Количественная оценка плотности ветвлений в клетках грудной железы крысы с полным ходом с использованием метода анализа Sholl

Резюме

Развитие молочной железы у грызунов обычно оценивалось с использованием описательных оценок или путем измерения основных физических характеристик. Плотность ветвления является показателем развития молочной железы, который трудно объективно оценить количественно. Этот протокол описывает надежный метод количественной оценки характеристик ветвления молочной железы.

Аннотация

Все большее число исследований использует молочную железу грызунов в качестве конечной точки для оценки токсичности развития химического воздействия. Эффекты, которые эти воздействия оказывают на развитие молочной железы, обычно оцениваются с использованием либо основных измерений размеров, либо путем оценки морфологических характеристик. Однако широкий спектр методов интерпретации изменений в области развития может привести к несовместимым переводам в лабораториях. Необходим общий метод оценки, чтобы можно было интерпретировать правильные интерпретации из сопоставимых данных по исследованиям. В настоящем исследовании описывается применение метода анализа Шолла для количественной оценки характеристик ветвления молочной железы. Метод Sholl был первоначально разработан для использования при количественном определении нейронных дендритных структур. Используя ImageJ, пакет программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом и плагин, разработанный для этого анализа, плотность разветвления молочной железы и сложность amОпределяли аммиачную железу от перипубертальной женской крысы. Описанные здесь методы позволят использовать анализ Sholl как эффективный инструмент для количественной оценки важной характеристики развития молочной железы.

Введение

Разветвление молочной железы является характеристикой, которая обычно оценивается как индикатор развития железы, но ее объективно объективно оценить невозможно. В 1953 году Шолл ¹ описал метод измерения нейронной дендритной арборизации в зрительной и моторной коре кошки, а плагин для этой техники был разработан Ферриере и др. ² . Поскольку и нейроны, и молочные железы имеют сходную древовидную структуру, плагин использовался для количественного определения плотности размножения эпителиальных млекопитающих в двумерных изображениях молочной железы перибубертальной крысы. Перипубертальный этап был выбран для анализа, потому что отлучение - это жизненный этап, который часто оценивается в академических лабораториях и исследованиях по тестированию. Анализ Sholl представляет собой плагин, распространяемый с помощью FIJI, который представляет собой пакет обработки изображений ImageJ с открытым исходным кодом, включая дополнительные плагины. Плагин создает ряд концентрических колец, окружающих predef(Как правило, сома нейрона или происхождение первичного канала молочной железы) и простирается до самой дистальной части объекта (радиус окружения). Затем он подсчитывает количество пересечений (N), которые встречаются на каждом из колец. Плагин также возвращает коэффициент регрессии Sholl ( k ), который является измерением скорости распада эпителиального ветвления.

Используя ImageJ, создается скелетонизированное изображение цельной смолы молочной железы и измеряется площадь эпителия молочной железы (MEA). Изображение анализируется с использованием плагина анализа Sholl, а значения для N и k , среди других значений, не используемых здесь, возвращаются. Плотность разветвления эпителия молочной железы определяется путем расчета N / MEA. Степень, в которой ветвление продолжается во внешних областях железистого эпителия, является сложностью ветвления и является показателем равномерного роста дистального эпителия. Поскольку k является мерой дистального уменьшения в эпитетеВетвь элиты, это эффективная мера сложности ветвления и надежный показатель развития молочной железы.

В этом протоколе описывается компьютерный метод для создания скелетонизированных изображений цельных гормонов молочной железы и количественной оценки характеристик ветвления молочной железы у перипубертальных самцов и самцов крыс. Этот метод является относительно быстрым и не требует использования специализированного оборудования для микроскопии. Разработка и валидация этого метода описаны в Stanko et al. (2015 год) ³ . В этом отчете также описывается подготовка крысиной молочной железы all = mounts. Подобные процедуры полного восстанавления молочной железы описаны в работе Assis et al. (2010) ⁴ и Plante et al. (2011 год) ⁵ .

протокол

Все виды использования животного и процедуры для этого исследования были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных NIEHS в Лаборатории животных и проведены в Ассоциации по оценке и аккредитации аккредитованного лабораторией по уходу за животными.

