% 2 etanol hazırlayın.
    DİKKAT: Etil alkol göz tahriş edicidir. Etil alkol kullanırken daima uygun koruyucu ekipman kullanın. Aynı zamanda yanıcıdır ve buna göre tutulmalı ve saklanmalıdır.
    NOT: Akut etanol uygulanmadan önce her seferinde taze% 2 etanol hazırlayın.

2. Zebra balığı Larvalarında Akut Etanol Uygulayın

  1. Embriyolar üretmek için, çiftleşme tankı başına bir vahşi tipli erkek ve bir WT dişi balığı ile haçlar kurun. Çiftleştirme tankına bir plastik bölücü sokarak ayırın.
    NOT: SetGünün nihai beslenmesinden sonra, balıkların beslenebilmesi için kesişir.
    1. Ertesi sabah 08.00'da, çiftin çiftleşmesine izin vermek için ayırıcıyı çekin.
    2. 1 saat sonra erişkin balıkları orijinal tanklarına geri getirin. Embriyoları içeren suyu bir süzgeç dökerek embriyoları toplayın. 100 mm'lik bir Petri kabında süzgecin üzerine çevirin ve yumurta suyunu içeren bir yıkama şişesi kullanarak embriyoları çanağa yıkayın. 28 ° C'de bir inkübatör embriyolar ile çanak koyun.
    3. Embriyolar en azından 4 hücreli evreye (1 hpf) ulaştığında, bir Pasteur pipetiyle sudaki herhangi bir düzenlenmemiş embriyo ve enkaz kaldırın ve döllenmiş embriyolarla çanağı 28 ° C'de inkübatöre yerleştirin. Döllenmeden 96 saate kadar inkübatörde 28 ° C'de embriyoların bakımını yapın.
    4. Tricaine solüsyonunu yumurta suyuna 1-10 (hacim / hacim) oranında ilave ederek larva balıklarını anestezi altına alın.
    5. Şişirilmiş yüzmek mesanesine sahip olan kırk 96 hpf larva seçinBir Pasteur pipetle doldurun ve eşit olarak iki yeni petri tabağına ayırın.
    6. Mümkün olduğunca yumuşak yumurta suyu alın. ML başına bir larva yoğunluğunda, bir çanak% 2 etanol içeren yumurta suyu ekleyin. Aynı miktarda yumurta suyu kontrol olarak kullanmak için diğer çanağa ekleyin.
    7. Kontrol ve etanol ile muamele edilmiş larva balık odasında 24 saat tutun.
      NOT: 14 saat aydınlık / 10 saat karanlık döngüye sahip bir balık odasında etanol uygulanması, deneyin karanlıkta bir kuluçka makinesi içinde yürütülmesinden daha tutarlı ve sağlam karaciğer hasarına yol açar.
    8. Larvaları 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın, tüp başına en fazla 20 larvana sahip olun.
    9. Larvardan olabildiğince fazla sıvı çıkarın ve kimyasal kaputun içine en az 1 mL (10x doku hacmi) Dietrich fiksatifi ilave edin. Balıkların oda ısısında bir nutrotta en az 24 saat sabitlenmesine izin verin.
      NOT: Balıklar birkaç hafta boyunca Dietrich fiksatifinde kararlıdır.

