神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

要約

このプロトコルを記述する簡易分離し培養 6 7 日古い子犬、CGNs の損失のための効率的な伝達と機能の研究、益からプライマリ マウス脳顆粒ニューロン (CGNs) と nmda 刺激による神経毒性、モデリング法低カリウムによって誘導される細胞死、DNA 損傷と同じ文化モデルを用いた酸化ストレス。

要約

小脳顆粒ニューロン (CGNs) が一般的に使用される神経のモデルは、小脳の豊富な同質な人口を形成です。自分の出生後の開発、豊富とアクセシビリティの観点から CGNs が神経突起は、神経発生、神経移行、生理学的神経刺激などの研究に理想的なモデルです。加えて、CGN 文化は応需型やアポトーシスなどの細胞死の別のモードを研究するためのエクセレント モデルを提供します。文化週間以内は、CGNs は、N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体、神経の健康および病気の多くの重要な機能を備えた特定イオン型グルタミン酸受容体を表現します。齧歯動物の初代 CGN 培養膜脱分極電位と組み合わせて NMDA の低濃度添加は NMDA の高濃度添加をモデルに用いることができる生理学的神経刺激モデルに使用されています顎神経細胞傷害。ここでは、分離法、アデノ ウイルス、レンチで CGNs の遺伝子操作と同様に、6 日間の古い子犬から CGNs の培養を説明します。我々 は NMDA 誘発毒性、低カリウムによるアポトーシスの誘導、酸化ストレス、これらのニューロンの情報伝達に続く DNA 損傷を刺激する方法も現在の最適化されたプロトコル。

概要

小脳顆粒ニューロン (CGNs) 文化によく特徴があり、神経細胞死および開発^1,2,3,4,5,を勉強する効果的なモデルを務めています。⁶。 CGN 文化の in vitro N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体の早期発現が nmda シグナル伝達研究に魅力的なモデルをさせます。膜脱分極と組み合わせて NMDA とこれらの受容体の活性化は生理学的神経刺激をモデル化する使用され、シナプス可塑性^7,8のメカニズムに研究の許可されています。それどころか、応需型、急性脳損傷や神経変性疾患⁹で神経細胞の損失の主要なメカニズムをモデル化する NMDA リガンドによるこれらの受容体の過剰刺激を使用できます。応需型の誘導のメカニズムの 1 つは、急性神経障害と見られる減らされた酸素は、ATP 飢えです。これは、結果、膜の脱分極でグルタミン酸のレベルが上昇、および解放シナプス。過剰な Ca^{2 +}流入これらの受容体を介した Ca^{2 +}を含むいくつかの経路を順番にアクティブに昇格したグルタミン酸により NMDA 受容体の後続の overstimulation-活性化プロテアーゼ、ホスホリパーゼと酵素、重要な細胞内成分および細胞死の制御不能な劣化の結果します。さらに、高い細胞内 Ca^{2 +}酸素フリーラジカルとミトコンドリア損傷^10,11の発生につながります。

一方 nmda 刺激による神経毒性に伴う神経の損失の大半はカルシウム流入によるもので、バックス/博独立、細胞死の他のメカニズムは、このモデルから除外できません。壊死の両方の外観とアポトーシス毒性による細胞死は部分的に^{高い細胞内 Ca 2 +}レベル¹²によって引き起こされる DNA 損傷反応酸素種 (ROS) の生成のためのような。DNA 損傷はアポトーシス細胞死は、クロマチンの固まりおよびアポトーシス小体の外観などの特徴と関連づけられている、アポトーシスのメカニズムによって神経細胞死の結果します。アポトーシスの誘導、ミトコンドリアからシトクロム c の放出を介したし、バックス/Bak 重合¹³に依存するが示されています。バックス/Bak 重合は、シトクロム c の放出およびプロアポトーシス レギュレータ、軽度の虚血性損傷¹⁴で見るの活性化の結果、外ミトコンドリア膜の細孔形成を推進しています。