1. Акцизные молочные железы

1. Предварительно маркируйте все слайды с использованием метода ксилола (лучше всего работает карандаш). Накройте их монтажным раствором в конце, чтобы сохранить этикетку.
2. Усыплять животное по методике, утвержденной Институтом по уходу и использованию животных.
3. После эвтаназии положите животное на спину на рассекающую доску ( рис. 1 ). Протяните и сожмите все четыре конечности, при этом задние конечности образуют перевернутый V (удерживающие штифты или иглы малого калибра хорошо работают).
4. Разбрызгивайте живот либерально 70% этанолом, чтобы держать волосы вне образца молочной железы.
5. Используя щипцы, подтяните брюшную кожу на средней линии и сделайте небольшой разрез сРассекающие ножницы, стараясь не прокалывать брюшину.
   1. Начиная с надреза, разрезать кожу до области шеи, а затем дистально до передней конечности. Вырезать до паховой области, а затем дистально к первому суставу задней конечности на той же стороне; Этот разрез обычно разделяет молочные железы 5 и 6. Избегайте срезания брюшины.
   2. Вытяните кожу с прикрепленной грудной клеткой с помощью щипцов, аккуратно отделив ее от брюшины, используя тупой конец ножниц для рассечения. Отделите как можно дальше дорсально, чтобы полностью открыть 4- ^ю и 5- ^ю паховые молочные железы на нижней стороне кожи; Прикрепите кожу к рассекающей доске ( рис. 2 ).
   3. Аккуратно возьмитесь за молочную ткань 5- ^й железы с закругленной стороной изогнутых щипцов и медленно очертите сальник от кожи, стараясь не наклеить железу или кожу.
   4. Продолжайте обрезать,Двигаясь дорзально до тех пор, пока 4- ^я и 5- ^я железы не будут полностью сняты с кожи. Убедитесь, что область сосков удалена остальной частью сальника, поскольку это служит отправной точкой для анализа Шолла. Вырежьте молочную ткань вдали от тела, где она прикреплена к железу 4.
6. После удаления железы с животного равномерно распределите его на электростатически заряженном слайде с микроскопом размером 25 мм х 75 мм х 1 мм со стороной, прилегающей к коже вниз.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для желез у пожилых или кормящих животных может потребоваться 51 x 75 x 1 мм слайд.
7. Надев перчатки, аккуратно выжмите пузырьки воздуха. Накройте железом пластиковую парафиновую пленку и другой слайд микроскопа и сжимайте сальник, чтобы прикрепить его к предмету слайда.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Коническую трубку объемом 50 мл, наполненную водой, служит подходящим весом. Количество времени, необходимое для прикрепления к слайду, зависит от толщины сальника. Тонкая, постна(PND) 4 железы должны быть сжаты в течение минимум 30 минут, тогда как более толстые взрослые железы могут потребовать 2-5 часов.

2. Подготовьте все мазки для грудных детей

1. Предварительно подготовьте раствор карминового квасца по крайней мере за 24 часа, так как это требует кипения и охлаждения.
   1. Растворить 1 г карминового квасца и 2,5 г сульфата алюминия (AlK (SO ₄ ) ₂ · 12H ₂ O) в 500 мл дистиллированной воды и кипятить в течение 20 минут в 1-литровой колбе. Довести конечный объем до 500 мл с использованием дистиллированной воды.
   2. Фильтрация раствора через фильтровальную бумагу под вакуумом и охлаждение для хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: раствор карминового квасца можно повторно использовать, но его следует отбрасывать, когда цвет начинает исчезать.
2. Перед фиксацией очистите парафиновую пленку от железы, стараясь не вытащить сальник с ползуна. Поместите слайд (ы) в стеклянную баню с пятнами и погрузите в фиксатор (100% этанОл, хлороформ и ледяная уксусная кислота в соотношении 6: 3: 1) в течение 12-48 ч, в зависимости от толщины желез.
3. Налейте фиксатор и впитайте железы в 70% этаноле в течение 15 минут. Постепенно регидратируйте железы, выливая 1/3 раствора этанола и заменяя его дистиллированной водой. Замочить в течение 5 мин. Повторите этот процесс три раза.
4. После окончательного полоскания вылейте весь раствор этанол / вода и замените его 100% дистиллированной водой. Замочите железы в течение 5 мин.
5. Вылейте дистиллированную воду и погрузите железы в раствор карминового квасца. Окрашивайте железы в течение 12-24 часов, в зависимости от толщины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: железы не могут быть перекрашены, но время окрашивания для нескольких партий должно быть одинаковым, чтобы интенсивность окрашивания была одинаковой.
6. Вылейте раствор карминового квасца и промойте железы в 100% дистиллированной воде в течение 30 с. Постепенно обезвоживают железы, впитывая их в 70% этаноле в течение 15 мин, 95% этанола в течение 15 мин,100% этанола в течение 20 мин.
7. Очистите железы жиров, впитав их в ксилол в течение 12-72 часов, в зависимости от толщины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: железы должны быть полупрозрачными (прозрачными). Если остаются непрозрачные (беловатые) области, продолжайте вымачивать в ксилоле до полупрозрачного. Если лактирующие или иначе очень толстые железы окрашиваются и очищаются, ксилол может потребоваться заменить один раз, чтобы полностью очистить железы.
8. Установите слайды с помощью монтажной среды на основе ксилола, пипетируя достаточное количество среды, чтобы просто покрыть сальник. Добавьте покровное, чтобы не образовывались пузырьки воздуха.
9. Дайте слайдам высохнуть. По мере того, как монтажная среда высыхает, она сжимается под покровным слоем, и может потребоваться добавить дополнительную монтажную среду. Если не требуется дополнительная среда, дайте слайдам полностью высохнуть; Это может занять 2-3 недели.
10. Как только слайды полностью высохнут, любая остаточная монтажная среда может быть удалена ватным тампоном и небольшим количеством ксилола. Будьте осторожны, чтобы не использоватьСлишком много ксилола, так как это может растворить установочную среду и ослабить покровное. Если это происходит, и пузырьки воздуха собираются под покровным покровом, покровное стекло следует удалить в ксилоле, и процесс монтажа следует повторить.

3. Подготовьте изображения целиком для анализа

1. Захват изображений целых монстров ( рисунок 3 ) с помощью макроскопа или рассекающего микроскопа и цифровой камеры с соответствующим программным обеспечением.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Несмотря на то, что любое увеличение, которое захватывает весь железистый эпителий, может быть выбрано, необходимо зафиксировать все изображения с полным креплением, которые будут сравниваться друг с другом при одинаковом увеличении.
2. Загрузите программное обеспечение ImageJ (или программное обеспечение FIJI). ⁶ .
3. Откройте изображение целиком в молочной железе в ImageJ, нажав «Файл» → «Открыть». Выберите инструмент Freehand и проследите вокруг железистого эпителия. Выберите «Изменить» & #8594; «Очистить снаружи».
   1. Удалите лимфатические узлы, проследив вокруг узла и используя инструмент Freehand и «Edit» → «Cut».
4. Отделите цветные каналы, выбрав «Изображение» → «Цвет» → «Разделить каналы». Выберите канал с наилучшим контрастом, обычно синий.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Изображение RGB состоит из стопки красных, зеленых и синих компонентов этого изображения. Это действие разделяет эти компоненты на три 8-битных изображения в оттенках серого.
5. Вычеркните фон, выбрав «Процесс» → «Вычесть фон». Выберите нужные параметры и нажмите «Предварительный просмотр», чтобы просмотреть изменения.
   ПРИМЕЧАНИЕ. «Вычесть фон» удаляет гладкие непрерывные фоны. Кроме того, для создания контраста можно использовать «Процесс» → «Фильтры» → «Маска нерезкости».
6. Выберите один из E следующие методы автоматического удаления шума: despeckle или удалить выбросы.
   ПРИМЕЧАНИЕ. ImageJ предлагает третий метод автоматического удаления шума: удалите NaNs. Однако команда удаления NaNs неприменима, поскольку она использует 32-битные изображения, а текущий метод использует 8-битные изображения.
   1. Удалите шум с помощью команды despeckle, выбрав «Process» → «Noise» → «Despeckle».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это эквивалентно добавлению медианного фильтра, который заменяет каждый пиксель на медианное значение в его окрестности 3 × 3.
   2. Удалите шум, используя команду удаления выбросов, выбрав «Процесс» → «Шум» → «Удалить выбросы».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот процесс заменяет пиксель средой пикселей в ближайшем окружении, если он отклоняется от медианы более чем на определенное значение (порог).
7. Удалите все оставшиеся шумы вручную (Lass = "xfig"> Рисунок 4).
   1. Откройте копию исходного изображения и используйте это как руководство для того, что есть и что не является шумом. Нажмите кнопку двойной красной стрелки в крайнем правом углу панели инструментов. Выберите Инструменты рисования; Теперь на панели инструментов появятся кнопки Drawing Tool.
   2. Нажмите инструмент «Ластик». Отрегулируйте диаметр ластика, щелкнув правой кнопкой мыши на кнопке Eraser. Удерживайте левую кнопку мыши, чтобы стереть шум.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Только один сеанс стирания может быть отменен. После того, как левая кнопка мыши будет отпущена и снова будет нажата, предыдущее удаление не может быть отменено.
8. Отрегулируйте порог, выбрав «Изображение» → «Настроить» → «Порог». Переместите ползунки, чтобы настроить минимальные (верхний ползунок) и максимальные (нижний ползунки) пороговые значения, пока не будет достигнуто адекватное изображение сальника.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Установка пороговых значений сегментирует изображения в оттенках серого в интересующие объекты и фон.
   1. Нажмите «Применить». При необходимости удалите дополнительный шум в этот момент, выполнив шаги 3.6.1 и 3.6.2.
9. Восстановить части железистого эпителия, которые были удалены с помощью порога и удаления шума ( рис. 5 ).
   1. Проведите реконструкцию изображения тщательно и на минимальной основе, чтобы сохранить целостность исходного изображения. Обратитесь к исходному изображению за ссылкой о том, что есть и что не является эпителием.
   2. Нажмите инструмент Spray Can (на панели инструментов с помощью инструментов рисования). Отрегулируйте диаметр и скорость распыления, щелкнув правой кнопкой мыши на кнопке инструмента Spray Can. Аккуратно заполните отсутствующие участки железы, нажав или удерживая левую кнопку мыши.
10. Создайте скелетный образ железы для проведения анализа Sholl. Убедитесь, что пороговое изображение является двоичным, выбрав «Процесс» → «Двоичный» → «Сделать B Инары «.
    1. Если изображение белого цвета на черном фоне, выберите «Процесс» → «Двоичный» → «Параметры» и снимите флажок «Черный фон». Скелетонируйте изображение, выбрав «Процесс» → «Двоичный» → «Скелезонировать».
       ПРИМЕЧАНИЕ. Это неоднократно удаляет пиксели с краев двоичного изображения, пока оно не будет уменьшено до одной пиксельной формы.
    2. Разбавьте изображение один раз, выбрав «Процесс» → «Двоичный» → «Разбавить».
       ПРИМЕЧАНИЕ. Это заполняет пробелы, созданные порогом и скелетонированием, добавляя пиксели к краям двоичного изображения.
11. Сохраните изображение, выбрав «Файл» → «Сохранить как». Выберите тип изображения (обычно jpeg), введите имя файла и нажмите «ОК».
12. Проверьте точность скелетонированного изображения путем наложения скелетонированного изображения на исходное изображение (Рис. 6).
    1. Создайте наложение, открыв как исходное изображение, так и скелетонированное изображение. Выберите «Изображение» → «Наложение» → «Добавить изображение». В диалоговом окне «Добавить изображение» выберите изображение скелета из раскрывающегося меню «Изображение для добавления» и установите непрозрачность на 30%.
    2. Сохраните изображение скелета, наложенного на оригинал, выбрав «Файл» → «Сохранить как». Выберите тип изображения, введите имя файла и нажмите «ОК».

4. Проведите анализ Sholl

1. Откройте изображение скелета и сделайте двоичный файл изображения, выбрав «Процесс» → «Двоичный» → «Сделать двоичный файл».
   1. Перед установкой шкалы увеличения измерьте количество пикселей / мм с помощью микрометра для увеличения, при котором изображения были захвачены.
   2. Установите измеренное увеличение sCale, выбрав «Анализ» → «Установить масштаб». Введите количество пикселей / мм. Установите «Известное расстояние» и «Соотношение пикселей пикселей», равное 1. Введите «мм» для «Единицы измерения длины» и отметьте «Глобальный» (поддерживает одинаковый масштаб для каждого изображения).
2. Определите радиус окончания (охватывающий радиус) для анализа Шолла, вычерчивая линию от начала первичного протока (центр анализа) до самой дистальной точки железистого эпителия ( рис. 7 ).
   1. Используйте инструмент рисования линии на панели инструментов, чтобы нарисовать линию между представляющими интерес точками. Нажмите клавишу «M», чтобы выполнить измерение, и обратите внимание, что откроется окно результатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Значение в столбце «Длина» - это длина строки в мм. Это значение будет автоматически вводиться как конечный радиус при настройке параметров Sholl. Плагин Sholl будет использовать начальную точкуЛинии как центра центрических колец.
3. Выполнение анализа Sholl.
   1. Запустите анализ, выбрав «Плагины» «Расширенный анализ Sholl»; Появится окно параметров.
   2. Установите начальный радиус в «I. Определение оболочек» на 0,00 мм; Длина линии, измеренная на шаге 4.2, автоматически вводится как «Конечный радиус».
   3. Установите «Шаг шага радиуса» на 0,1 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Размер шага радиуса определяет количество колец (фактически количество итераций); Меньший размер шага увеличит количество колец, в то время как больший размер шага уменьшит количество колец. Радиус не может быть установлен слишком малым, хотя чрезмерно малый радиус приведет к излишне большому числу колец. Однако он может быть установлен слишком большим, что создаст меньше колец и впоследствии недооценивает истинное количество пересечений. См. Stanko et al.(2015) для получения дополнительной информации об определении размера шага.
   4. Установите «# Образцы» на 1 и «Интеграция» на «Среднее» в «II. Несколько образцов на радиус».
   5. Установите «Обрезание радиуса закрытия» на 1 и проверьте «вывести из радиуса начала» для «# Первичные ветви» в «III. Дескрипторы и фитинг кривой».
      ПРИМЕЧАНИЕ: «Скомпоновать профиль и дескрипторы вычислений» и «Показать детали фитинга» можно проверить по желанию.
   6. Проверьте «Линейный» и выберите «Наилучшая степень соответствия» в разделе «Профили без нормализации»; Проверьте «Наиболее информативный». Выберите «Область для нормализованных профилей» в «IV. Методы Sholl».
   7. Установите флажок «Создать маску пересечений» в «V. Параметры вывода», чтобы создать тепловую карту пересечений (необязательно).
   8. Нажмите «Cf.segmentation», чтобы создать окно предварительного просмотра изображения с кольцами для подтверждения областиАнализа.
4. Нажмите «ОК», чтобы запустить анализ.

5. Измерение MEA

1. Измерьте MEA, проследив кратчайшее расстояние вокруг эпителиального дерева ( рис. 8 ).
   1. В ImageJ с изображением скелета сальника откройте инструмент Polygon. Нажмите на точку по периметру эпителиального дерева, чтобы начать многоугольник, передвиньтесь по периметру железы и нажмите, чтобы добавить сегмент линии.
   2. Когда вся эпителиальная область была обойдена, дважды щелкните, чтобы закрыть многоугольник. Нажмите клавишу «M», чтобы открыть окно результатов; Значение в столбце «Площадь» - это MEA.
2. В случаях, когда железистый эпителий выходил за пределы лимфатического узла, вычитайте площадь лимфатических узлов (МШУ) из МЭА при расчете плотности ветвления.
   1. Измерьте МШУ, проследив лимфатический узел в той же маннеEr как эпителиальное дерево и нажатие «M.»
      ПРИМЕЧАНИЕ. В этих случаях МШУ следует вычесть из МЭА, поскольку лимфатический узел не позволяет анализировать подсчет пересечений в МШУ. Когда эпителий не достиг лимфатического узла, МШУ равен нулю.

6. Отчетные данные

1. Сообщите значения радиуса окружения, MEA, N, k и плотности ветвления.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Радиус окружения определяется на этапе 4.2, а МЭА определяется на этапе 5.1.
   1. Запустите анализ, чтобы создать окно результатов Sholl.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Сообщенный N является значением для суммы. Сообщаемое значение k является значением коэффициента регрессии Sholl (полулогарифмический). Анализ Sholl вернет значение для k по любой измеренной области железистого эпителия. Чтобы получить точное значение для k над полным эпителием, должны присутствовать протонные концы.
   2. ИзменитьE Sholl-анализ для молочной железы с использованием выходного значения для N для вычисления плотности ветвления (основной конечной точки этого метода). Вычислите плотность разветвления с использованием формулы N / (MEA-LNA) и сообщите значение как N / мм ² .

Результаты

Значения измеренного замкнутого радиуса, MEA, N, k и расчетной плотности ветвления для молочной железы, проанализированные в этом протоколе, представлены в таблице 1 . Анализ Sholl генерирует линейные и полу-логовые графики числа пересечений в каждом радиусе (...

Обсуждение

От рождения до полового созревания рост молочной железы является аллометричным. После полового созревания молочная железа развивается в результате обширного ветвления и удлинения протоков, которые продолжаются до тех пор, пока эпителий молочной железы не займет всю жировую подушку. ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting board	NA	NA	A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins	Daigger	EF7419A
Spray bottle with ethanol	NA	NA	70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors	Fine Science Tools	14569-09
Straight dissecing scissors	Fine Science Tools	14568-09
Curved forceps	Fine Science Tools	11003-12
Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001	Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.
Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm	Fisher scientific	12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film	Fisher scientific	13-374-12
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)	Sigma-Aldrich	24102
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A6435
Permount mounting media	Fisher Scientific	SP15
Macroscope	Leica	Z16 APO	This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera	Leica	DFC295
Camera software	Leica	Leica Application Suite v3.1
ImageJ software	Open source	http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis	Open source	http://imagej.net/Sholl_Analysis