3. Doku Kasetlerinin Hazırlanması ve İşlenmesi

  1. Kaset başına gerekli sayıda doku kaseti ve iki mavi biyopsi pedini ayarlayın. Her bir kasetin altına bir biyopsi pedi yerleştirin. Numarayı açıkça belirten her kaseti kalemle etiketleyin.
    NOT: Kasetleri etiketlemek için kalemi veya işaretleyiciyi kullanmayın, çünkü etiketler sonraki adımlarda kaybolacaktır.
  2. Tüm numunelerin tutarlı yönlendirilmesini sağlamak için larvaları% 3 agaroz içine yerleştirin.
    1. Kimyasal bir kaputtaki tüplerden fiksatif maddeyi çıkarın ve larva 1 mL 1x PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Tüpleri, yıkama sırasında oda sıcaklığında bir besleyiciye yerleştirin.
    2. Yıkamalarda katı madde eritmek için hazırlanan% 3 agarozu bir mikrodalga kullanarak suda ısıtın. Bir sefer 30 saniye ısıtıp kaynatmayı en aza indirgemek için dikkatle izleyin. Sıvı agarozu hafifçe karıştırılarak 90 ° C'ye ayarlanmış sıcak bir tabağa koyun.
    3. Bir transfer pipeti kullanarak, 8 l'ye kadar aktarınArva bir plastik histoloji kalıp ve mümkün olduğunca çok PBS kaldırın. İpucu kesilmiş bir transfer pipeti kullanarak kalıp% 3 agaroz ile tamamen doldurun.
    4. Bir insülin şırınga kullanarak, larvaları kalıbın merkezine toplamak ve altlarına itmek. Sagittal kesitler için başları kalıbın tepesine doğru olacak şekilde larvaları bir çizgide konumlandırın. Karaciğerlerin tutarlı bir şekilde yönlendirilmesini sağlamak için larvaları, vücudun sol tarafı aşağı gelecek ve kalıbın tabanına dayanacak şekilde döndürün.
      NOT: Karaciğer vücudun sol tarafında bulunduğu için, bu konumlandırma karaciğere ulaşmadan önce kesilmesi gereken bölüm sayısını en aza indirir. Larvaları olabildiğince birbirine yakın tutun.
    5. Agarozun tamamen ayarlanabilmesi için kalıbı 4-5 dakika kenara koyun. Agaroz bloğu kalıptan çıkarın ve larva çevresindeki agarozu düzeltmek için tıraş bıçağı kullanın. Bloğu sonuna kadar kaldırın ve kalınlığı yarı yarıya kesinizO son bloğun kabaca 2-3 mm kalınlığında olması.
    6. Hazırlanan doku kasetine küçük agaroz bloğu aktarın (adım 3.1) ve ikinci biyopsi pedini bloğun üzerine yerleştirin. Kaseti kapatın ve tamamen monte edilmiş kaseti, ddH2O içinde taze hazırlanmış% 70 etanol içeren kapatılabilir bir kapa yerleştirin.
      NOT: Kasetler derhal işlenmeyecektir, sabitleme kaybını önlemek için, kasetleri% 4 etanol içinde 4 ° C'de bir kapta yerleştirin. Kasetler 4 ° C'de 3 güne kadar stabildir.
  3. Doku işleme
    NOT: Numuneler, kasetleri parafin içinde işlemek için bir doku işlemcisi ile donatılmış bir histoloji veya patoloji laboratuarına gönderilebilir. Kısa bir program yerine standart bir O / N işleme programı isteyin, böylece parafin agaroza tamamen nüfuz edebilir.
    1. Doku kasetlerini, artan bir miktarda alkol içeren bir seyreltme serisi etanol vasıtasıyla aktararak işleyin.Dokuyu aşağıdaki gibi kurutun:% 70 etanol 2 kez, 45 dakika her biri; % 80 etanol, 45 dakika; % 95 etanol, 2 kez 45 dakika; % 100 etanol, 2 kez, 45 dakika her biri.
    2. Parafin dokuya sızmak için alkolü bir çözücü (% 100 ksilen, 2 kez, 45 dakika her biri) ile değiştirin.
      DİKKAT: Ksilen tahriş edici bir maddedir ve solunduğunda zararlıdır. Her zaman bir kimyasal kaput kullandığınızdan emin olun. Ksilen yanıcıdır ve buna göre depolanmalıdır.
    3. Kasetleri, 60-65 ° C'de bir inkübatöre O / N parafininde inkübe edin. Gömülene kadar kaseti sıcak tutun.
  4. İşlenmiş agaroz blokları parafine katıştırın.
    1. Katıştırma makinesinin ısınan çekmecesinden bir kaset çıkarın ve kasetin kapağını ve üst biyopsi pedi kasetten çıkarın. Sıvı parafin ile bir histoloji kalıp doldurun ve gömme makinedeki sıcak plaka üzerinde tutun.
    2. Sıcak forseps kullanarak agaroz bloğu kasetten alınE ve parafin ile histoloji kalıba aktarın. Agaroz bloğunun yüzeye en yakın balıkların bulunduğu tarafın aşağı baktığından emin olun. Alt biyopsi pedini atın ve tüm histoloji kalıbını gömme makinesindeki serin plakaya aktarın.
    3. Forseps kullanarak agaroz bloğu kalıp ortasına hızla yerleştirin; Bloğu kalıbın altına yerleştirin. Blok düzgün şekilde yerleştirildikten sonra, kaset altını histoloji kalıbının üzerine koyun ve yarıya sıvı parafin ile doldurun. Kalıbı doğrudan 4 ° C levhaya yerleştirin ve parafinin katılaşmasına izin vermek için blokları en az 10-15 dakika rahatsız etmeyin. İlk blok kurulurken, kalan bloklar için bu işlemi tekrarlayın.
    4. Parafin tüm bloklar için ayarlandıktan sonra, gevşetmek için hafifçe kalıba basarak histoloji kalıbını parafin bloğundan çıkarın. Bu parafin blokları oda sıcaklığında süresiz olarak depolanabilir.

