마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

요약

여기, 우리는 전체 마운트 면역 형광 검사 및 초기 단계 마우스 배아의 양적 volumetric 분석 이미지 기반에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 질적 및 양적 개발, 심장 구조를 평가 하 고 다른 기관 체계에 광범위 하 게 적응할 수 있을 수 있습니다 제안에 대 한 강력한 접근으로이 방법을 제시.

초록

적 발전 이미징 기술 사용 하 여 광범위 하 게 배아 개발의 증가 된 이해에 기여 하고있다. 사전 이식 개발 및 organogenesis는 연구의 두 영역을 크게이 진보, 사전 이식 배아 이미징 또는 vivo 장기 전 직접 얻을 수 있는 데이터의 높은 품질에서 benefitted 있다. 사전 이식 배아는 특히 높은 공간 해상도와 데이터 굴복 했다, 하는 동안 후기 3 차원 개조를 덜 의무가 있다. 운명 매핑 또는 유전 계보 추적 함께 알려진된 미 발달 구조에 대 한 높은-품질 3 차원 또는 체적 데이터를 가져오는 embryogenesis 동안 일어나 전체적 사건의 보다 포괄적인 분석을 위해 수 있게 됩니다.

이 프로토콜 있도록 라벨, 시각화, 및 개발 심장 초승달 내 조상 세포 인구의 정량화에 대 한 키 구조 형성 심장 개발 하는 동안 전체 마운트 면역 형광 접근 방식을 설명 합니다. 접근 같은 디자인은 모두 세포 및 조직 수준의 정보를 얻을 수 있는 방법. Confocal 현미경 검사 법 및 이미지 처리를 사용 하 여이 프로토콜 허용 함으로써 지역화 및 특정 조상 인구 중의 조직 분석 하는 기능을 제공 하는 심장 초승달의 3 차원 공간 재구성 심장 개발의이 중요 한 단계. 중요 한 것은, 참조 항 체의 사용은 심장 초승달의 연속 마스킹 및 초승달 일대의 후속 양적 측정에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜만 초기 심장 개발의 상세한 검사를 사용 하지 않습니다 하지만 적응과 초기 somite 단계 마우스 배아를 gastrula에 대부분 기관 시스템에 적용 되어야 합니다.

서문

Organogenesis의 연구는 오랫동안 발전 태아에 전체적 이벤트의 관찰에 의존 했다. 이러한 연구는 자주 정의 참조 인구의 라벨 형광 염료 또는 조합에서 혈통 추적 기자 들의 사용에 의존 합니다. ¹ 이러한 라벨의 상대적 위치를 비교 하 여 정보 출처, 운동, 또는 관심의 인구의 궁극적인 기여에 얻을 수 수 있습니다. 이식 및 운명 매핑 실험 다음 개발된 배아에 기여에 대 한 검사의 관심, 셀의 시작 지점을 정의 하 형태학 랜드마크 또는 비 운동 계보에 염료의 주입을 사용 합니다. ^{2 , 3 , 4 , 5} 유전 계보 추적 실험 실험 조작 없이 라벨 세포 인구에 사용 되는 잘 정의 된 기자 대립 유전자와 동일한 개념을 사용 합니다. 이러한 접근 키 높은 공간 해상도, 실험의 위치 및 참조 레이블을 확인 하는 기능입니다. 이러한 방식을 사전 이식 개발에 뛰어난 진행 굴복 했다 고 explant organogenesis 연구. ^{6 , 7 , 8 , 9}

심장 morphogenesis 기반이 발달 이벤트 최근 몇 년 동안에서 점점 더 잘 설명 되었습니다. ¹⁰ 연구의이 분야의 주요 발견 중 하나는 고유 마커의 식에 의해 구별 될 수 있다 조상 인구 수의 설명 이다. ¹¹ 이 인구는 첫번째와 두 번째 심장 필드 (FHF SHF), 배아 날 (E) 8.25 마우스 개발에 태아의 앞쪽 측면에서 심장 초승달 내 존재는 포함 됩니다. ¹² 이 인구 넓은 필드 현미경 검사 법, 면역 형광 분석, 조직 수준 정보 및 직렬 단면화를 제공 하 높은 세포 해상도을 제공의 결합을 통해 검사 자주 2 차원 공간 정보입니다. ¹³ 따라서, 이러한 연구는 크게 고급 심장 개발에 대 한 우리의 이해 하는 동안 사용할 수 있는 방법을 제한 morphogenesis의 깊이 정량 분석에 검사 하는 방법에 대 한 필요성을 만들어,이 단계는 이러한 인구 전체 유기 체 수준에서의 조직.

최근 confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 분석 허용 셀 및 구조에서 현장에서 의 고해상도 높은 처리량 알고리즘 개조를 비교적 쉽게 따라서 성패 상세한 연구에 대 한 복잡 한 세포 구조입니다. ¹⁴ 컴퓨팅 파워의 증가와 큰 데이터 관리 알고리즘, 데이터 집합, 이미지의 크기의 지 수 증가 처리 하기 위해 필요한 두 개발 분석 이제 자동화할 수 있습니다 완전히. ¹⁵ 영상 데이터 세트의 자동 분석 수 있는 이점이 되 고의 편견, 하지만 입력된 데이터 집합;의 품질 안정 그것은 절대적, 다음, 최고의 품질, 편견된 분석을 지키는 모범 사례 수집 및 이미지 사전 처리 하는 동안 사용 됩니다. ¹⁶ 프로토콜 수 완전히 자동화 되 고 재현성에 대 한 공유와 독점 소프트웨어에 의해 사용 되는 알고리즘은 쉽게 친숙 현대 독점을가지고 과학자 들에 의해 사용 되는 라이브러리를 통해 사용할 수 또는 오픈 소스 개발자 도구입니다. ¹⁷

다음 프로토콜 organogenesis, 심장 개발 하는 동안 심장 초승달의 형성에의 한 잘 정의 된 모델에 이러한 분석을 수행 하기 위해 필요한 단계를 설명 합니다. 특히,이 프로토콜 (1) 수확 하는 방법에 설명 합니다 및 심장 초승달 단계 태아를 해 부, (2) 참조 (Nkx2-5)에 대 한 전체 마운트 면역 형광 검사 수행 및 실험 (Foxa2Cre:YFP^18,19) 마커, (3) 준비 하 고 배아 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지 그리고 마지막으로 (4) 분석 하 고 계량 고급 3 차원 접근을 사용 하 여 결과 이미지. 심장 초승달에 적절 한 수정, 예를 들어, 사용 된다 초기 somite 단계 배아를 gastrula에서 여러 계보의 분석을 위해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

프로토콜

여기에서 설명한 모든 방법을 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 아이 칸의과 시내산에서.

1. 수확 및 처리 심장 초승달 단계 배아

1. 비옥한 스 터 드 남성으로 비옥한 여성 마우스 친구.
2. 확인 질 결합의 존재에 대 한 플러그 무딘 프로브 또는 집게를 사용 하 여. 플러그 감지 당일 정오 배아 간주 됩니다 하루 (E) (참조 그림 1A 전체 타임 라인에 대 한) 0.5.
   참고: 플러그 확인 되어야 합니다 아침에, 그들은 하루 내내 손실.
3. 8 ^번째 날 (E8.25)의 아침에 희생 임신 댐 공동 ₂ 흡입, 또는 지역 및 기관 규정.
   참고: 정확한 타이밍 종속 스트레인 수 및 형태에 의해 실험적으로 결정 되어야 합니다.
4. 발산을 최소화 하 고 지역을 청소 70% 에탄올과 마우스의 복 부를 스프레이. 피부와 체 벽을 통해 복 부 절 개를 수행 하 여는 내장 노출.
5. 자 궁을 찾아서 동물에서 전체 자 궁 경적을 조심 스럽게 제거 합니다. 자 궁 끝에 진행 하는 동안 자 궁에서 지방 트리밍 한 수 란 관, 위에서 절단 하 여 시작 합니다. 자 궁 경부를 통과 하 고는 다른 수 란 관, 전체 자 궁 출시를 절단의 상단 끝에 계속.
6. 장소 10 cm에 궁 요리와 성 식 염 수 (PBS, pH 7.4)를 초과 피를 씻어 버퍼링. 서브는 배아를 포함 하는 각 deciduum 사이 mesometrium를 절단 하 여 자 궁 해 부. 신선한 PBS 가진 6 cm 접시에 배아를 전송.
7. 해 부 현미경을 사용 하 여 미세 집게 (#5) decidual 조직에서 자 궁 조직을 제거.
8. 사용 하 여 집게, 신중 하 게 태아를 계시 하기 위하여 deciduum의 배아 절반의 팁을 슬라이스. 태아를 밖으로 밀어를 조심 스럽게 태아를 꺼내 deciduum 꼬집어.
9. 배아 ( 그림 1B)의 형태를 손상 없이 최대한 멀리 extraembryonic 조직 해 부.
10. 신선한 PBS 가진 1.5 mL 튜브에 배아를 배치 하 고 얼음에 배치를 전송 피 펫을 사용 합니다. 계속 하기 전에 1.7-1.9 나머지 배아에 대 한 반복.
11. Aspirate PBS 그리고 PBS 가진 한 번 린스입니다. PBS를 발음.
    참고: 손상 또는 배아를 건조 하지 않고 가능한 많은 PBS를 제거 하려고 합니다. 솔루션의 수동 제거 모든 단계에서 배아의 손실을 방지 하기 위해 좋습니다.
실시간에서 1 시간에 대 한 PBS에
12. 수정 배아 4 %paraformaldehyde (PFA)
    참고: 배아에 고정 될 수 있는 오버 나이트 (O/N) 4 ° c.
13. PBS로 3 회 린스입니다. 면역 형광 검사 진행 준비가 될 때까지 4 ° C에서 배아를 유지.
    참고: 포인트를 일시 중지 합니다. 태아 수 있습니다 안전 하 게 저장 PBS에 4 ° C에서 몇 주 동안.

2. 면역 형광 검사 얼룩

참고: 외피 조건 아래 서로 다른 일정에 맞게 조정 될 수 있다. 부드러운 진동 또는 모든 긴 인큐베이션 단계 락의 사용은 권장.

1. PBS를 제거 하 고 차단 버퍼 (0.5% 사포닌, 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에)의 1 mL을 추가.
2. 품 어 실시간에 적어도 4 h 이 또한에서 할 수 있습니다 O/N 4 ° c.
3. 블로킹 버퍼를 제거 하 고 기본 항 체 혼합물 희석 블로킹 버퍼에 추가. O/N 4 ° c.에 품 어
   참고: 항 체에 대 한 참조 자료 섹션 사용 하 고 희석을 제안 했다. 항 체 희석은 실험적으로 결정 되어야 합니다. 심장 초승달에 대 한 참조 얼룩으로 Nkx2-5의 사용 권장 이며 다운스트림 핵심 이미지 세분화 및 분석 단계.
4. 포부에 의해 1 차 항 체를 제거.
5. 1 h 각 0.1%에 대 한 3 번 세척 PBS에 트리톤.
6. 세척 제거 하 고 차단 버퍼에 희석 하는 이차 항 체 혼합물을 추가 합니다. 실시간에서 3 h에 대 한 품 어 이 또한에서 할 수 있습니다 O/N 4 ° c.
7. 워시 1 h 각 0.1%에 대 한 3 회 PBS에 트리톤. 이 또한에서 할 수 있습니다 O/N 4 ° c.
8. Counterstain 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) PBS에 10 분 대 한
   참고:이 counterstain 수행할 수 있습니다 동시에 이차 항 체.
9. 세척 2 번 5 분 각각 0.1%와 PBS에서 트리톤.
10. 천천히 방지 페이드 설치 미디어 (2 %w / v n-틸 gallate (nPG), 90% 글리세롤, 1 x PBS;에 배아를 일시 중단 자세한 내용은 대 한 참조 자료 섹션). 장착 하기 전에 적어도 1 시간을 equilibrate 수 있습니다. 부드럽게 배아 방지 페이드 솔루션에 수 있도록 주기적으로 튜브 영화.
    참고: 포인트를 일시 중지 합니다. 배아 마운트 이미지 준비까지 방지 페이드 솔루션에서 며칠 동안 저장 될 수 있다.

3. 현미경 검사 법에 대 한 배아를 장착

1. 준비 현미경 슬라이드 더블 막대기 테이프 또는 실리콘 스페이서를 사용 하 여 장착. 더블 막대기 테이프를 사용 하는 경우 5-6 층 약 15-20 m m의 두 개의 병렬 스택 떨어져 확인 합니다. 이 배아를 놓고 coverslip ( 그림 1C) 확보에 충분 한 공간을 떠날 것 이다.
2. 는 슬라이드 더블 막대기 테이프 사이 안티 페이드의 15 µ L 드롭 장소. 신중 하 게 슬라이드에 하나의 배아를 전송.
   참고: 둘 이상의 태아를 슬라이드에 배치할 수 있습니다. 그러나, 이후의 방향 단계 더 어려운 여러 개의 배아, 그리고 긴 기간 이미징 사진 표백 될 수 있습니다.
3. 미세 집게를 사용 하 여 해 부 현미경, 아래 위치 태아는 앞쪽 면 슬라이드의 긴 축에 맞춰 몸 축 슬라이드에서. 그림 1C 장착 설치의 회로도 참조 하십시오.
4. 신중 하 게 장소는 coverslip 샘플 더블 막대기 테이프의 한 스택에 한쪽을 쉬고 부드럽게 될 때까지 다른 테이프 연락처는 coverslip를 낮은 집게를 사용 하 여.
   참고: 3.3 및 3.4 단계는 영상에 대 한 배아의 올바른 방향을 위해 중요 합니다. 앞쪽 방향으로 후부 따라 coverslip 낮추어 태아 롤 하지 해야 하 고 심장 초승달 지역 슬라이드 이미지는 거꾸로 한 현미경에 이상적입니다에서 방향이 있을 것입니다.
5. 는 피 펫을 사용 하 여 추가 방지 페이드 슬라이드 샘플 저장/이미징 동안 밖으로 죽기에서 유지 하는 coverslip 사이 추가.

4. Confocal 영상

1. 취득 이미지 보기의 한 필드에서 캡처 전체 심장 초승달 지역에 대 한 수 높은 배율 목표를 사용 하 여. 나이 키스 트 샘플링 속도 사용 하 여 x-y-z 복 치수를 결정. 대부분의 현미경 제조 업체 해야한다는 " 최적화 " 나이 키스 트 샘플링 되도록 버튼.
   참고: Nkx2-5에 대 한 얼룩는 도움이 여기, 그것 심장 초승달 지역 전체 윤곽을 그리 다 것입니다. 작은 Z 단계 크기 (오버 샘플링) 더 나은 3D 모델링 결과 얻을 것 이다 하지만 확장된 수집 시간 및 몇 가지 샘플에 대 한 표백으로 이어질 수 있습니다.
2. 이미징 표준 최고의 이미징 방법을 사용 하 여 매개 변수를 설정 합니다. 즉, 가장 낮은 가능한 레이저 강도 사용 하 여 각 fluorophore에 대 한 좋은 신호 대 잡음 비율을 달성 하 고 이득 선택 수준 신호를 흠뻑 젖 게 하지 않고 넓은 동적 범위를 생성 하는 오프셋을.
   참고: 매개 변수 사이의 직접 비교 샘플 이미지와 일치 수 있습니다. 이것은 다운스트림 3D 분석 및 정량화에 대 한 특히 중요 하다.

5. 이미지 분석 및 양적 3D 모델링

참고: 이 프로토콜에 대 한 이미지는 Imaris 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 분석 되었다. 비슷한 분석 대체 패키지를 사용 하 여 있을 수 있습니다. 아래 설명 참조 채널 (즉 Nkx2-5)에 대 한 분석 파이프라인 및 한 실험적인 채널 (즉 YFP) 포함 한다. 추가 채널 단계 반복을 통해 분석할 수 있습니다. 아래 분석을 복제를 사용할 수 있는 제공 된 예제 데이터 집합 되었습니다.

1. Imaris 경기장 보기에 원시 이미지 데이터 세트를 로드 하 고 Surpass 보기에서 원하는 배아에 대 한 파일을 엽니다. 데이터는 성능 측정 (최대) 모드에서 3 차원 보기에 로드 됩니다. 디스플레이 조정 창을 열고만 참조 채널을 선택 합니다.
2. 더 좋은 시각화를 위해 필요한 경우 이미지의 임계값을 조정 합니다. 이 분석 조정 감마 신호 대 잡음 비율 세분화를 위한 너무 낮은 경우.
   참고: 지금까지 있는 비 선형 조정, 감마 보정을 수행 하는 경우에 조정 된 이미지 강도 측정 또는 비교에 사용할 수 없습니다. 이 단계에서 신호 대 잡음 비율을 만족 하지 않으면 더 이미지 사전 처리 (즉, 조명 수정, 가우스 흐림 또는 다른 필터링)을 수행할 수 있습니다. 데이터 집합에 있는 모든 이미지에 대 한 같은 전처리 단계를 수행 해야 합니다 사전 처리를 수행 하려는 경우.
3. 표면 알고리즘 대화를 사용 하 여 참조 채널에 대 한 새로운 표면을 작성.
   1. 선택은 "만 지역의 관심을 세그먼트 " 확인란.
   2. 경계 상자 영역으로 참조 얼룩에 의해 delineated 관심 (ROI, 즉 심장 초승달 영역) 영역 포함 되도록 조정.
   3. 소스 채널 드롭다운 메뉴에서 참조 채널을 선택합니다. 스무 딩 (z 복 크기와 같음)에 대 한 기본 설정은 일반적으로 충분 하지만 경험적 최적화 필요할 수 있습니다. 이 분석에 대 한 사용 하 여 부드럽게 반 z 복-크기.
   4. 절대 강도 의해 임계 처리 수행입니다. 표면 채널 신호 넘어 확장 되지 않습니다 있도록 조정 슬라이더를 사용 하 여 하한값.
      참고: 셀 쉽게 delineated 될 수 있는 특정 이미지를 포함 시킬 수 있습니다는 " 개체를 감 동적 분할 " 알고리즘 추가 배경에서 신호를 분리 하.
   5. 복 번호 또는 볼륨 개체를 필터링 하 고 거부 배경 (작거나 Nkx2-5 지역 이외의 지역에서 발견) 개체는 알고리즘 생성 될 수 있습니다. 알고리즘 완료.
4. 새로 만든된 표면을 사용 하 여 실험 채널에 대 한 마스크 채널을 만듭니다.
   1. 선택 사용 선택은 " 마스크 Sel... ͟ " 편집 창에서 함수.
   2. 관심 (즉 YFP)의 실험적인 채널을 선택합니다. 있는지 확인은 " 마스크를 적용 하기 전에 채널을 중복 " 확인란이.
5. 디스플레이 조정에 창만 마스크 채널을 선택 합니다. 5.3 5.3.5 단계를 수행 하 여 마스크 채널 새로운 서피스를 생성.
   참고:이 시점에서 그것은 도움이 될 수 있습니다 3D 모델의 시각화를 촉진 하기 위하여 각 마스크의 모양을 조정: 각 서피스를 선택 하 고 필요에 따라 색상 탭 조정 기본 색상 및 투명도 선택. 표면 색상 중첩 때 병합 하지 마십시오.
6. 선정 각 표면 체적 데이터를 얻으려면 통계 탭을 선택 합니다. 에 " 상세 " 하위 탭, 선택 " 평균 값 " 드롭-다운 메뉴에서. 생성 된 테이블의 금액 열에 표면의 총 볼륨을 찾을 수 있습니다.
   참고: 생성 된 표면에 잘못 된 조각 (즉, 배경 신호에서 제외 되지 않습니다 동안 세분화 또는 주요 표면에서 불연속 조각) 있으면 그것은 해야 할 수 있습니다 총 볼륨을 수동으로 계산 또는 볼륨 또는 복의 수에 의해 표면 필터 및 신호 세그먼트에만 계산에 포함 됩니다. 표면의 각 부분에 대 한 볼륨을 선택 하 여 찾을 수 있습니다 " 모든 값 " 드롭-다운 메뉴에서. 해당 영역이 제외 값 결정에 에이즈 노란색 표시 되도록 각 값을 선택 하면.

결과

최종 데이터 분석의 품질 크게 (1) 무결성과 해 부 배아 및 (2) 높은 특이성 항 체의 사용, (3) 적절 한 설치 매개 변수를 이미징의 형태에 따라 달라 집니다. 손상 된 배아는 표면 생성 프로세스를 혼동 하 고 정량 분석을 방해 합니다. 제대로 해 부 및 무대 태아의 예는 그림 2B에 표시 됩니다. 배아는 항 체 자주 바인딩하는 것입니다 비-특히 노른자위 낭...

토론

위의 프로토콜 후 이식 마우스 배아의 높은 품질의 전체 마운트 면역 형광 이미지에서 양적 데이터를 얻기 위한 전략을 설명 합니다. 올바르게 수행 하는 경우이 단계를 통해 생성 된 3 차원 체적 데이터 태아 내의 여러 도메인의 비교 및 intersectional 분석에 사용할 수 있습니다. 잘 설립 참조 구조에 비해 소설 세포 인구를 조사할 때 설명 하는 접근을 마스킹 표면 신호 특정 사용입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt probe	Roboz	RS-9580
Forceps	Roboz	RS-8100
Fine forceps	Roboz	RS-5015
Dissection scissors	Roboz	RS-5912
Saponin	Sigma Aldrich	84510
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A8022
Triton	RPI	A4490
Goat anti-Nkx2-5	Santa Cruz Biotech	sc-8697	Used at 1:100-1:500
Chicken anti-GFP	abcam	ab13970	Used at 1:500
Rabbit anti-Islet1	abcam	ab109517	Used at 1:100
Rabbit anti-Hcn4	Millipore	AB5808	Used at 1:100
488 anti-chicken	Jackson Immunoresearch	703-546-155	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
555 anti-goat	Thermo Fisher Scientific	A21432	Used at 1:500
647 anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	2370	Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.
Superfrost Plus microscopy slides	VWR Scientific	48311-703
22x22 mm coverslips	VWR Scientific	48366-227
Imaris 8.4.1	Bitplane