ROS の生成は、酸化防止剤、神経機能¹⁵の大きな酸素要求と相まって低内因性レベルのため脳に重要な問題です。虚血性イベントにさらされる, 一酸化窒素合成酵素は誘導、一酸化窒素の生産および活性酸素種¹⁴の増加です。酸素ラジカルの濃度の増加は DNA 損傷が発生し、エネルギー飢餓を間接的に引き起こす可能性ができます。ポリ ADP リボース ポリメラーゼ 1 (PARP 1)、真核生物のクロマチン結合タンパク質触媒 NAD⁺に不可欠なプロセスから ADP リボース単位の転送を担当の活性化で改善する DNA 二本鎖切断の高レベルDNA 修復の¹⁶。しかし、酸化ストレスによる過度の損傷、PARP 1 活性化を引き起こす可能性が増加ドレインによるエネルギー飢餓 NAD⁺、酸化的リン酸化による ATP の生産に必要な基板上。最終的には、酸化ストレスがミトコンドリアのチトクローム c の放出につながるバックス/Bak 依存的にアポトーシスを引き起こすし、CGNs ¹⁷ミトコンドリア リモデリング誘導するために示されています。

最後に、塩化カリウム (KCl) CGN の文化での濃度の変化は、低カリウム/脱分極を介したアポトーシス^18,19,20をモデルに使用できます。K⁺の低レベルにさらされる, CGNs ではミトコンドリアの呼吸と解糖系、携帯電話需要の減少²¹に帰因する両方の削減としてのレベルの減少の結果異なる生理学的変化を受ける核因子 κ b (nf κ B) 炎症とシナプス伝達²²を含む活動を調整します。このモデルは、神経細胞の開発の間に細胞死の研究の特定の興味のです。低 K⁺環境はより密接に生理学的な条件のようなし、により、神経発生²³中に見られる細胞死の特徴。

要約すると、CGNs は神経細胞死と変性の分子メカニズムを調査するため長年モデルを提供します。次のプロトコルの分離、CGNs、式またはウイルスと神経細胞傷害と変性を表す異なるメカニズムを介して神経細胞死の誘導を使用して特定の遺伝経路の抑制培養できるようになります。

プロトコル

このプロトコルに基づいているプロシージャの変更は上記 ^{18 , 24 , 25 , 26, 27} しますこのプロトコルは、マギル大学で動物ケア委員会によって承認されています。

