ショール分析法を用いたラット乳腺全身の分枝密度の定量

要約

げっ歯類における乳腺発達は、典型的には、記述的評価または基本的物理的属性の測定によって評価されている。分枝密度は、客観的に定量することが困難な哺乳類の発達の指標である。このプロトコールは、乳腺分枝特性の定量的評価のための信頼できる方法を記載している。

要約

げっ歯類の乳腺を化学暴露の発生毒性を評価するためのエンドポイントとして利用する研究が増えています。これらの曝露が乳腺発達に及ぼす影響は、典型的には、基本的な寸法測定または形態学的特徴の採点によって評価される。しかし、発達の変化を解釈するための幅広い方法は、研究所間で一貫性のない翻訳につながる可能性があります。研究を通して比較されるデータから適切な解釈が形成されるように、一般的な評価方法が必要です。本研究は、乳腺の分岐特性を定量化するSholl分析法の応用を記載している。 Sholl法はもともとニューロンの樹状パターンの定量化に使用するために開発されました。オープンソースの画像解析ソフトウェアパッケージであるImageJと、この解析用に開発されたプラグインを使用することにより、乳腺分枝密度とam周産期の雌ラットの臍帯腺を決定した。ここに記載されている方法は、Sholl分析を乳腺発達の重要な特徴を定量化するための有効なツールとして使用することを可能にする。

概要

乳腺分枝は、一般に腺発生の指標として評価される特性であるが、客観的に定量化することは困難である。 1953年にSholl ¹は、猫の視覚および運動皮質におけるニューロンの樹状突起形成を測定する方法を記載し、この技術のためのプラグインはFerriera らによって開発された² 。ニューロンと乳腺の両方が類似の樹状構造を示すため、このプラグインを用いて、周辺期ラット乳腺の2D画像における乳房上皮分岐密度を定量化した。周産期は、離乳は生涯の段階であるため、分析のために選択されました。これは、多くの場合、学術機関や試験ガイドラインの研究で評価されています。 Sholl分析は、FIJIと共に配布されているプラ​​グインです。これはオープンソースの画像処理パッケージImageJで、追加のプラグインが含まれています。プラグインはpredefを囲む一連の同心リングを作成します（典型的には、ニューロンの体細胞または乳腺の主ダクトの起源）を対象とし、対象物の最遠位部分（包囲半径）まで伸びる。次に、各リング上に発生する交差点の数（N）を数えます。また、プラグインはSholl回帰係数（ k ）を返します。これは上皮分岐の減衰率の測定値です。

ImageJを使用して、乳腺全身の骨格化画像が作成され、乳房上皮領域（MEA）が測定される。 Sholl分析プラグインを使用して画像が分析され、ここでは利用されない他の値のうちNとkの値が返されます。乳腺上皮分枝密度は、N / MEAを計算することによって決定される。腺上皮の外側領域で分枝が継続する程度は分枝の複雑さであり、均一な遠位上皮成長の指標である。 kはエピソードにおける遠位減少の尺度であるのでこれは分枝の複雑さと乳房発達の信頼できる指標の有効な尺度である。

このプロトコルは、乳腺全身マウントの骨格化画像を作成し、周辺性雄性および雌性ラットにおける乳房分枝特性を定量的に評価するコンピュータ支援法を記載する。この方法は比較的迅速であり、特別な顕微鏡検査装置の使用を必要としない。この方法の開発および検証はStanko et al。 （2015） ³ 。この報告書はまた、ラット乳腺全体=マウントの調製を記載している。同様の哺乳類全体マウント手順が、アシス（Assis） らに記載されている。 （2010） ⁴およびPlante et al。 （2011） ⁵ 。

プロトコル

この試験のための全ての動物の使用および手順は、NIEHS研究所の動物用ケアおよび使用委員会によって承認され、実験動物管理認定施設の評価および認定協会で実施された。

