Измерения биомолекулярных DSC профили с термолабильных лигандами быстро характеризовать складывания и привязки взаимодействия

Резюме

Мы представляем собой протокол для быстрого характеристика биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия с термолабильных лигандов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии.

Аннотация

Дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) – это мощный метод для количественной оценки термодинамических параметров, регулирующих биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия. Эта информация имеет решающее значение в разработке новых фармацевтических соединений. Однако многие фармацевтически соответствующих лигандов являются химически неустойчивыми при высоких температурах, используемых в ДСК анализов. Таким образом измерения привязки взаимодействия сложным, потому что концентраций лигандов и термически преобразованы продукции постоянно меняются в ячейке калориметра. Здесь мы представляем протокол, с помощью термолабильных лигандов и ДСК для быстрого получения термодинамические и кинетические информации о складывания, привязки и лигандом процессов преобразования. Мы применили метод к ДНК aptamer MN4, которая связывает термолабильных лигандом кокаина. С помощью новой глобальной установки анализа, который приходится термолабильных лигандом преобразования, полный набор складывания и привязки параметров получаются из пару DSC экспериментов. Кроме того мы показываем, что константа скорости термолабильных лигандом преобразования могут быть получены с только один дополнительный набор DSC. Представлены руководящие принципы выявления и анализа данных из нескольких более сложных сценариев, включая необратимой агрегации биомолекулы, медленно складывающиеся, медленно привязки, и быстрое истощение запасов термолабильных лиганда.

Введение

Дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)-это мощный метод для quantitating биомолекулярных привязки и складной взаимодействия^1,2,3. Сильные ДСК включают способность для уточнения привязки и складные механизмы и давать соответствующие термодинамических параметров^2,3. Кроме того DSC может быть выполнена в растворе рядом физиологических условиях и не требует маркировки биомолекулы или лиганд, например, с флуорофоров, спин этикетки или ядерные изотопы⁴. Инструмент сканирует температуры, измерять количество тепла, необходимое чтобы денатурировать биомолекулы в присутствии и отсутствии лиганда. Результате термограммы используются для извлечения термодинамических параметров, управляющих лигандом привязки и складывающиеся процессов. Информацию, представленную ДСК или других термодинамических методов имеет решающее значение для руководства дизайн наркотиков ориентации биомолекул^1,5,6,,78. Однако повторное сканирование для высоких температур (~ 60-100 ° C) может быть проблематичным. Например многие фармацевтически важных соединений проходят перегруппировки или разложение после устойчивого воздействия высокой температуры^9,10,11, т.е., они термолабильных. Экспертиза привязки взаимодействия, DSC, обычно требует несколько вперед и обратного сканирования для проверки воспроизводимости термограммы термодинамический анализ¹². Термический первоначального лигандом для вторичной формой с характеристиками измененной привязки приводит к заметными различиями в форму и положение последовательных термограммы, так как концентрация первоначального лигандом уменьшается с каждой проверки во время Термический продуктов накапливаются. Эти наборы данных не поддаются традиционным анализом.

Мы недавно разработали метод глобальные установки для термолабильных лигандом DSC наборов данных, что дает полный набор термодинамических параметров регулирующих биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия от одного лиганд прыгните эксперимент, связанный с требуемой термограммы для свободного биомолекулы⁴. Анализ уменьшает время экспериментальных и образец требует ~ 10 раз по сравнению с стандартным DSC подходов. Мы составили для лигандом термический, предполагая, что это происходит во время высокой температуры часть каждого сканирования, где термограммы не зависит от концентрации лиганда. Таким образом концентрация лиганд — константа, в части термограммы, который используется для извлечения термодинамических параметров. Дополнительно мы продемонстрировали, как константа скорости лигандом термический можно получить, выполнив один дополнительный эксперимент с более длительный период уравновешивания высокой температуры. Для систем, где лигандом термический менее зависит от температуры (т.е., в значительной степени происходит при всех температурах), анализ может быть изменен для включения переменной лигандом концентрации. Здесь мы показываем эту процедуру для ДНК aptamer MN4 присутствии термолабильных лигандом кокаина, который быстро преобразует бензилэкгоин при высоких температурах (> 60 ° C). Хинин используется как отрицательный контроль для лигандом thermolability, поскольку она не претерпела преобразования при этих температурах экспериментально и также связывает MN4. Мы описываем приобретение термолабильных лигандом DSC наборов данных и их анализа, уступая термодинамические и кинетические параметры складывания, привязки и лигандом процессов преобразования.