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1 実験準備

注: 次の貯蔵液を作成し、使用するまで維持されます。

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1. 郭清ソリューション
   1. ディゾルブ 3.62 g 塩化ナトリウム (NaCl)、塩化カリウム (KCl)、リン酸ナトリウムの 0.069 g 0.2 g の (NaH ₂ PO ₄ ∙ H ₂ O)、1.306 g d-(+)-グルコースの 500 mL の蒸留 H ₂ o.ソリューションに HEPES 緩衝液、フェノールレッド溶液 450 μ L と BSA 分数 V の 20 mL 12.5 mL を加えます。Ph 7.4 1 N 水酸化ナトリウム (NaOH) を使用して調整します
   。 0.22 μ m のフィルターと 4 ° C でストア
   2. 定置滅菌このソリューションは最大 1 週間 10 日に安定しています
   。
2. トリプシン
   1. 塩化ナトリウム 0.9% トリプシンの 25 g/L の濃度のストック溶液を調製します。-20 でソリューションを格納 ° C
3. トリプシン阻害剤
   1. -20 でこのソリューション鶏卵白トリプシン ・ インヒビター 1 mM 塩酸ストアの 100 mL に 1 g を溶解することにより 10 Mg/ml の濃度で在庫を準備 ° C
4. DNase
   1. 10 mL の滅菌水 10 mg/mL のストックを生成するのに DNase 1 の 100 mg を溶解します。-20 でソリューションを格納 ° C
5. MgSO ₄
   1. 50 mL の蒸留水 (H ₂ O) 1 M 在庫を生成するために硫酸マグネシウム (MgSO ₄) の 6.02 g を追加。4 でソリューションを格納 ° C
6. CaCl ₂
   1. 塩化カルシウムの 0.735 g を溶解 (CaCl ₂ ∙ 2 H ₂ O) 蒸留 H ₂ O 100 mm ストック濃度 50 mL に。保管ソリューション 4 ° C
7. KCl
   1. 50 mL に KCl の溶解 3.7275 g 蒸留 H ₂ O 4 で 1 M のストア ソリューションのストック濃度に ° C
8. D-(+)-グルコース
   1. 溶解 1.802 g d-(+)-50 mL にブドウ糖蒸留 H ₂ O 100 mm ストック濃度に。保管ソリューション 4 ° C
9. の細胞培養媒体
   1. 次のように細胞の培養基の準備: 熱の 5 mL は透析のウシ胎児血清を不活化、45 mL に 1.0 M の KCL の 200 mm 50 mg/mL ゲンタマイシンと 1 mL の 100 μ L L グルタミン 500 μ L を追加します。 フィルター滅菌イーグル ' s 最小限不可欠なメディア (E MEM) 1.125 g/L D により補完された-小脳顆粒ニューロン培地 50 mL を生成するグルコース。4 メディアを保管 ° C
10. シトシン ベータ D アラビノオリゴ Furanoside
    1. 20 mM のストック濃度成長媒体の 10 mL のシトシン ベータ D アラビノオリゴ furanoside の 48 mg を溶解します。-20 でソリューションを格納 ° C
11. ポリ-D-リジン
    1. 2 mg/mL ポリ D リジン株式を生成するポリ D リジン 20 mg を 10 mL の滅菌 H ₂ O を追加。100 μ L の因数で-80 ° C で保存するストック ポリ D リジン
    。
12. 注: 次のソリューションを解剖前に準備し、使用するまで 4 ° C で維持する必要があります
。
13. MgSO ₄ Supplemented 郭清ソリューション
    1. ストック MgSO ₄ 解離液 250 mL の追加 300 μ L.
14. トリプシン解離ソリューション
    1. ストック トリプシンとストック MgSO ₄ 郭清溶液 10 mL 12 μ L の追加 100 μ L.
15. トリプシン阻害剤ソリューション 1
    1. ストック トリプシンインヒビター、株式 DNase 1 の 250 μ L、ストック MgSO ₄ 郭清溶液 10 mL 12 μ L の追加 164 μ L.
16. トリプシン阻害剤ソリューション 2
    1. ストックのトリプシン ・ インヒビターの株式 DNase 1 750 μ L と 12 μ L 株式 MgSO4 解離溶液 10 mL を追加 1040 μ L.
17. CaCl ₂ 補足解離ソリューション
    1. ストック CaCl ₂ とストック MgSO ₄ 郭清溶液 10 mL の 25 μ L の追加 10 μ L
    。
18. ポリ D リジン コーティング培養皿
    1. 40 ml 滅菌 H ₂ o. ストック ポリ D リジン 100 μ L を希釈する培養皿をコート35 mm Nunc の培養皿の 2 mL 希釈ポリ D リジン ソリューションを追加します。4 はディープウェル プレートに希釈ポリ D リジン 300 μ L を各ウェル追加します
    。
    2. 、ポリ D リジン坐るように 1 時間吸引し、それぞれを洗浄する前に (35 mm 文化料理または 4 ディープウェル プレートにそれぞれ) の 4 mL または 600 μ L とよく滅菌 H ₂ o.H ₂ O を吸引し、1 h. 乾燥料理空気

2。脳の抽出と分離の小脳

首切りはさみを使用して

1. 首を切る 6 7 日古いマウス子犬。滅菌のティッシュ文化フードの脳の解剖を実行します
。
2. 脳を削除する鉗子のペアを使用して頭をつかみ、 図 1 に示すように顕微解剖はさみを使って頭の前方に向かって皮膚をカットします。その後、汚染のリスクを最小限に抑えるためのはさみの新しいペアを使用する頭蓋の骨をカットします。鉗子を使用して脳を覆う頭蓋骨を外し、鉗子やヘラを使用して脳をいじめる。
   1. 、必要に応じてカット全体として脳を得ることを容易にする視神経を通ってします
   。
3. MgSO ₄ で補われる解離ソリューションで脳を配置。ソリューションを保ち、氷の脳
4. 次脳の解剖顕微鏡の下で除去 MgSO ₄ 補足解離ソリューションでしながら脳から小脳を分析、微細鉗子を使用して髄膜を削除します。腹側に小脳を切り、脈絡叢の除去を保証するためです
。
5. MgSO ₄ 補足解離液の 〜 1 mL を含む 35 mm ディッシュ、小脳にプールします
。
6. 組織を細かく刻んでし、MgSO ₄ バッファー解離溶液 30 mL を含む 50 mL チューブに移す
。

3。マウス小脳顆粒ニューロン分離と養殖

1. g x 644 と 4 で 5 分間みじん切りの脳組織を含む 50 mL のチューブを遠心分離機 ° C
2. は、上澄みを除去し、トリプシン解離溶液の 10 mL を加えます。37 で 15 分間高速でチューブを振る ° C
3. 追加 10 mL
4. G × 644 と 4 で 5 分間チューブを遠心分離機 ° C
5. は、上澄みを除去し、2 mL を追加トリプシン阻害剤溶液 2 と 15 mL チューブに転送します
。
6. は 15 mL チューブに組織をカップ刻んだ解決策が不透明になるまで。その後、5 分のために解決しましょう
7. 明確な上澄みを除去し、CaCl ₂ 補足解離溶液 1 mL を含む新しいチューブに上清を転送します
。
8. は、手順 3.6 から餌を含んでいる管の底に別のトリプシン阻害剤溶液 2 mL を追加します。もう一度カップ刻んだ、我慢 5 分上澄みを除去し、管内ステップ 3.7 (つまり 3.6 3.7 の手順の繰り返し) から清に追加ができます。組織のほとんどに機械的に分離されるまでこの手順を繰り返します
。
9. 追加 CaCl ₂ 0.3 mL 郭清清すべて mL の培養上清中のコレクションにソリューションを補完します
。
10. 管の内容をミックスし 644 x g. で 5 分間遠心分離
11. 上澄みを除去、ペレットに新鮮なメディアの 10 mL を追加し、ミックスします
。
12. セルをカウントし、1.5 倍の 10 ⁶ セル/mL の濃度に希釈して可能性があります。一般的に 1000 万セル trypsinization 時間と郭清の効率に依存してそれぞれの解剖の脳から期待されて注意してください。以前作られたポリ D リジン プレート細胞をプレートします。4 ウェル プレート、プレート 0.5 mL は、ウェルあたり 10 の ⁵ セル × 7.5 を与えます。35 mm 料理プレート 4 mL、プレートごと 6 x 10 の ⁶ セルを与えるします
。
13. 後 24 h は、グリアの汚染を減らすためにプレートにシトシン-β-アラビノオリゴ furanoside (AraC) を追加します。メディアの各 mL 20 mm AraC 0.5 μ L 必要です。AraC 添加では、メディアの変更は必要ありません。セルを 7 〜 8 日を維持する場合は、3 日目にこの治療を繰り返します
。
14. 37 ° C で 5% CO ₂ インキュベーターで文化を維持し、2 mL の培地すべてのカルチャに 2 日おきに過去 5 日間追加 100 mM グルコースの 100 μ L でフィードします。完全なメディアの変更は必要ありません
。

4。レンチ ウイルスの包装、精製、滴定

注: 包装、濃度、浄化、レンチ ウイルスの滴定のためのプロトコルは、以前キットを使用せず詳細に記載されている ²⁸、滴定、流れ cytometry ²⁹ など別の方法を含みます。ここで迅速なウイルス浄化ソリューションと qPCR レンチ ウイルス滴定キットを使用して神経細胞傷害を研究にレンチ ウイルスの生産のため私たちの研究室で使用するプロトコルを簡潔に提示します

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1. ダルベッコと 10 cm 文化料理のプレート Hek293T 細胞 ' s 変更イーグル ' s 最小必須培地 (DMEM) 10% を添加した FBS。高ウイルス抗体価を得るため Hek293T 細胞ごとのトランスフェクションの少なくとも 5 プレートを成長します。当日トランスフェクション細胞の確認は、70% の合流です。トランスフェクション前 3 時間以内のメディアを変更します
。
2. 各 transfection のため 2 つの管を準備します。チューブ 1.5 mL MEM 減少血清メディアとトランスフェクション試薬の 41 μ L よく混合 1 を追加します。管 2、1.5 mL の MEM 低血清培と伝達プラスミドの 6 μ g、pCMV dR8.2 ベクトル (包装プラスミド) の 6 μ g、3 μ g pCMV VSV G ベクター (封筒プラスミッド) と p3000 エンハンサー試薬 (lipofectamine 付属) の 35 μ L を追加します。まあ、および結合チューブ 1 と 2、渦を混合し、15 分間インキュベート
3. は、Hek293T プレートからメディアの 50% を削除し、DNA リン脂質複合体をセルに追加します。37 ° C、5% CO ₂ で 6 時間孵化させなさい。メディアを削除し、5 ml の新鮮な DMEM の交換、一晩インキュベートします
。
4. で 24 h の後トランスフェクションは、各プレートからウイルス上清の最初のバッチを収集します。4 ° C でウイルスのメディアを維持し、Hek293T 細胞の各プレートに 5 mL の新鮮なメディアを追加します。一晩インキュベートします
。
5. 48 時間後のトランスフェクション ウイルス上清の 2 番目のバッチを収集、最初のバッチとそれを組み合わせるし、遠心分離機の 600 x g. で 10 分のウイルス上清複合
6. 上清を 45 μ m の細孔径を持つフィルターをフィルター処理します
。
7. は、迅速なウイルス浄化ソリューションを使用してウイルスを浄化します。ウイルス上清のすべての 45 mL、5 mL、レンチ ウイルス バインドのソリューション、ミックスで 10 分間遠心を追加 > g および 4 x 5,000 ° C
8. 慎重に上清を除去、ペレットを邪魔しないようにします
。
9. 中の 20-40 μ L を追加し、再ペレットを中断します。因数とで店-80 ° C
レンチ ウイルスの力価、qPCR レンチ ウイルス滴定キットを取得する
10. を使用します。500 μ L の PBS で純化ウイルスの 2 μ L を希釈します。(キットに付属) ウイルス換散バッファーの 18 μ L に希釈ウイルスの 2 μ L を追加します
。
11. セットを 3 つの異なる RT q PCR 反応トリプリケートし、として、ウイルス ライセート、肯定的な制御 1 (STD1)、および肯定的な制御 2 (STD2) ラベルします。各反作用のための追加、12.5 μ L 2 x qPCR マスター ミックス、どちらかの 2.5 μ L のウイルス ライセートや STD1 (キットに付属) または STD2 (キットに付属) と 0.2 mL PCR チューブで試薬ミックス (キットに付属) を 10 μ l 添加します
。
12. PCR プログラムを次のように設定: 逆のトランスクリプション、酵素活性化、15 の 40 のサイクル 95 ° C で 10 分間の 42 ° C で 20 分変性とアニーリング/延長 60 ° C で 1 分 95 ° c s.
13. は、この数式を使用してウイルスの力価を計算:
    ライセート ウイルスの力価 = 5 x 10 ⁷/2 ^{3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1)}.
    Ctx Ct1 未知試料の平均 Ct 値を = = STD1、Ct2 の平均値 = STD2 の平均値
    。 注: のレンチで導入されたまたは検討されている傷害のモードに応じてアデノ ウィルスに感染した CGNs は最高することができます。めっき時に細胞培養液に 2-3 の MOI でのレンチの追加を使用して、NMDA 誘発信号文化の 7 日目で勉強します。これは、結果、80% 以上の伝達とこれらのニューロン ( 図 2) の生化学的解析と追求する適切です。(MOI 50) で文化の NMDA 誘発 1 日 7-8 のシグナリングを勉強して 5 日目でアデノ ウィルスの追加イメージングなどの手法が使用されます。この治療法は、10% 未満で結果ニューロン、イメージングおよびタンパク質の共局在に最適の感染症。アデノ ウイルスは、2-3 日目または酸化ストレスで過酸化水素の添加によるカンプトテシン添加による DNA 損傷誘発細胞死を勉強するめっき時に使用できます。興味の遺伝子にタグ付きの蛍光蛋白質 (GFP、RFP、CFP、YFP) の存在は、パーセント伝達と潜在的な毒性を推定する使用できます。推奨の MOI では、最小限の毒性と最大伝達 ( 図 3) がわかります
。

5。神経細胞傷害をモデリング

NMDA を誘導する
1. による神経毒性は、7 日間 培養 後、1 h. 置き換えるすべての媒体無しで並列文化から馴化培地 100 NMDA μ M と 10 μ M グリシン CGNs 扱う治療。この濃度は 24 時間後の治療 ( 図 3) で 50% の細胞死の結果します。ミトコンドリアの断片化は 6 ~ 8 h 後の治療 (参照してくださいジャハニ Asl ら で明らか ^{26, 27}).
2. ROS による細胞死 (酸化ストレス) を誘発する神経の治療75-100 μ M 過酸化水素 (H ₂ O ₂) とに切り替えると ns はエアコン H ₂ O ₂ 5 分の露出に続く並列の文化からメディアです。注 H ₂ O ₂、不安定文化次の治療の 24 h で 50-70% 細胞死を誘導するレベルの濃度を最適化します
。
3. DNA を誘導する誘導細胞死をダメージに、10 μ M カンプトテシンと CGNs を扱います。この濃度を 24 時間ミトコンドリアの断片化で 50% の細胞死より誘導してこの濃度 (を参照してくださいジャハニ Asl ら カンプトテシンの付加の後で 2-3 h が発生する早期アポトーシス シグナル伝達 ¹⁸)
4. CGNs での低 K + 誘発神経アポトーシスを誘導して、25 mM K ^{+ +} 5 mm K 低カリウム メディアに次の 7 日間 培養 を含むメディアを変更します

。

結果

慎重な郭清を図 1 aBに見られるように最小限のダメージでそのまま脳を削除必要があります。削除時に脳に損傷を最小限に抑えるため、小脳への特に損傷する努力をすべきであります。小脳の損傷より困難な識別と、髄膜の完全除去と神経細胞培養の汚染の可能性が高くなります。髄膜を削除すると、小脳を図 1

ディスカッション

ここのプライマリ マウス小脳顆粒ニューロン (CGNs)、損失と利得の機能の研究、培養と細胞死のメカニズムのモデル化の簡単な方法を提供します。綿密なモニタリングを必要とするこの手順を使用して結果の再現性に影響を与えるいくつかの要因。文化、文化の合流点にグリア細胞の除去などを含むと健康な細胞を維持する文化の純度が含まれます。これらの要因の変動を導入することで、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
qPCR lentivitral titration kit	ABM	#LV900
speedy virus purification solution	ABM	#LV999
pCMV-dR8.2	Addgene	#8455
pCMV-VS.VG	Addgene	#8454
Distilled water	Gibco	#15230162
200 mM L-Glutamine	Gibco	#25030081
35 mm Nunc culture dishes	Gibco	#174913
PowerUP SYBR green master mix	life technologies	#A25742
BSA V Solution	Sigma Aldrich	#A-8412
CaCl2 • 2H2O	Sigma Aldrich	#C-7902
Camptothecin	Sigma Aldrich	#C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor	Sigma Aldrich	#10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside	Sigma Aldrich	#C-1768
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	#G-7528
DNase1	Sigma Aldrich	#11284932001
Eagle-minimal essential medium	Sigma Aldrich	#M-2279
Glycine	Sigma Aldrich	#G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	#F-0392
Hepes Buffer	Sigma Aldrich	#H-0887
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	#216763
50 mg/mL Gentamycin	Sigma Aldrich	#G-1397
MgSO4	Sigma Aldrich	#M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid	Sigma Aldrich	#M-3262
Phenol Red Solution	Sigma Aldrich	#P-0290
Trypsin	Sigma Aldrich	#T-4549
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
p3000 enhancer reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
KCl	VWR	#CABDH9258
NaCl	VWR	#CABDH9286
NaH2PO4H2O	VWR	#CABDH9298
Poly D-lysine	VWR	#89134-858
DMEM	Wisent	#319-005-CL
FBS	Wisent	#080-450