1.乳腺を摘出する

1. キシレン耐性の方法を使用して、すべてのスライドにあらかじめラベルを付けてください（鉛筆が最適です）。ラベルを保存するには、最後にマウントソリューションを使用してカバーしてください。
2. 動物実験および使用委員会が承認した方法で動物を安楽死させる。
3. 安楽死させた後、動物を解剖板上に置きます （ 図1 ）。後肢が逆V字状になるように4本の四肢を伸ばしてピン止めする（ホールディングピンまたは小ゲージ針がうまく機能する）。
4. 乳腺のサンプルから毛を守るために、腹部を70％エタノールで十分にスプレーします。
5. 鉗子を使用して、正中線で腹部の皮膚を引き上げ、小さな切開を行う。ハサミを解剖し、腹膜を穿刺しないように注意してください。
   1. 切開部から始めて、皮膚を首の領域まで、そして遠位の前肢まで切断します。鼠径部まで切ってから、同じ側の後肢の最初の関節まで遠位に切る。この切開は、通常、乳腺5と6を分離する。腹膜を切るのを避ける。
   2. 鉗子を使用して、付属の乳房脂肪パッドで皮膚を引き戻し、ハサミを切開して平滑末端を用いて腹膜から穏やかに分離する。完全に皮膚の下に鼠径乳腺^第 4 ^番目と5を公開する限り背部できるだけ離して。皮膚を解剖板に固定する（ 図2 ）。
   3. 湾曲した鉗子の丸い側面で5 ^番目の腺の乳房組織を静かに把握し、腺または皮膚にニックを入れないように注意しながら、ゆっくりと腺を皮膚から離してください。
   4. トリムを続けると、4 ^番目と5 ^番目の腺が完全に皮膚から持ち上げられるまで背側に移動。 Sholl分析の開始点として役立つので、ニップル領域が残りのグランドと一緒に取り外されていることを確認してください。腺4に付着している体から乳房組織を切り離します。
6. 腺を動物から取り出したら、静電気を帯びた25mm×75mm×1mmの顕微鏡スライド上に均一に広げ、皮膚に隣接する側を下に向けます。
   注：老齢または泌乳中の動物の腺については、51 x 75 x 1 mmのスライドが必要になることがあります。
7. 手袋を着用しながら、気泡を静かに絞ってください。プラスチックパラフィンフィルムと別の顕微鏡スライドで腺を覆い、腺を圧縮してスライドに接着させます。
   注：水で満たされた50 mLコニカルチューブが適切な重量として機能します。スライドに付着するのに要する時間は、腺の厚さに依存する。薄い、ポストナタルデイ（PND）4腺は最低30分間圧縮する必要がありますが、より厚い成人の腺は2〜5時間かかることがあります。

2.乳腺全身の準備

1. 沸騰と冷蔵が必要なので、少なくとも24時間前にカルミンミョウバン溶液を調製する。
   1. カルミンミョウバン1gと硫酸アルミニウムカリウム（AlK（SO ₄ ） ₂・12H ₂ O）2.5gを蒸留水500mLに溶解し、1Lフラスコ中で20分間沸騰させる。蒸留水を用いて最終容量を500mLにする。
   2. 溶液を濾紙を通して真空下で濾過し、貯蔵のために冷蔵する。
      注：カルミンミョウバン溶液は再使用できますが、色が消え始めると破棄してください。
2. 固定する前に、スライドからグランドを引っ張らないように注意しながら、パラフィンフィルムをグランドから剥がしてください。スライドガラススライド染色ジャーにスライドを置き、固定液（100％エタンオレンジ、クロロホルム、および氷酢酸を6：3：1の比で）で12時間~48時間麻酔した。
3. 固定液を注ぎ、腺を70％エタノールに15分間浸します。エタノール溶液の1/3を注ぎ、それを蒸留水で置き換えることによって、徐々に水分を再水和する。 5分間浸す。このプロセスを3回繰り返します。
4. 最後のすすぎの後、すべてのエタノール/水溶液を注ぎ、それを100％蒸留水で置き換えます。腺を5分間浸す。
5. 蒸留水を注ぎ、腺をカルミンミョウバン溶液に浸します。厚さに応じて、腺を12〜24時間染色します。
   注：腺は過剰染色することはできませんが、複数のバッチの染色時間は同じでなければならず、その結果、染色強度は同じになります。
6. カルミンミョウバン溶液を注ぎ、腺を100％蒸留水で30秒間すすいでください。 70％エタノールに15分間、95％エタノールに15分間浸漬することにより腺を徐々に脱水し、100％エタノールで20分間処理した。
7. 脂肪の腺をクリアするには、厚さに応じてキシレンに12〜72時間浸す。
   注：腺は半透明（透明）でなければなりません。不透明な（白っぽい）部分が残っている場合は、キシレンで半透明まで浸漬してください。乳汁分泌腺または非常に厚い腺が染色され、除去される場合、腺を完全に浄化するためにキシレンを一度交換する必要があり得る。
8. スライドをキシレンベースのマウントメディアでマウントし、グランドをカバーするのに十分な培地をピペッティングします。カバースリップを加え、気泡が発生しないようにします。
9. スライドを乾燥させます。マウントメディアが乾燥すると、カバースリップの下で収縮し、マウントメディアを追加する必要があります。追加の培地が不要になったら、スライドを完全に乾燥させます。これは2〜3週間かかります。
10. スライドが完全に乾燥したら、綿棒と少量のキシレンで残りのマウントメディアを取り除くことができます。使用しないように注意してくださいこれがマウント媒体を溶解し、カバースリップを緩めることができるので、キシレンが多すぎる。これが起こって気泡がカバーガラスの下に集まる場合は、カバーグラスをキシレンで除去し、取り付けプロセスを繰り返す必要があります。