протокол

1. Пробоподготовка

1. Очищайте желаемого биомолекулы¹³.
   Примечание: Этот протокол использует приобретенные кокаина связывания ДНК aptamer MN4 после обмена против 2 М NaCl, три раза после трех раундов деионизованной воды с помощью центробежного фильтра с мембраной отсечения молекулярный вес 3 кДа.
2. Синтезировать и очистить или приобрести желаемый термолабильных лигандом¹³.
   Примечание: MN4 связывает термолабильных лигандом кокаина. MN4 также связывает хинин, который используется в качестве отрицательного контроля для thermolability лиганда при этих температурах экспериментально.
3. Подготовьте буферов для диализа очищенный биомолекулы и растворения лигандов (20 мм фосфат натрия и 140 мм NaCl буфера, рН 7,4, MN4 и лигандами использовали здесь).
4. Dialyze биомолекулы против по крайней мере 2 Л буфера с помощью диализа трубы с 0,5 - 1,0 кДа отсечения.
5. Через фильтр 0.2 мкм, который тщательно сбалансирован с буфером фильтр окончательный буфера (именуемый рабочего буфера).
6. Весят из желаемых массы лигандами и растворить их в фильтрованной рабочей буфера. Если желаемый лигандом концентрации требуют масс, которые слишком малы для точного взвешивания, сделайте Стоковый раствор концентрированный лиганда (10 x для примера).
   Примечание: Важно, что все эксперименты DSC использовать тот же буфер Рабочая для образца и лигандом, т.е., никогда не выполняют эксперимент, где лигандом растворяется в другой пакет рабочего буфера, чем биомолекулы, как это вызовет буфера артефакты несоответствия в данных.
7. Биомолекулы Стоковый раствор процеживают через 0,2 мкм фильтр, который тщательно сбалансирован с рабочего буфера.
8. Определить концентрацию биомолекулы путем измерений оптической плотности (260 Нм для нуклеиновые кислоты как MN4 и 280 Нм для белков).
9. Требуется-80 ° C, если биомолекулы и лигандами терпеть замораживания и длительного хранения или хранения подготовленных биомолекулы и лиганд в холодильнике 4 ° C (подходит для MN4 и лигандами использовали здесь), или на -20. Дега, буфер, биомолекулы и лигандом решения в верхней таблице degasser (см. Таблицу материалы) до загрузки в DSC.
   Примечание: Дегазация помогает предотвратить образование пузыря в ДСК при более высоких температурах. Пузырьки вызывают сигнал артефактов, которые скрывать ДСК пик формы и базовых показателей.

2. DSC подготовка

1. Отвинтить рукоятку давления от DSC (см. Таблицу материалы).
2. Запуск силиконовой трубки из буфера рабочей и прикрепить его к переднего фланца (металлические открытие) ссылка капилляра.
3. Создание моста между ссылку и образец капилляров, подключив к передней образца фланец фланец задний ссылки.
4. Прикрепите кусок кремния трубы фланец задний образца, который бежит к отходов колбу с вакуумной линией.
5. Включите линии вакуумные для очистки DSC 200 мл рабочего буфера.
6. Загрузите ссылку капиллярные DSC с буфера рабочей. Придают примерно 3-5 см секций труб кремния ссылка капиллярного фланцы.
7. Вставьте наконечник пипетки 1 мл в задний фланец силиконовой трубки. Нарисуйте 0,8 мл рабочего буфера с пипетки и вставьте наконечник пипетки с буфером в передней ссылки фланец силиконовой трубки.
8. Аккуратно нажмите пипеткой поршень вниз переходят буфера рабочей через трубку передней кремния в капиллярной ссылку и вверх в задний фланец придает наконечник пипетки. Нажмите вниз пипеткой поршень пока не достигает уровня буфера рабочей чуть выше передних силиконовой трубки, а затем отпустите пипетки поршень пока не достигает уровня буфера рабочей чуть выше задней силиконовой трубки.
   1. Повторите, передача буфера рабочей взад и вперед, чтобы очистить тома в ссылку капилляра пузырей.
      Примечание: Как правило, 10 проходит решения и обратно достаточно, чтобы очистить все пузырьки.
9. Cap кончик задние пипетку с пальца и осторожно потяните на задней пипеткой подсказки и передней пипетку, чтобы удалить их из ссылок фланцы с силиконовой трубки прилагается.
10. Загрузите образец капилляра с рабочего буфера как шаги 2,6-2,9. Поместите пластмассовый черный колпачок на задней ссылке и образцы фланцы, оставляя передние фланцы обнаружили.
11. Приложите давление ручку.
12. Откройте программное обеспечение DSC (см. Таблицу материалы) и оказать давление на инструмент, нажав красный вверх стрелку в верхней части интерфейса после стабилизации мощности чтения; DSC мощность указывается в поле в верхней правой части интерфейса вместе с инструментом температуры и давления.
    Примечание: Монитор власть, чтение как DSC герметиков. Изменения в мощности более чем ~ 10 мкВт указывают формирования пузыря в капиллярах, которые могут вызывать помехи в данных. Решения должны быть удалены и дегазации далее прежде чем продолжить.
13. Сбалансировать DSC с рабочего буфера, выполняя прямого и обратного сканирования. На вкладке «Экспериментальный метод» на левой стороне экрана убедитесь, что выбран параметр «Сканирования» для запуска DSC в режиме сканирования температуры.
    Примечание: Экспериментальные параметры являются температура, сканирование диапазона, скорость сканирования, время уравновешивания низких и высоких температур и количество сканов.
    1. В врезные «Температуры параметры» на вкладке «Экспериментальный метод» нажмите на кнопку для «Отопление». Введите 1 и 100 ° C для нижнего и верхнего экспериментальной температур, 1 ° C/мин скорость сканирования, и 60 s на период уравновешивания.
    2. Нажмите кнопку «Добавить серии» под полем ввода для уравновешивания период. Введите 2 в поле «Шаги для добавления» во всплывающем окне (один отопления и охлаждения одно сканирование) и установите флажок «альтернативное Отопление/охлаждение». Нажмите кнопку «ОК»; Добавлено сканирование появляются в нижней части интерфейса. Убедитесь, что параметры для каждого сканирования как желаемого.
    3. Запустите эксперимент, нажав на зеленую кнопку «играть» в верхней части интерфейса. Перейдите к нужной папке и введите имя файла для сохранения эксперимент во всплывающем окне. Просмотреть ход эксперимента, нажав на вкладке «Данные» справа от вкладки «Эксперимент метод».