4. Parafin Bloklarının Kesitleri

  1. Kesitten önceki gün, parafin bloğunda, dokuyu örten fazla miktardaki parafini çıkarmak için bir mikrotom kullanılarak yüz oluşturun. Doku parafin bloğunun yüzeyinde bulunana kadar bir seferde 5 μm'lik bölüm. Kesilen ve kesilen tüm bölümleri atın. Blokları yüzü aşağı bakacak şekilde 1x PBS'de 4 ° CO / N'de ıslatın.
    NOT: Bloklar en az 8 saat süreyle ıslatılmalıdır. Sonunda ıslatmaya başlayın. Bloklar 1x PBS'de çok uzun süre bırakılırsa, doku şişebilir ve bozulabilir.
  2. 1x PBS'den bir seferde bir blok çıkarın ve 5 mikron kesitleri bir mikrotom kullanarak kesiniz. Forseps veya fırça kullanarak son bölümü bıçaktan hafifçe çekerek kısımların şeritlerini bıçaktan ayırın. Forseps kullanarak son bölüme kadar şerit alın ve 42 ° C'de bir su banyosuna aktarın. Şeritlerin su yüzeyinde en az 5 dakika yüzmesini sağlayın.
    NOT: WheBölümleri aktarırken, forsepsin hala parafin ile temas halindeyken suya dokunmasına izin vermeyin. Aksi takdirde, parafin forseps üzerine eriyecek ve ayrımı çok zorlaştırır. Gerekirse, temiz forseps kullanarak bölümleri daha küçük gruplara ayırın böylece slaytlara kolayca otururlar. Hasar vermeden ayırma oluşturmak için bölümler arasındaki dikişe hafifçe dokunun.
  3. 45 derecelik bir açıyla suya yüklü bir slayt yerleştirin ve toplanan bölüm grubunun altına dikkatlice yerleştirin. Slayt sudan dikkatlice kaldırın ve bölümlerin slayta yapışmasına izin verin.
  4. İplik bırakmayan dokuları kullanarak kesitteki fazla suyu alın. Slayt, bir kaydırma tutacağı veya kutuya yerleştirin. İstenilen doku toplanana kadar bloğu kesmeye devam edin. Tüm bloklar için kesitlendirme işlemini tekrarlayın.
  5. Parafin eritmek için slaytları 55 ° C inkübatör veya fırında 3-16 saat pişirin. Slaytları fırından çıkarın ve tepsiden çıkarın.Boyamaya başlamadan önce serin.
    NOT: Parafin kesitleri pişirme öncesinde ve sonrasında RT'de süresiz olarak depolanabilir.