3.分析のために全体マウント画像を準備する

1. 巨視的顕微鏡または解剖顕微鏡と適切なソフトウェアを備えたデジタルカメラを使用して、全体マウント（ 図3 ）の画像をキャプチャします。
   注：腺上皮全体を撮影する任意の倍率を選択することができますが、同じ倍率でお互いに比較されるすべての全マウント画像をキャプチャすることが不可欠です。
2. ImageJソフトウェア（またはフィジーのソフトウェア）をダウンロードしてください^6。
3. 「File」→「Open」をクリックして、ImageJで乳房全身画像を開きます。フリーハンドツールを選択し、腺上皮をトレースします。 "編集"＆＃8594; "外のクリア。
   1. ノード周辺をトレースし、Freehandツールを使用してリンパ節を除去し、 "Edit"→ "Cut"
4. 「画像」→「色」→「分割チャンネル」を選択して色チャンネルを区切ります。最もコントラストの良いチャンネル、通常は青色のチャンネルを選択します。
   注：RGBイメージは、そのイメージの赤、緑、青のコンポーネントのスタックで構成されています。これにより、これらのコンポーネントが3つの8ビットグレースケール画像に分離されます。
5. 「プロセス」→「バックグラウンドを差し引く」を選択してバックグラウンドを引きます。必要なパラメータを選択し、[プレビュー]をクリックして変更をプレビューします。
   注：「バックグラウンドを引く」は滑らかで連続的な背景を削除します。さらに、「プロセス」→「フィルタ」→「アンシャープマスク」を使用してコントラストを作成することができます。
6. 1つを選択してください eノイズを自動的に除去する方法には以下のものがあります。
   注：ImageJは自動ノイズ除去の第3の方法を提供しています.NaNを削除します。ただし、remove NaNsコマンドは32ビットイメージを使用し、現在のメソッドは8ビットイメージを使用するため適用されません。
   1. "プロセス"→ "ノイズ"→ "スペックル除去"を選択して、スペックル解除コマンドを使用してノイズを除去します。
      注：これは、各ピクセルをその3×3近傍の中央値で置き換えるメジアンフィルタを追加するのと同じです。
   2. 「プロセス」→「ノイズ」→「異常値の除去」を選択して、アウトライヤー除去コマンドを使用してノイズを除去します。
      注：このプロセスは、中央値から特定の値（しきい値）を超えて逸脱する場合、ピクセルを直近の周囲のピクセルの中央値に置き換えます。
7. 残りのノイズを手動で除去する（lass = "xfig">図4）。
   1. 元の画像のコピーを開き、これを雑音ではないものの目安としてください。ツールバーの右端にある二重赤矢印ボタンをクリックします。描画ツールを選択します。 [ツール]ボタンがツールバーに表示されます。
   2. [消しゴム]ツールをクリックします。消しゴムのツールボタンを右クリックして、消しゴムの直径を調整します。ノイズを消去するには、マウスの左ボタンを押したままにします。
      注記：消去のセッションは1回だけ取り消すことができます。マウスの左ボタンを離してもう一度クリックすると、以前の消去を元に戻すことはできません。
8. 「画像」→「調整」→「しきい値」を選択して、しきい値を調整します。スライダーを動かして、グランド（グランド）の適切な描写が得られるまで、最小（上部スライダー）および最大（下部スライダー）のしきい値を調整します。
   注記：しきい値を設定すると、グレースケールイメージが対象のフィーチャとバックグラウンドフィーチャに分割されます。
   1. 「適用」をクリックします。必要に応じて、3.6.1および3.6.2の手順に従って、この時点で追加のノイズを除去します。
9. 閾値処理およびノイズ除去によって除去された腺上皮の部分を再構築する（ 図5 ）。
   1. 元の画像の完全性を維持するために、画像再構成を慎重かつ最小限に実行します。上皮ではないものとそうでないものについては、元の画像を参考にしてください。
   2. スプレーキャンツ​​ールをクリックします（ツールのツールバーで）。 Spray Canツールボタンを右クリックして、スプレーの直径と速度を調整します。マウスの左ボタンをクリックするか押さえて、腺の欠けている部分を慎重に記入してください。
10. ショール分析を行うための腺のスケルトン画像を作成します。 「処理」→「バイナリ」→「Bを作成」を選択して、閾値処理された画像がバイナリであることを確認します inary "
    1. 黒い背景の画像が白い場合は、「処理」→「バイナリ」→「オプション」を選択し、「黒い背景」のチェックを外します。 「プロセス」→「バイナリ」→「スケルトン化」を選択してイメージをスケルトン化します。
       注：これは、バイナリイメージが1ピクセル幅の形状に縮小されるまで、ピクセルを繰り返し削除します。
    2. 「処理」→「バイナリ」→「拡大」を選択して、画像を1回拡大します。
       注：これは、バイナリイメージのエッジにピクセルを追加することで、しきい値処理とス​​ケルトン化によって作成されたギャップを埋めます。
11. 「ファイル」→「名前を付けて保存」を選択して画像を保存します。イメージタイプ（通常jpeg）を選択し、ファイル名を入力して「OK」をクリックします。
12. スケルトン画像を元の画像にオーバーレイすることによって、スケルトン画像の精度を確認します（ass = "xfig">図6）。
    1. 元画像とスケルトン画像の両方を開いてオーバーレイを作成します。 「画像」→「オーバーレイ」→「画像を追加」を選択します。 [画像の追加]ダイアログボックスで、[追加する画像]ドロップダウンメニューからスケルトン画像を選択し、不透明度を30％に設定します。
    2. 「ファイル」→「名前を付けて保存」を選択して、重ねたスケルトン画像のイメージを元のイメージに保存します。イメージの種類を選択し、ファイル名を入力して「OK」をクリックします。