3. сбор термолабильных лигандом DSC наборов данных

Примечание: Минимальная процедура состоит из пяти экспериментов: буфера ссылка эксперименты с и без лиганда (используется для вычитание, см. обсуждение), образец эксперименты с бесплатным биомолекулы, лиганд прыгните биомолекулы и биомолекулы лиганд граница с более длительный период уравновешивания высокой температуры.

1. Запуск ссылку эксперименты для вычитание образца данных. Перезагрузить DSC с рабочего буфера в обоих капилляров и собирать несколько вперед и обратного сканирования в диапазоне подходящей температуры на 1 ° C мин^-1 с верхней (высокая температура) время уравновешивания 120 s.
   1. Удаление предыдущих проверок уравновешивания буфера из нижней части интерфейса, выделив каждый индивидуально и нажав красный крестик справа в середине интерфейса. Добавьте новое сканирование, нажав на кнопку «Добавить серии», введя 20 в поле «Шаги, чтобы добавить» и установив флажок «альтернативное Отопление/охлаждение». Нажмите кнопку ОК и запустите эксперимент, нажав на зеленую кнопку как указано выше.
   2. Повторите шаги 3.1 - 3.1.1 с рабочей буфер, содержащий нужную концентрацию лиганд в обоих капилляров для получения ссылки на эксперименты для лигандом (собирать два отдельных экспериментов с использованием 120 s и 600 s высокой температуры уравновешивания раз соответственно, чтобы использоваться в приобретении константа скорости преобразования термолабильных лигандом).
      Примечание: Скорость сканирования, используемых здесь гарантирует, что биомолекулы в последующих экспериментах в термально уравновешение в прямого и обратного сканирования (см. обсуждение). Проверка ставок < 0.1-0.2 ° C мин^-1 привести к шумной термограммы и не применимы в экспериментах DSC. Температура должна распространяться от значительно ниже температуры плавления бесплатно биомолекулы хорошо выше температуры плавления лиганд насыщенный биомолекулы (~ 20-80 ° C для MN4). Проверьте воспроизводимость результатов сканирования (например, 10 вперед и 10 обратного сканирования для 20 всего достаточно).
   3. При использовании нескольких лигандов (таких, как кокаин и хинин), промойте DSC 200 мл рабочего буфера (повтор с шагом 2.5) между запусками, чтобы удалить лигандом из капилляров и предотвращения перекрестного загрязнения.
      Примечание: Это полезно для выполнения репликации эксперимент на бесплатный биомолекулы после запуска лиганд прыгните для того, чтобы проверить, если предыдущий лигандом сильно адсорбируется почвой стенки капилляров и не удаляется надлежащим образом с промывкой буфера. Если термограммы для свободного биомолекулы, как представляется, быть перенесен в более крупные масштабы и выше температура денатурации после того, как лиганд прыгните эксперимент, вполне вероятно, что предыдущий лигандом все еще присутствует в калориметре после промывки. Удалите адсорбированных лигандов, инкубации капилляров с 20% Contrad-70 за 1 ч, при 60 ° C с пластиковых колпачков и давления ручку выключения. В программном обеспечении DSC измените экспериментальный режим на «Изотермические» под экспериментального метода tab. s 3600 выбрать продолжительность и 60 ° C для изотермические температуры, с нуля, для уравновешивания время вступил. Нажмите кнопку «Добавить в экспериментальный метод». Изотермическая эксперимент появляется в нижней части экрана. После завершения промойте прибор с 2 Л деионизированной водой и повторите шаг 2,5.
2. Запустите образец эксперименты с использованием тех же DSC загрузки процедуры и экспериментальные параметры как ссылку сканирование. Для набора данных бесплатно биомолекулы убедитесь, что капилляр ссылка содержит буфера рабочей, а образца капиллярной бесплатно биомолекулы на желаемой концентрации рабочего буфера.
   1. Для экспериментов лиганд граница убедитесь, что лиганд в буфере рабочих в капиллярной ссылка, и биомолекулы плюс лиганд в буфере рабочих в образца капиллярной. Потолочные системы между дополнения различных лигандов как шаг 2,5.
3. Выполните один дополнительный эксперимент с биомолекулы привязан к термолабильных лиганд, где период уравновешивания высокой температуры увеличивается до 600 s и все другие экспериментальные параметры такие же, как шаг 3.2.1.
   Примечание: Продолжительность периода уравновешивания высокой температуры для эксперимента вторым лиганд прыгните просто решили обеспечить более быстро истощены, чем короткие уравновешивания время эксперимент лиганд. Если лиганд прыгните пики от первого эксперимента распад медленно, как функция проверки числа (например, различия в последовательных пик Максима являются ≤ 0,5 ° C), 10 - 20 раз увеличивается в период уравновешивания высокой температуры, для того чтобы оценить адекватно разрушающим лиганд в ходе второго эксперимента. Точный расчет константа скорости преобразования лигандом требует, что второй эксперимент имеет быстрого истощения лигандом относительно первого. Лиганд концентрации, извлеченные из глобального анализа двух экспериментов будет аналогичные и поэтому непригодны для использования, если истощение лигандом достаточно не ускоряется во втором эксперименте.

4. обработка данных

1. Открытый DSC эксперимент файлы в программное обеспечение для анализа данных ДСК (см. Таблицу материалы) и экспортировать данные грубой силы в виде таблицы.
2. Импорт таблиц, содержащих данные грубой силы в программное обеспечение для установки данных.
3. Базовые вычесть образец данных путем вычитания буфера данных мощности от свободных и лиганд прыгните биомолекулы экспериментов.
   Примечание: Для термолабильных лигандом эксперимента, концентрация первоначальных лигандом уменьшается с каждой проверки. Таким образом он идеально подходит для вычитания сканирования буфер 1 из образца проверки 1 и так далее. Мы нашли, что буфер сканирования с кокаином не меняются значительно лигандом преобразования продолжается и поэтому сканирования буфер одного термолабильных лиганд может использоваться для вычесть все термолабильных лигандом привязанных данных.
4. Преобразуйте данные мощности вычитается базовый образец теплоемкости.
   Примечание: Преобразование требует частичной удельный объем биомолекулы, который может быть примерно^14,,1516. Уравнение для преобразования энергии в теплоёмкость был ранее описанные¹⁷.

5. анализ данных

1. Глобально подходят короткие уравновешивания время термолабильных лиганд прыгните теплоемкости набора данных с одним набором базовых, лигандом концентрации, складные и лигандом привязки параметров, как описано ранее⁴.
2. Повторяйте, что глобальной подходят для набора данных время длинный уравновешивания для того чтобы вычислить константа скорости преобразования термолабильных лиганд, как описано ранее⁴.

Результаты

Репрезентативных данных для термолабильных лигандом DSC показаны на рисунке 1. Положение и высоту термолабильных пик лиганд прыгните последовательно сдвигает вниз к что несвязанных биомолекулы как обедненный термолабильных лиганда с каждого сканиров...

Обсуждение

Модификации и устранение неполадок

Данные анализа глобальной установки, используемых в Рисунок 1 и 2 были описаны ранее⁴. Здесь мы приводим практические аспекты выполнения и анализа ДСК привязки эксперименты с термол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Chem Impex	#00829
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sigma Aldrich	71502
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9763
Deioinized water for molecular biology	Millipore	H20MB1001
0.2 micron sterile syringe filters	VWR	CA28145-477
3 kDa centrifugal filters	Millipore	UFC900324
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff	Spectrum Laboratories	131048
Silicon tubing	VWR	89068-474
Plastic DSC flange caps	TA Instruments	6111
DNA aptamer MN4	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/site/order/menu
Cocaine	Sigma Aldrich	C008
Quinine	Sigma Aldrich	22620
NanoDSC-III microcalorimeter	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun software	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze software	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70	VWR	89233-152