5. Parafin Kesitlerinin Hematoksilen ve Eozin Boyaması

  1. Slaytları 15 dakika süreyle% 100 ksilen içine daldırarak onları sızdırmaz hale getirin; 15 dakika daha taze% 100 ksilen yapınız.
  2. Slaytlar, sıvı slaytlardan temiz şekilde akana kadar aşağıdaki kademeli etanol serisine daldırarak yeniden su haline getirin. Her bir solüsyon için, dip başına 8-10 kez 2 sn daldırma:% 100 etanol,% 100 etanol,% 95 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol,% 50 etanol,% 30 etanol ve deiyonize su.
    NOT: Protokol burada durdurulabilir ve slaytlar oda sıcaklığında birkaç saat boyunca su içinde bırakılabilir. Gerekirse, slaytlar 4 ° C'de su O / N'de saklanabilir.
  3. Slaytları,% 100 filtrelenmiş Harris hematoxylin'e 4 dakika boyunca yerleştirin. Hemen onları deiyonize su ile kaba geri gönderin. Deiyonize suyu tKonteynerin arka köşesinden bölümlerden en uzakta. Kabı, periyodik olarak su boşalmayana kadar boşaltın.
    NOT: Kesitler slaytlardan çıkabileceğinden doğrudan suyun üzerine sürünüz.
  4. Gooseneck ışıkları kullanarak bir diseksiyon mikroskopu hematoksilen yoğunluğunu hızla kontrol edin; Slaytların kurumasına izin verme. Leke istenilen yoğunluğa ulaştıysa, bir sonraki adıma geçin. Renk yeterince karanlık değilse, slaytları 1 dakika boyunca% 100 hematoksilen içine yerleştirin ve tekrar kontrol etmeden önce su yıkamalarını tekrarlayın.
    NOT: Hematoksilenin, eosin boyaması sırasında renk kaybolmaması için yeterince koyu olması gerekir. Bununla birlikte, hematoksilen boyama sitoplazmada görülürse, bölümler boyanır.
  5. Slaytları% 0.05 HC1 içinde iki kez batırın ve hemen temiz deiyonize su ile kaba geri aktarın. Suyu boşaltın ve kabı su ile iki kez tekrar doldurun.
  6. Slaytları% 95'e aktarın30 sn için% 95 etanol ile yeni bir kapa aktarın.
  7. Slaytları eozin Y-floksin B çözeltisine 2 dakika boyunca yerleştirin. Slaytları bir önceki% 95 etanol kabına geri aktarın ve diseksiyon mikroskopu altında rengin yoğunluğunu çabucak kontrol edin. Boyama yeterli ise bir sonraki adıma geçin. Değilse, 30 s boyunca eosin solüsyonuna dönün, tekrar kontrol edin ve gerekirse tekrarlayın.
    NOT: Yeterli eozin boyama parlak pembe olup hematoksilen leke ile farklı kontrastda görünür. Yanlış renk gözlemlenmemesi için mikroskopta kontrol ederken slaytların arkasındaki tüm çözeltileri silmeye dikkat edin. Eozin, renk yoğunluğunu kontrol ederken renkten bazılarını süzebilirken, eosin% 95 etanolden oluşur;% 95 etanolde uzun süre bekler.
  8. Slaytları 15 saniye boyunca% 100 izopropanol 'e aktarın. Yeni% 100 izopropanol ile değiştirin ve slaytları tekrar 15 s boyunca izopropanolun içine koyun. Bu p tekrarlayınToplam 6 izopropanol yıkama işlemi gerçekleştirildi.
    DİKKAT: İzopropanol göz ve solunum rahatsızlığı. Her zaman uygun koruyucu ekipman giydiğinizden ve sıçramayı önlediğinizden emin olun. Oldukça yanıcıdır ve buna göre depolanmalı ve ele alınmalıdır.
    NOT: Reaktiflerden tasarruf etmek için yalnızca ilk (pembe) izopropanol yıkamayı atın. Sonraki beş boyama için tekrar kullanılmak üzere diğer beş yıkama solüsyonunu 1'den 5'e kadar numaralı şişelerde tutun. Yıkamaları tekrar kullanırken, "1" numaralı şişeden başlayın ve kullandıktan sonra atın. "2" yıkama işlemi yapıldıktan sonra, "1" şişesine dökün vb. Son yıkama daima taze izopropanol olmalıdır.
  9. Slaytları 3 dakika boyunca% 100 ksilenler içine yerleştirin. Bir seferinde bir slayt çıkarın ve bir lamel yerleştirin.
    1. Kesitleri örtmek için yeterli montaj ortamı ekleyin ve% 100 ksilen içine daldırın.
      NOT: Bu adım, montaj ortamının yüzeyini pürüzsüz hale getirir ve kabarcığı temizler.
    2. Bir lamel uygulayınSlayt altına.
      NOT: Montaj malzemesi sürgüyü yerine oturtmalıdır. Lamel düz veya tamamen oturmazsa, hafifçe yerine oturtun.
    3. Aşırı montaj ortamını sadece ince bir çizgi oluşana kadar bir kağıt havlu üzerine püskürtün. Bir kağıt mendilini ksilen içine batırın ve damlayan herhangi bir ortamı çıkarmak için slaytın arkasını silin. Kayışı, mukavva gibi sağlam fakat hareketli bir yüzeye düz olarak yerleştirin. Kalan slaytları aynı şekilde kapar. Ksilenin kaputunda 10 dakika buharlaşmasına izin verin.
      NOT: Ksilen ile kirlenmiş herhangi bir malzeme çıkarılmalı ve herhangi bir buhardan kaçınmayı önlemek için davlumbazdaki kapalı bir kapta atılmalıdır.
  10. Montaj ortamının RT O / N'de sertleşmesine izin verin.

6. Lekeli Slaytların Görüntülenmesi ve Depolanması

  1. Bileşik ters çevrilmiş mikroskopta görüntü bölümleri 18 .
    NOT: Slaytlar odada bekletilebilir teMperature süresiz olarak.

