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要約

折りたたみと結合差動スキャン熱量測定による不耐熱配位子との相互作用は生体分子の迅速な評価のためのプロトコルを提案します。

要約

示差走査熱量測定 (DSC) は生体分子の折りたたみと結合の相互作用を支配する熱力学的パラメーターを定量化するための強力な手法です。この情報は、新しい医薬化合物のデザインに重要です。ただし、多くの医薬関連配位子 DSC 分析で使用される高温で化学的に安定はありません。したがって、熱量計セル内配位子と熱変換製品の濃度は常に変化のために結合相互作用を測定が困難します。ここでは、急速に折りたたみ、バインド、および配位子の熱力学的および速度論的情報に変換プロセスを得るため不耐熱配位子と DSC を使用してプロトコルを提案します。我々 は MN4 不耐熱リガンド コカインに結合する DNA アプタマーを私たちの手法を適用しました。不耐熱リガンド変換の新しいグローバル フィット分析を使用すると、折りたたみとバインディング パラメーターの完全なセットは、DSC 実験のペアから取得されます。さらに、1 つだけ補足 DSC データセットと不耐熱リガンド変換の速度定数がられる場合があるを示す.生体分子、折り畳み式の低速、低速のバインディング、および不耐熱リガンドの急速な枯渇の不可逆的な集計を含むを特定およびいくつかのより複雑なシナリオのデータを分析するためのガイドラインが掲載されています。

概要

示差走査熱量測定 (DSC)、生体分子結合のケイ光と折り畳み式の相互作用1,2,3の強力な方法です。DSC の強みには、バインドとフォールディング機構を明らかにし、対応する熱力学的パラメーター2,3を生成する能力が含まれます。また、DSC は近く生理条件下でのソリューションで実行することができます、生体分子や配位子、例えばフルオロ、スピン ラベルまたは核同位元素4とラベルを必要としません。楽器スキャン温度、配位子の有無で、生体分子を変性するに必要な熱の量を測定します。結果サーモグラムを使用してプロセスを折り配位子を支配する熱力学的パラメーターを抽出します。DSC や他の熱力学的手法によって提供される情報は、ターゲット生体分子1,5,6,7,8医薬品の設計を指導に不可欠です。ただし、高温に繰返しスキャン (〜 60-100 ° C) 問題が発生することができます。たとえば、多くの調剤上重要な化合物を受ける転位又は高温9,10,11,すなわちへの持続的な露出に分解、不耐熱。DSC による相互作用を通常結合の検討は、熱力学的解析12サーモグラムの再現性を確認するために複数の前方および逆のスキャンを必要とします。初期配位子の変更の結合特性を持つセカンダリ形式への変換熱が初期のリガンドの濃度低下しながら各スキャン形状と連続サーモグラムの位置で顕著な違いにつながる、熱変換製品を蓄積します。これらのデータセットは、伝統的な解析に適しておりません。

我々 は最近不耐熱リガンド DSC データセットの生体分子の折りたたみを支配する、バインドに参照される単一のリガンド結合実験からの相互作用の熱力学的パラメーターの完全なセットを生成するグローバル継ぎ手方式を開発した、無料生体分子4の必要なサーモグラムは。分析低減実験時間とサンプルに必要な 〜 10 倍標準的な DSC 手法に比べて。占めているサーモグラムはリガンドの濃度に依存しない各スキャンの高温部分の間に配位子のこれを仮定することにより熱の変換が行われます。したがって、配位子濃度は熱力学的パラメーターを抽出するために使用するサーモグラムの部分内にある定数です。私たちはさらに高温平衡期間が長く 1 つの補足実験を実行することによって配位子の熱変換の速度定数の取得方法を示した。配位子の温度差が少ない温度依存性システム (すなわち、すべての温度でかなり発生している)、分析は変数リガンド濃度を含めるように変更することができます。ここで我々 は急速に高温で benzoylecgonine に変換する不耐熱リガンド コカインの存在下で DNA アプタマー MN4 手順をデモンストレーション (> 60 の ° C)。これらの実験の温度で変換が行われない MN4 と連結されますので、キニーネはリガンド thermolability のネガティブ コントロールとして使用されます。不耐熱リガンド DSC データセットと降伏の折りたたみ、バインド、および配位子の熱力学的および速度論的パラメーター変換プロセス解析の買収について述べる。

プロトコル

1. サンプル準備

  1. 目的の生体分子13を浄化します。
    注: このプロトコルを購入使用してコカイン バインディング DNA アプタマー MN4 に対して 3 回遠心フィルターを用いた 3 kDa の分子量カットオフ膜純水 3 つのラウンドに続いて 2 の M の NaCl を交換した後。
  2. 合成や浄化、目的不耐熱リガンド13を購入します。
    注: MN4 不耐熱リガンド コカインにバインドします。MN4 はまた、これらの実験の温度でリガンド thermolability のネガティブ コントロールとして使用されるキニーネをバインドします。
  3. 精製された生体分子の透析と配位子 (20 mM リン酸ナトリウムと 140 mM NaCl のバッファー、MN4 とここで使用されるリガンドの pH 7.4) の溶解バッファーを準備します。
  4. 透析の管を使用してバッファーの少なくとも 2 L に対して生体分子を dialyze 0.5 - 1.0 kDa カットオフ。
  5. 徹底的にバッファーと平衡しては 0.2 μ m フィルターを通過、最後のバッファー (バッファーと呼ばれます) をフィルターします。
  6. リガンドの目的の固まりを量りし、フィルター バッファー中に溶解します。必要なリガンド濃度は正確に計量するのに小さすぎる大衆を必要とする場合は、集中配位子ストック ソリューション (たとえば 10 倍) です。
    注: すべての DSC 実験サンプルの同じ作業バッファーを利用し、リガンド、すなわちは決して実験を実行バッファーの原因になります生体より作業バッファーの異なるバッチ内に配位子が解散が重要です。データの不一致アーティファクト。
  7. 徹底的に作業バッファーと平衡に達したされている 0.2 μ m のフィルターを通して生体分子の原液をフィルターします。
  8. 吸光度測定による生体分子の濃度を決定する (260 nm MN4 と 280 のような核酸蛋白質の nm)。
  9. 4 ° C の冷蔵庫 (MN4 とここで使用されるリガンドに適した)、または-20 で準備された生体分子と配位子を格納または-80 ° C 生体分子と配位子凍結や長期保存に耐える場合は必要です。ドガは、DSC に読み込む前にテーブルの上でバッファー、生体分子、およびリガンド ソリューション製 (材料の表を参照してください)。
    注: は脱ガス気泡の高温 DSC を防ぐのに役立ちます。泡は、無名の DSC ピーク形状と基準信号アーチファクトを引き起こします。

2. DSC 準備

  1. DSC から圧力ハンドルを外し (材料の表を参照してください)。
  2. バッファーからシリコン チューブを実行し、参照毛細血管のフロントのフランジ (金属開口部) にアタッチします。
  3. リア参照フランジをフロント サンプル フランジに接続することで管を参照、サンプル間のブリッジを作成します。
  4. 真空線付き廃棄物フラスコに実行される後部サンプル フランジにシリコン チューブの部分を取り付けます。
  5. 200 ml のバッファーの DSC をフラッシュする真空ラインを入れます。
  6. バッファー付き DSC の参照毛細血管をロードします。参照キャピラリー フランジ約シリコン チューブの 3-5 cm のセクションに接続します。
  7. 後部フランジのシリコン チューブに 1 mL ピペット チップを挿入します。0.8 mL のピペットで作業バッファーを描画、バッファーでピペットの先端を前基準フランジのシリコン チューブに挿入します。
  8. 優しく、パス フロント シリコン チューブを介して作業バッファー参照毛細血管にまでピペット プランジャーを押すし、後部フランジには、ピペット チップを添付します。作業バッファー レベルに達するフロント シリコン チューブのすぐ上までピペット プランジャーを押しし、後部シリコン チューブのすぐ上の作業バッファー レベルに達するまでピペット プランジャーをリリースします。
    1. 泡の参照毛細血管内のボリュームを削除するのには、前後の作業バッファーを渡すことを繰り返します。
      注: 通常、前後のソリューションの 10 のパス、任意の気泡をクリアするのに十分です。
  9. 親指で背面のピペット チップをキャップし、リアのピペット チップと接続されているシリコン チューブで参照フランジからそれらを削除するフロントのピペットを軽く引いてください。
  10. 2.6 2.9 の手順のようにバッファーにサンプル毛細血管をロードします。後方参照の黒いプラスチックのキャップを置き、フランジ、明らかにフロントのフランジを残してのサンプルします。
  11. 圧力ハンドルをアタッチします。
  12. DSC ソフトウェアを開く (材料の表を参照してください) や電源読書が安定; したらインターフェイスの上部にある矢印を赤をクリックして楽器を加圧DSC 力が上部のボックスに示されている機器の温度および圧力を読むインターフェイスの右。
    注: モニター DSC として読書力を加圧します。力の変化以上 〜 10 μ を示すデータのアーティファクトを引き起こす可能性が毛細血管のバブル形成。ソリューションを削除し、脱気する必要があります続行する前にさらに。
  13. 前方および逆スキャンを実行することでバッファーと DSC を平衡します。画面の左側にある「実験方法」タブでは、スキャン モードの温度で DSC を実行する「スキャニング」オプションが選択されているを確認います。
    注: 実験的パラメーターは、温度範囲をスキャン、スキャン レート、低・高温平衡時間スキャン数です。
    1. 「実験方法」タブで"温度パラメーター"はめ込み、で"暖房"のボタンをクリックしてします。下限と上限の実験的温度、1 ° C/分スキャン率および 60 の 1 ~ 100 ° C を入力平衡期間 s。
    2. 入力フィールドの下の平衡期間」シリーズの追加」ボタンをクリックします。(1 度の加熱と冷却スキャン) のポップアップ ・ ウィンドウで「手順を追加」フィールドに 2 を入力し「代替加熱/冷却」ボックスをオン。"OK"をクリックします。追加のスキャンは、インタ フェースの下部に表示されます。各スキャンのパラメーターは、チェック目的です。
    3. インターフェイスの上部に緑色の「再生」ボタンをクリックしてテストを開始します。目的のフォルダーに移動し、ポップアップ ウィンドウで実験を保存するファイル名を入力します。実験進捗状況を表示するには、「実験法」タブ右側に「データ」タブをクリックしますします。

3. 不耐熱リガンド DSC データセットの収集

います最小限の手順で構成されて 5 つの実験: バッファー参照実験とリガンドなし (基線の減算に使用する、議論参照)、サンプル無料の生体分子、リガンド分子の実験と長い高温平衡期間とリガンド分子。

  1. 参照実験サンプル データの基線の減算を実行します。両方の毛細血管でバッファーと DSC を再読み込み、1 ° C 分-1が上限 (高温) で適切な温度範囲にわたって複数の前方および逆スキャンを収集 120 の平衡化時間 s。
    1. インターフェイスの下の部分から個別にそれぞれを強調表示し、インタ フェースの右中央に赤色の X をクリックすると以前のバッファーの平衡化スキャンを削除します。新しいスキャンを追加するには、「シリーズを追加」ボタンをクリックして、「追加手順」のフィールドに 20 を入力、"代替加熱/冷却"ボックスをチェックします。OK をクリックし、上記の緑の再生ボタンをクリックしてテストを実行します。
    2. リガンドの手順 3.1 - 目的の参照を取得する両方の毛細血管でリガンド濃度バッファーで 3.1.1 実験 (120 を使用して 2 つの独立した実験を収集 s と 600 s 高温平衡の回それぞれ、不耐熱リガンド変換の速度定数を取得で使用される)。
      注: ここで使用されるスキャン レートにより、その後の実験で生体分子が (説明参照) 前方および逆引きのスキャンで熱平衡状態にあります。スキャン レート < 0.1-0.2 ° C 分-1騒々しいサーモグラムにつながるし、DSC 実験には適用できません。温度を生体分子のリガンドで飽和の融点の上よく無料の生体分子の溶解温度以下の井戸から拡張する必要があります (~ MN4 20-80 ° C)。(例、10 進むと合計 20 の 10 逆スキャンで十分です) スキャンの再現性を確認します。
    3. 複数のリガンド (コカイン キニーネなど) を使用している場合は、毛細血管から配位子を外し、クロス汚染を防ぐために実行の間 (2.5 のステップから繰り返し) 作業バッファーの 200 mL の DSC をフラッシュします。
      注: 以前の配位子が毛細血管の壁を強く吸着し、バッファーのフラッシュは適切に削除されないかどうかをチェックするために無料の生体分子のリガンドを実行した後複製の実験を実行すると便利です。無料の生体分子のサーモグラム リガンド結合実験後に大きい大きさと高い変性温度に移行する場合、以前の配位子がフラッシュした後カロリメータにまだ存在するそうです。20% で毛細血管の孵化によって吸着リガンドを削除オフ圧力ハンドル、プラスチック製のキャップと 60 ° C で 1 時間の Contrad 70。DSC ソフトウェアで平衡化時間のため入ったゼロ「等温」期間と等温温度 60 ° C の実験方法タブを選択 3,600 秒の下でに実験モードを変更します。「実験方法に追加」をクリックします。等温実験は、画面の下部に表示されます。終了後、2 L の脱イオン水で楽器をフラッシュし、2.5 のステップからを繰り返します。
  2. 同じ参照をスキャン プロシージャおよび実験的パラメーターを読み込み DSC を使用してサンプル実験を実行します。無料の生体データ セットの参照毛細血管にバッファーが含まれているサンプル キャピラリーには作業バッファーに必要な濃度で無料の生体分子が含まれていることを確認します。
    1. リガンド結合実験、リガンドはバッファー参照毛細血管で、生体分子と配位子は、サンプル、キャピラリー中でバッファーを確認します。追加ステップ 2.5 のように異なる配位子の間のシステムをフラッシュします。
  3. 600 の高温平衡期間の増加、不耐熱リガンド行きの生体追加実験の 1 つを実行 s とすべての他の実験的パラメーターは、3.2.1 の手順と同じです。
    注: 第二配位子結合実験のため高温平衡期間中は単にリガンドの短い平衡時間実験よりより急速に劣化を確実に選択されます。最初からリガンド ピーク実験スキャン数の関数としてゆっくり崩壊場合 (例えば、連続ピーク マキシマの違いある ≤ 0.5 の ° C)、高温平衡期に 10 〜 20 倍向上の推定十分に配位子を消費し、第 2 の実験。配位子の変換のための速度定数の正確な計算は、2 番目の実験を最初に対する配位子のより速い枯渇する必要があります。同様、リガンドの枯渇が十分に 2 番目の実験ではアクセラ レートされていない場合使用できない 2 つの実験のグローバル分析から抽出されたリガンド濃度にあります。

4. データ処理

  1. 開いている DSC 実験 DSC データ解析ソフトウェアでファイル (材料の表を参照) と生の力データをスプレッドシートとしてエクスポートします。
  2. データフィッティングのためのソフトウェアに未加工力データを含むスプレッドシートをインポートします。
  3. ベースラインは、無料からのバッファー データと生体分子リガンド結合実験を減算してサンプル データを減算します。
    注: 不耐熱リガンド実験のため初期リガンドの濃度は各スキャンで減少しています。したがって、サンプル スキャン 1 からバッファー スキャン 1 を減算に最適です。リガンド変換が行わし、不耐熱リガンド データのすべてを減算する単一不耐熱リガンド バッファー スキャンを使用ことができますそのためにコカインとバッファー スキャンがかなり変化しないことがわかった。
  4. サンプルのベースライン減算力データを比熱容量に変換します。
    注: 変換には、推定14,,1516は、生体分子の部分比容が必要です。熱容量を電力に変換する数式がずっと17で説明しました。

5. データの解析

  1. 世界的に短い平衡時間不耐熱リガンド熱容量データセットに一連のベースライン、配位子濃度、折りたたみ、およびリガンド結合パラメーター4を前述のように合います。
  2. 不耐熱リガンド変換4を前述のように速度定数を計算するために長い平衡時間データセットのグローバル フィットを繰り返します。

結果

不耐熱リガンド DSC の代表的なデータは、図 1のとおりです。位置および不耐熱リガンド ピークの高さ連続シフト ダウン非連結の生体分子の方不耐熱リガンドが各スキャン (図 1 a) で使い果たされるとします。無料変性プロファイルは、不耐熱リガンド変換 (図 1 b) のエンドポイントの参照として使用...

ディスカッション

変更とトラブルシューティング

図 1 と図 2で使用されているグローバル フィット分析の詳細がされている4で説明しました。ここでは、実行して不耐熱配位子を DSC 結合実験の分析の実用的な側面をまとめました。不耐熱配位子だけでは配位子から差し引かれるために、DSC ベースラインが得られる?...

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

R. W. H. V は、マギル大学自然科学および工学研究審議会のカナダ (レベル) Bionanomachines トレーニング プログラムによって支えられました。A. K. M. と p. e. j. は、レベル補助金 327028-09 (A. K. M) と 238562 (p. e. j.) によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium chlorideChem Impex#00829
Sodium phosphate monobasic dihydrateSigma Aldrich71502
Sodium phosphate dibasicSigma AldrichS9763
Deioinized water for molecular biologyMilliporeH20MB1001
0.2 micron sterile syringe filtersVWRCA28145-477
3 kDa centrifugal filtersMilliporeUFC900324
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoffSpectrum Laboratories131048
Silicon tubingVWR89068-474
Plastic DSC flange capsTA Instruments6111
DNA aptamer MN4Integrated DNA Technologieshttps://www.idtdna.com/site/order/menu
CocaineSigma AldrichC008
QuinineSigma Aldrich22620
NanoDSC-III microcalorimeterTA Instrumentshttp://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun softwareTA Instrumentshttp://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze softwareTA Instrumentshttp://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70VWR89233-152

参考文献

  1. Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
  2. Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
  3. Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
  4. Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
  5. Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
  6. Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
  7. Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
  8. Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
  9. Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
  10. Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
  11. Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
  12. Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
  13. Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
  14. Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
  15. Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).
  16. Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
  17. Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
  18. Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
  19. Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
  20. Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).

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