4.ショール分析を行う

1. スケルトン画像を開き、「プロセス」→「バイナリ」→「バイナリにする」を選択して画像をバイナリにします。
   1. 倍率を設定する前に、画像がキャプチャされた倍率のマイクロメータを使用してピクセル数/ mmを測定します。
   2. 測定された倍率を設定する"Analyze"→ "Set Scale"を選択してください。ピクセル数/ mmを入力します。 "Known Distance"と "Pixel Aspect Ratio"の両方を1に設定します。 "Unit of Length"に "mm"を入力し、 "Global"（各画像に同じ縮尺を維持）をチェックします。
2. 一次ダクトの開始点（分析の中心）から腺上皮の最も遠位の点まで線を描くことによってSholl分析の終了半径（包囲半径）を決定する（ 図7 ）。
   1. ツールバーの線描画ツールを使用して、対象点間に線を描画します。 "M"キーを押して測定を行い、結果ウィンドウが開くことに注意してください。
      注記：「長さ」列の値は、線の長さ（mm）です。 Shollパラメータを設定するとき、この値はEnding Radiusとして自動的に入力されます。 Shollプラグインは開始点を使用しますセントリックリングの中心としての線の長さ。
3. ショール分析の実行。
   1. "Plugins" "Advanced Sholl Analysis"を選択して分析を実行します。パラメータウィンドウが表示されます。
   2. 「I.シェルの定義」の開始半径を0.00 mmに設定します。手順4.2で測定された線の長さが自動的に「終了半径」として入力されます。
   3. 「半径のステップサイズ」を0.1 mmに設定します。
      注記：半径のステップサイズによって、リングの数が決定されます（実際には反復の回数）。より小さいステップサイズはリングの数を増加させ、大きいステップサイズはリングの数を減少させる。直径が小さすぎると、リングの数が不必要に多くなりますが、半径はあまり小さく設定できません。しかし、それはあまりにも大きく設定することができます。これにより、リングが少なくなり、実際に交差点の実際の数が過小評価されます。 Stanko et al。（2015）を参照してください。
   4. "II。Multiple Samples per Radius"で "＃Samples"を1に、 "Integration"を "Mean"に設定してください。
   5. 「囲み半径カットオフ」を1に設定し、「III。記述子と曲線近似」の「＃主分岐」の「開始半径から推論する」をチェックします。
      注：「プロファイルと計算記述子を適合させる」および「フィッティング詳細を表示する」は、必要に応じてチェックすることができます。
   6. 「線形」をチェックし、「正規化なしのプロファイル」で「最適フィッティング度」を選択します。 「最も有益な情報」をチェックしてください。 「IV. Sholl Methods」の「Normalized Profilesのエリア」を選択します。
   7. 「V.出力オプション」の「交差点マスクの作成」をチェックして、交差点のヒートマップを作成します（オプション）。
   8. 「Cf. Segmentation」をクリックして、リングの画像のプレビューウィンドウを生成して領域を確認します分析の
4. [OK]をクリックして分析を実行します。