Sonuçlar

% 10 tamponlu formalin ve% 4 paraformaldehid (PFA), histoloji uygulamaları için kullanılan en yaygın sabitleştiricilerden ikisidir. Bununla birlikte, zebra balığı karaciğer dokusu için optimal fiksasyon sonuçları vermezler ( Şekil 1 ve Tablo 1 ). % 10 formalin veya% 4 PFA ile yapılan fiksasyon sıklıkla büzülmelere neden olur ve karaciğer ile çevreleyen dokular arasında büyük boşluklar oluşur ( Ş...

Tartışmalar

Mevcut protokol, zebrafish larvalarında akut etanol muamelesi ve ardından H & E boyaması ile yapılan histopatolojik analizler için ayrıntılı bir prosedürü açıklamaktadır. Akut etanol tedavisi döllenmeden 96 saat önce yapılmalıdır, zebra balığı karaciğeri alkol metabolize eden enzimleri 13 ifade etmeye başlar. % 2 etanol, larvaların tolere edebileceği azami doz 13 , 14'tür . Etanol ile işlemden geçirilen...

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Teşekkürler

Yazarlar, Zebra balığı Uluslararası Kaynak Merkezi'ndeki Dr. Katy Murray'ı kabul etmek istiyor; Protokol hakkında faydalı tavsiyeler için Dr. Çavuşoğlu Stacey Huppert ve Kari Huppert; Ve CCHMC veterinerlik hizmetleri, balık bakımı için. Bu çalışma, NIH hibe R00AA020514 tarafından desteklendi ve CCHMC'deki Pediatrik Genomik Merkezi'nden (CY'ye) bir araştırma ödeneği aldı. Ayrıca kısmen Cincinnati'deki Sindirim Hastalığı Araştırma Merkezi Merkezinin NIH hibe P30 DK078392 (Bütünleştirici Morfoloji Çekirdeği) tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL centrifuge tubesE & K Scientific280150
15 mL conical tubesVWR International89039-664
50 mL conical tubesVWR International89039-658
95% ethanol (EtOH)Decon Labs, Inc.2801Flammable
Acetic acidNewcomer Supply10010AIrritant
AgaroseResearch Products International9012-36-6
Aluminum jar rack holderNewcomer Supply5300JRK
Bacteriological petri dishes with lidCorning351029
Biopsy padsSimportM476.1
Charged slidesFisher Scientific12-550-16
Clear mounting mediaFisher Scientific8310-16Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea saltsInstant OceanSS15-10
Disposable microtome bladesFisher Scientific4280L
Dissecting microscopeLeica BiosystemsLeica Mz 95
Enclosed tissue processorLeica BiosystemsASP300 S
Eosin-Phloxine stain setNewcomer Supply1082A
Ethyl alcoholSigma-AldrichE7023Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization)Sigma-Aldrich252549A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10%Fisher ScientificSF100-4A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottleVWR International16159-520
Harris hematoxylinPoly Scientific R&D Corp.s212Irritant
Histology moldsSakura Finetek USA Inc4557
Hot plate/StirrerVWR International47751-148
Hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA144Irritant
IncubatorVWR International97058-220
Insulin syringesBD MedicalBD-309301
Inverted compound microscopeCarl Zeiss Microscopy491912-9850-000
IsopropanolNewcomer Supply12094EFlammable
Methylene blueSigma-AldrichM9140Irritant
MicrotomeLeica BiosystemsLeica Jung BioCut 2035 
Nutating mixerVWR International82007-202
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148-1KGA suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipetVWR International53283-916
Pipette pump (10 mL)VWR International53502-233
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
Razor bladesGrainger4A807
Slide Staining KitNewcomer Supply5300KIT
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS3014
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher BioReagentsS318-500Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4)Sigma-AldrichS3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter)Adaptive Science ToolsL0906045in
Tissue cassettesSimportM505.12
Tissue embedding centerSakura Finetek USA Inc#5100
Tissue wipers, 1-PlyFisher Scientific06666A
Transfer pipetsFisher Scientific137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate saltSigma-AldrichA5040Irritant
Tris base, primary standard and bufferSigma-AldrichT1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouthNalge Nunc International2402-0750
XylenesFisher ScientificX3S-4Irritant

Referanslar

  1. Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. . Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).
  2. Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
  3. Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
  4. Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
  5. Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
  6. Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
  7. Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
  8. Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
  9. Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
  10. Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
  11. Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
  12. Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
  13. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  14. Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
  15. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
  16. Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
  17. Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
  18. Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
  19. Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
  20. Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
  21. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  22. Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
  23. Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
  24. Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
  25. Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
  26. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
  27. van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 123Histolojialkoll karaci er hastalhayvan modelihepatolojisteatozhematoksileneozin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır