マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

要約

ここでは、全体のマウント蛍光マウス初期胚のイメージに基づく定量的容積測定分析のためのプロトコルについて述べる.定性的と定量的開発時に心臓の構造を評価し、他の器官に広く適応可能があることを提案する強力な方法としてこのテクニックを紹介します。

要約

日進月歩のイメージング技術の使用は、萌芽期の開発の高められた理解に広く貢献しています。着床前開発と器官形成は、着床前胚を画像から直接または生体内臓器 ex に取得することができますデータの高品質のため、これらの進歩から大いに恩恵を受けている研究の 2 つの領域です。着床前胚には、特に高空間分解能データが得られている、後期三次元再構成より影響を受けやすいされている.運命マッピングまたはトレースする遺伝的血統との組み合わせで知られている萌芽期の構造の高品質 3 D または体積データを取得に胚発生中に場所を取って形成イベントのより包括的な分析になります。

このプロトコルでは、キーの構造体は、心の発育中に形成のラベリング、視覚化、および開発心臓三日月内前駆細胞集団の定量化できるホール マウント免疫組織アプローチについて説明します。アプローチの設計のような細胞レベルおよび組織レベルの情報の両方を得ることができる方法。このプロトコルにより、ローカリゼーションとの間に特定の前駆細胞集団の組織を分析する機能を実現、心臓三日月の三次元空間再構成用共焦点顕微鏡と画像処理を使用して、この重要な心の開発の段階。重要なは、心臓の三日月の連続的マスキングと三日月内領域の後続の定量的測定では、参照抗体の使用もできます。このプロトコルのみ初期心開発の詳細な検査を行うことはできませんが、適応を持つ原腸胚初期の体節期マウス胚にほとんどの器官システムに適用する必要があります。

概要

器官形成の研究は、発育中の胚の形態形成イベントの観測に頼っている長い。これらの研究は、よく定義された参照集団の付け蛍光染料やリネージュ トレース記者の組み合わせでの使用に依存します。¹これらのラベルの相対的な位置を比較すると、情報は起源、動き、または興味の人口の究極の貢献に収集することができます。移植と運命マッピング実験開発の胚への貢献が検査されます、興味のセルの開始点を定義するのに形態学的ランドマークまたは非運動性系統に染料の注入のいずれかを使用します。^2,3,4,5遺伝の系譜トレース実験は、実験操作せずラベル細胞集団に使用する明確に定義されたレポーター遺伝子と同じ概念を使用します。これらのアプローチの鍵は、高空間分解能、実験の場所の参照ラベルと判断することです。これらのアプローチは、着床前の開発の顕著な進展が得られているし、器官形成研究を外植体します。^6,7,8,9

心臓形態の根底にある発達のイベントは近年ますますよく説明されています。¹⁰研究のこの分野での主要な発見の 1 つは、ユニークなマーカーの発現によって区別することができます前駆細胞集団の数の説明です。¹¹これらの集団を含める最初と心の 2 番目のフィールド (急性肝不全と SHF) 日 (E) 8.25 マウス開発の胚の前方側に心臓三日月内で存在しています。¹²これらの人口は頻繁に検査広視野顕微鏡、蛍光アッセイを組織レベルの情報、およびシリアル断面を提供、高い携帯電話の解像度だけを提供するの組み合わせによって二次元空間情報。¹³したがって、これらの研究が大きく進歩した心臓の開発の私達の理解、利用可能なメソッドが限られている形態の深さ定量分析における調べるアプローチの必要性を作成するこれらの段階の間に、全体生物レベルでこれらの集団の組織。

最近、比較的簡単に細胞や構造の場で高解像度と高速アルゴリズム復元を可能にする共焦点顕微鏡と 3 D 画像解析の進歩従って複合体の詳細な研究の道を舗装細胞の構造。¹⁴計算力の増加と大きなデータ管理アルゴリズム、イメージング、データ セットのサイズの指数関数的増加に対処する開発分析今完全に自動化できます。¹⁵イメージング データ セットの自動解析は、公平であることの利点、それは入力データセットの品質と信頼性その後、ベスト ・ プラクティスを使用取得と画像の前処理中に最高の品質、公平な分析を確保することが不可欠です。¹⁶プロトコルは完全に自動化された、再現性の共有をすることができ、独自のソフトウェアによって使用されるアルゴリズムは、容易に独自の現代の知識を持った科学者が使用するライブラリで利用可能なまたはオープン ソース開発者向けツール。¹⁷

次のプロトコルでは、器官形成、心臓の開発中に心臓の三日月形の形成の 1 つのよく定義されたモデルのような分析を実行に必要な手順について説明します。具体的には、このプロトコルは、(1) 収穫する方法をについて説明しますと心臓の三日月形段階の胚を解剖、(2) 参照 (Nkx2 5) の全台紙の蛍光を実行と実験 (Foxa2Cre:YFP^18,19) マーカー、(3)準備し、共焦点顕微鏡を用いた胚をイメージ、最後に (4) を分析し、高度な 3次元アプローチを使用して結果の画像を定量化します。心臓の三日月は適切な変更でここでは、例として使用される体節の段階の初期胚に原腸胚における複数系統の分析のためこのプロトコルを使用することがあります。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアとシナイ山で、Icahn 医学の利用委員会によって承認されている

。

1 収穫と処理心臓三日月胚

1. スタッド肥沃な男性と肥沃な雌マウスのチームメイト。
。 鈍的プローブまたは鉗子を使用して膣に交尾の有無をチェック
2. プラグ。プラグイン検出の日の正午の萌芽期と見なされます (E) (参照してください 図 1 a の完全なタイムライン) 0.5 日
   。 注: プラグを確認するか朝は、彼らが 1 日を通して失われると
。
3. 8 ^番目 の日 (E8.25) の朝、CO ₂ 吸入、または地方および制度上の規制によると妊娠中のダムを犠牲します
   。 注: 正確なタイミングのひずみ依存をすることができますおよび形態によって、経験的に決定する必要があります
。
4. は、地域をきれいにし、放出を最小限にする 70% のエタノールとマウスの腹部をスプレーします。腹部切開の皮膚と体壁の両方を実行することによって内臓を公開します
。
5. 子宮を見つけるし、動物から全体の子宮角を慎重に取り外します。子宮頸の終わりに進む中から脂肪をトリミング 1 卵管上切断して起動します。子宮頸部を切って、卵管子宮全体を解放する切断の上部端まで続行します
。 リン酸
6. 10 cm で子宮の場所皿はバッファリング生理食塩水 (PBS、pH 7.4) 過剰な血を洗い流すためです。サブ胚が含まれているそれぞれの deciduum と mesometrium を切断することによって子宮を解剖します。新鮮な PBS の 6 cm 皿に胚を転送します
。
7. 解剖顕微鏡の下で脱落膜組織から子宮の組織を除去する微細鉗子 (#5) を使用します
。
8. 使用鉗子は、胚を明らかにする deciduum の胚の半分の先端を慎重にスライスします。胎児を押し出すと慎重に胎児を引き出す deciduum をピンチします
。
9. ( 図 1 b) 胚の形態を損なうことがなく可能な限り離れて初期胚胚体外組織を解剖します
。
10. は、新鮮な PBS の 1.5 mL のチューブに胚を置くし、氷の場所に転送ピペットを使用します。続行する前に、残りの胚に 1.7 〜 1.9 を繰り返します
。
11. 吸引 PBS PBS で 1 回洗浄.PBS を吸い出しなさい
    。 注: は、損傷や胚を乾燥せずにできるだけ多くの PBS を削除しようとします。胚の損失を避けるためにすべての手順でソリューションを手動で削除を推奨します
。 室温 1 時間 PBS の
12. 修正胚 4% パラホルムアルデヒド (PFA)
    注: 胚を固定することができます 4 宿泊 (O/N) ° C
13. PBS で 3 回すすぎ。蛍光抗体法を続行する準備ができるまで、4 ° C で胚を維持します
    。 注: 一時停止ポイント。胚安全に格納できる PBS 4 ° C で数週間
。

2。蛍光抗体染色

注: 以下の培養条件は異なるスケジュールに合わせて調整できます。穏やかな揺れや長い潜伏のすべてのステップのロッキングを使用をお勧めします

。

1. PBS を削除し、1 mL のブロック バッファー (1% ウシ血清アルブミン (BSA) PBS の 0.5% サポニン) を追加します
。
2. インキュベート、少なくとも 4 時間室温これは、こともできます O/N 4 ° C
3. は、ブロック バッファーを削除し、ブロック バッファーで希釈した一次抗体の混合物を追加します。O/N 4 ° c. で孵化させなさい
   注: は、材料使用し、希釈を提案した抗体の説明のセクションを参照してください。抗体希釈液は経験的に決定する必要があります。心臓の三日月の参照汚れとして Nkx2 5 の使用お勧めおよび下流にキー画像セグメンテーションと分析手順は、
。
4. 吸引により一次抗体を削除します
。
5. 0.1% で、1 h を 3 回洗浄 PBS でトリトン
。
6. は、洗浄を削除し、ブロック バッファーで希釈した二次抗体の混合物を追加します。室温 3 時間インキュベートします。これは、こともできます O/N 4 ° C
7. 洗浄 3 回 0.1% で、1 h の PBS のトリトン。これは、こともできます O/N 4 ° C
8. 対比染色 4 '、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) PBS で 10 分の
   注: この対比染色を同時実行できる二次抗体と
。
9. 0.1% で各 5 分の 2 回洗う PBS でトリトン
。
10. はゆっくりと耐フェード マウント メディア (2 w/v n-プロピルガ レート (nPG)、90% のグリセロール、1x PBS; で胚を中断します。詳細についてを参照してください材料セクション)。マウントする前に、少なくとも 1 h を平衡することができます。胚耐フェード ソリューションにドロップのため定期的にチューブを軽くフリックします
    。 注: 一時停止ポイント。マウントし、イメージの準備ができるまで胚耐フェード ソリューションで数日間格納できます
。

3。顕微鏡検査のための胚をマウント

1. 準備顕微鏡スライド両面テープまたはシリコーン スペーサーを使用して取り付け。両面テープを使用するなら 5-6 層約 15-20 mm の 2 つの並列スタック離れて。胚を入れ、coverslip ( 図 1) を固定するのに十分なスペースを残してこれ
。
2. は、両面テープの間に、スライドに耐フェードの 15 μ L のドロップを配置します。慎重にスライドを 1 つの胚を転送します
   。 注: 2 つ以上の胚は、スライドに配置できます。しかし、その後オリエンテーション手順は複数の胚を難しく、写真漂白につながる可能性があります長い期間をイメージングします
。
3. 微細鉗子を用いた解剖顕微鏡の下で胚の位置前方面がスライドの長軸に沿って体軸方向のスライドからなるような。取り付けセットアップの模式図、 図 1 を参照してください
。
4. 慎重に両面テープの 1 つのスタックの 1 つの側面を休憩して鉗子を使用して他のテープに接触するまで、coverslip をそっと下げるサンプル上観察を配置します
   。 注: 手順 3.3 と 3.4 イメージングのための胚の向きが正しいことを確認する重要です。前方方向の後部に沿って coverslip を下げることによって胚をロールバックできませんする必要があります、心臓の三日月地域は倒立顕微鏡のイメージングに最適なスライドから離れる方向にとどまるです
。
5. ピペットを使用して追加の耐フェード スライドとストレージ/イメージング中に死んでからサンプルを維持する coverslip の間を追加します
。

4。共焦点イメージング

1. 取得画像ビューの 1 つのフィールドでキャプチャする全体心臓三日月地域では、最高倍率の目的を使ってします。ナイキストのサンプリング レートを使用して、x ・ y ・ z のボクセルの大きさを決定します。ほとんどの顕微鏡メーカーがあります、" を最適化 " ナイキスト サンプリングが確実にボタン
   。 注: は心臓三日月地域全体を描くが、ここでは、有益な Nkx2 5 の染色です。Z ステップ サイズを小さく (サンプリング) 良い 3 D モデリングの結果になりますが、拡張集録時間および/またはいくつかのサンプルの漂白につながる可能性があります
。
2. は、イメージング最高画像の標準的なプラクティスを使用してパラメーターを設定します。すなわち、各 fluorophore の良い信号対雑音比を達成するため、利得を選択し、信号を飽和させることがなく広いダイナミック レンジを得られるレベルをオフセットする最低の可能なレーザー強度を使用します
   。 注: は、直接比較するサンプル間でパラメーターを画像と一致します。これは下流 3 D 分析と定量化のため特に重要です
。

5。画像解析と定量の 3 D モデリング

注。このプロトコルの Imaris ソフトウェア パッケージを使用して画像を分析しました。同様の分析は、新しい別のパッケージを使用して可能かもしれない。以下の説明は、参照チャネル (すなわち Nkx2 5) の解析パイプラインと 1 つの実験水路 (すなわち YFP) をカバーしています。これらの手順を繰り返し、追加のチャネルを分析できます。例のデータセットは、以下の分析をレプリケートする使用できる提供されています

。

1. Imaris アリーナ ビューに raw 画像データ セットを読み込むし、サーパス ビューで必要な胚のためのファイルを開きます。データは、MIP (最大) モードで 3 D ビューで読み込む必要があります。ディスプレイの調整ウィンドウを開き、参照チャネルのみを選択します
。 良い可視化のために必要な場合、
2. はイメージのしきい値を調整します。この分析では、セグメンテーションの信号対雑音比が小さすぎる場合にガンマを調整します
   。 注: 非線型の調整では、ガンマ補正を実行している場合調整後の画像は強度の測定や比較のため使用できません。この段階で、信号対雑音比を満足できない場合に更なるイメージ事前処理 (すなわち照明修正、ガウス分布のぼかしやその他のフィルター) を実行できます。事前処理を行う場合は、データセットのすべてのイメージの処理前と同じ手順を実行する必要が
。
3. 表面アルゴリズム対話参照チャネルの新しいサーフェスを作成します。
   1. を選択、" のみ興味の地域をセグメント " チェック ボックス
   。
   2. 参照染色による線引きは領域 (ROI、すなわち 心臓の三日月形の領域) が含まれるように境界ボックス領域を調整します
   。
   3. は、ソース チャンネルのドロップ ダウン メニューからチャンネルを選択します。スムージング (z ボクセル サイズに等しい) の既定の設定が通常十分な実証的な最適化が必要な可能性があります。この分析では、スムージング z ボクセルの大きさの半分に等しいを使用します
   。
   4. 絶対強度で実行するしきい値。表面がチャンネルの信号を超えて拡張されませんように調整スライダーを使用して下限値
      。 注: セルを簡単に線引きできる場所、特定の画像を含めることができます、" 分割オブジェクトに触れる " さらに背景からあなたの信号を分けるためのアルゴリズム
   。
   5. はボクセルの数やボリュームによってオブジェクトをフィルター処理し、アルゴリズム生成可能性のあるバック グラウンド (小さいまたは Nkx2 5 エリア外で見つかった) オブジェクトを拒否します。アルゴリズムを完了します
   。
4. 実験水路のマスク チャネルを作成新しく作成されたサーフェスの使用します。
   1. 加工するサーフェスを選択、選択、" マスク Sel... ͟ " 編集ウィンドウから関数
   。
   2. は、対象 (すなわち YFP) 実験的チャネルを選択します。確認、" マスクを適用する前にチャンネルを複製 " チェック ボックスを選択します
   。
5. 表示調整の] ウィンドウ選択マスクのチャンネルのみ。次でマスクされたチャネル手順 5.3 5.3.5 新しいサーフェスを作成します
   。 注: この時点で、ように 3 D モデルの可視化を容易にするために各マスクの外観を調整する: 各サーフェスを選択し、必要に応じて、カラー タブ調整基本色と透明度を選択します。オーバー ラップ表面色は統合されません
。 選択した各サーフェス体積データを取得する
6. は、[統計] タブを選択します。" 詳細 " サブ] タブで、選択 " 平均値 " ドロップ ダウン メニューから。表面の合計量は、生成された表の合計欄に見つけることができます
   。 注: 生成されたサーフェスには、誤ったフラグメント (つまり バック グラウンド信号から除外されていない分割またはメイン サーフェスから不連続領域中にフラグメント) が含まれている場合、必要があります合計ボリュームを手動で計算するかボリュームまたはボクセルの数によって表面をフィルターし、信号セグメントだけが計算に含まれていることを確認します。表面の各部分のボリュームを選択することによって見つけることができます " すべての値 " ドロップ ダウン メニューから。それぞれの値を選択すると、対応する領域が黄色、除外する値を決定する際に補助を表示します
。

結果

最終的なデータと分析の品質は (1) 整合性と切り裂かれた胚 (2) 高い特異性抗体の使用、撮像パラメーター (3) 適切なセットアップの形態に大きく依存します。破損した胚は面生成過程を混同し、定量分析を妨げます。正常解剖と段階的な胚の例を図 2 bに示します。胚は、抗体は非具体的によくバインドが卵黄嚢を外してさらに解剖することがで...

ディスカッション

上記のプロトコルでは、着床後胚の高品質全台紙の蛍光画像から定量的なデータを取得するための戦略について説明します。正しく実行されると、これらの手順によって生成される 3 D ボリューム データが交差形の比較分析および胚内の複数のドメインの使用できます。老舗参照構造と比較して新規な細胞集団を調査するとき説明するアプローチをマスキング面の信号、特定使用されます。<...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt probe	Roboz	RS-9580
Forceps	Roboz	RS-8100
Fine forceps	Roboz	RS-5015
Dissection scissors	Roboz	RS-5912
Saponin	Sigma Aldrich	84510
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A8022
Triton	RPI	A4490
Goat anti-Nkx2-5	Santa Cruz Biotech	sc-8697	Used at 1:100-1:500
Chicken anti-GFP	abcam	ab13970	Used at 1:500
Rabbit anti-Islet1	abcam	ab109517	Used at 1:100
Rabbit anti-Hcn4	Millipore	AB5808	Used at 1:100
488 anti-chicken	Jackson Immunoresearch	703-546-155	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
555 anti-goat	Thermo Fisher Scientific	A21432	Used at 1:500
647 anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	2370	Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.
Superfrost Plus microscopy slides	VWR Scientific	48311-703
22x22 mm coverslips	VWR Scientific	48366-227
Imaris 8.4.1	Bitplane