5.MEAの測定

1. 上皮樹の周りの最短距離を追跡することによってMEAを測定する（ 図8 ）。
   1. グランドのスケルトン画像が開いているImageJで、ポリゴンツールをクリックします。上皮樹の周囲の点をクリックしてポリゴンを開始し、腺の周囲を移動してクリックして線分を追加します。
   2. 上皮領域全体が迂回されたら、ポリゴンをダブルクリックして閉じます。結果ウィンドウを開くには "M"キーを押します。 「エリア」欄の値はMEAです。
2. 腺上皮がリンパ節を越えて広がっている場合は、分岐密度を計算する際にMEAからリンパ節領域（LNA）を差し引く。
   1. 同じマンのリンパ節を追跡してLNAを測定する"M"を押すと、
      注：リンパ節はLNA内の交点を数えないようにリンパ節が判断するため、MEAからLNAを差し引かなければなりません。上皮がリンパ節に達していない場合、LNAはゼロである。

6.レポートデータ

1. 包囲半径、MEA、N、 k 、および分岐密度の値を報告します。
   注記：囲み半径はステップ4.2で決定され、MEAはステップ5.1で決定されます。
   1. 分析を実行してSholl resultsウィンドウを生成します。
      注：報告されたNは、sumの和の値です。報告されたkはSholl回帰係数（半対数）の値です。 Sholl分析は、腺上皮の測定された任意の領域に対してkの値を返す。完全な上皮上のkの正確な値を得るためには、管末端が存在していなければならない。
   2. 変更するe分岐の密度を計算するためにNの出力値を使用して乳腺のSholl解析を行う（この方法の基本的な評価項目）。式N /（MEA-LNA）を用いて分枝密度を計算し、その値をN / mm ²として報告する。

結果

このプロトコールで分析した乳腺の測定された封入半径、MEA、N、 kおよび計算された分枝密度の値を表1に報告する。 Sholl解析では、各半径（ 図9 ）および交差点のヒートマップ（選択されている場合）の交点数の線形および半対数プロットが生成されます（ 図10 ）。あまり発達していない腺は、同じMEA...

ディスカッション

出産から思春期まで、乳腺の成長はアロマティックである。思春期後、乳腺は、乳腺上皮が脂肪パッド全体を占有するまで、広範な管分岐および伸長を経て発達する。分枝特性は乳腺発達の重要な側面であり、これらの特性を客観的に定量化する能力は、乳房の正常な発育を評価し、乳房毒性物質への早期曝露後の異常な発達を同定するために非常に有用であり得る。

?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting board	NA	NA	A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins	Daigger	EF7419A
Spray bottle with ethanol	NA	NA	70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors	Fine Science Tools	14569-09
Straight dissecing scissors	Fine Science Tools	14568-09
Curved forceps	Fine Science Tools	11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001	Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.
Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm	Fisher scientific	12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film	Fisher scientific	13-374-12
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)	Sigma-Aldrich	24102
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A6435
Permount mounting media	Fisher Scientific	SP15
Macroscope	Leica	Z16 APO	This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera	Leica	DFC295
Camera software	Leica	Leica Application Suite v3.1
ImageJ software	Open source	http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis	Open source	http://imagej.net/Sholl_Analysis