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要約

このプロトコルでは、時効中における組織再生の研究をパラビオーゼと組み合わせれば術後 neuroinflammation と行動変容のメカニズムの研究に使用されている整形外科のマウス モデルについて説明します。

要約

手術は、改善し、生活の質を維持する使用されます。残念なことに、高齢者など傷つきやすい患者では合併症と著しく低下し、結果発生する可能性があります。確かに、骨折を修復するためのルーチンの整形外科後、高齢患者の 50% に苦しむせん妄のような神経学的合併症。また、癒すし、手術後の組織を再生する能力は、加齢とともに減少、破壊修理やインプラントの骨も統合の品質に影響することができます。したがって、これらの年齢依存した変更をドライブ メカニズムの理解は、このような合併症のリスクを最小限に抑え、結果を最適化する戦略目標を提供できます。脛骨骨折の臨床的に関連するマウスのモデルを紹介します。これらのマウスの術後変化人間の日常の整形外科手術後一般的に観察される認知障害のいくつかを模倣します。簡単に言えば、厳密に無菌条件下で右後肢で切開を行います。筋肉の関連付けが解除され、髄運河の内側の脛骨の上部の紋章に 0.38 mm ステンレス鋼ピンが挿入されます。骨切り術を行った後、傷口はホチキス止め。周手術期の術後 neuroinflammation と行動の変化に及ぼす影響を調査するためのこのモデルを使いました。パラビオーゼ、2 マウス、吻合、外科的モデルとの組み合わせでこの破壊モデルを適用することによって細胞と全身傷害の後の器官機能と組織再生を活性化させる分泌因子を検討しました。私たちのステップバイ ステップのプロトコルに従うことによってこれらのモデルは高忠実に再現できるし、外科的外傷によって変更されている多くの生物学的経路を尋問する合わせることができます。

概要

手術医療の医療システムを変えた継続的に最先端の技術、安全性の向上に貢献しているし、生活の質を維持します。残念ながら、手術は、術後創傷感染、神経学的障害など特に高齢患者1,2でも死亡率につながる病態生理学的反応を誘導します。整形外科は、高齢者が、生活の質を改善し、共通の骨の傷害を修復を中心に、日常的に実行されます。ただし、65 歳、術後せん妄など古い経験神経障害、整形外科患者の 50% まで。これは、一貫して永続的な機能低下、6 ヶ月で予後不良、すなわち死亡のリスクの 5-fold 増加相関増加看護、入院患者、増加の長さと特別養護老人ホームの配置率が高いあたり時間3,4,5. 高齢者を含む、いくつかの危険因子が同定されているが、術後後神経学的障害に責任があるメカニズムについて知られている少し。

Neuroinflammation と脳の健康 (認知機能)6,を含む術後の回復に周辺の外傷の影響を判断する脛骨骨折のマウスモデルを設けて骨折は高齢者では非常に一般的なので7しますこのモデルでは、もともとハリーらによって記述された。8、[全身麻酔と鎮痛、脛骨骨折の髄内固定とで構成され、こうして模倣皮膚傷害、外傷、筋肉そして骨一般的な長管骨骨折関連付けを修復人間で修復します。この手順の後マウスは炎症性マーカー宣言的記憶の障害に関連付けられている海馬におけるミクログリア活性化と同様、人間9,10, 観測された変化と同様の変化を示すと海馬の神経可塑性6,7,11。我々 は以前パラビオーゼでこの破壊モデルを組み合わせています。パラビオーゼは、2 マウスを吻合は、循環システムを共有したがって手術モデルです。このモデルは、画期的な循環細胞と年齢や病気の12,13,14のコンテキストにおける臓器機能液性因子による制御の効果の理解を提供しています。このアプローチを使用して我々 は最近癒しの12年齢依存性破壊に伴う全身的要因を発見しました。

脛骨骨折モデルを組み合わせた再生医療と神経免疫学に関連する骨の脳年齢依存性のメカニズムを研究するパラビオーゼ プロトコルを紹介します。プロトコル 1 a は、脛骨骨折プロシージャ (図 1 a) パラビオーゼ プロシージャ、およびプロトコル 1 b の詳細を説明します。これらは、単独または組み合わせて、尋問の性質に応じて実行できます。

プロトコル

すべての動物実験がケアと実験動物の使用のため国立の機関健康ガイドに従って行われ、制度的動物ケア & 使用委員会 (IACUC) デューク大学によって承認されました。

1. 実験動物

  1. 標準的な食品と水に 12 時間の明暗サイクルと適切なアクセスとエアコン環境でマウスを維持します。ケージごと以上 5 同腹子を家し、の戦いを励ますことができる状態を避けます。
  2. 年齢 (若) の 3 ヶ月または 18 ヶ月 (古い) 時代ので女性 C57BL6/J マウスを使用します。
  3. パラビオーゼ、一緒に手術前に少なくとも 2 週間の 2 マウスを順応します。マウスは、野生型 C57BL6/J または eGFP +。
  4. マウスの全体的な外観は毎日体の状態を確認します。

2 パラビオーゼと整形外科の術前のセットアップ

  1. 2 マウスの重量を量る。
  2. 一定 O2フロー速度 0.2 L/分誘導誘導室使用 5% イソフルランの麻酔システムを介して全身麻酔を管理します。
    注: 麻酔の深さは、つま先のピンチを使用して確認できます。
  3. 仰臥位で加熱パッドの上にマウスを配置します。直腸プローブを使用すると、手術中の体の温度を監視します。
  4. 麻酔を維持するために 2.0 %0.2 L/分フェイス マスクを通してイソフルレンの吸入濃度を下げます。麻酔の十分な深さを確保するため監視します。
  5. (呼吸数、酸素飽和度や心を打つ)、パルス酸素濃度計(オプション)を用いた非侵襲的生理学的パラメーターを監視します。

3. パラビオーゼ手術 (プロトコル 1 a)

  1. 鎮痛を管理 (ブプレノルフィン、SR/遅いリリース、0.1 mg/kg 皮下) 誘導後、手術操作の前に。オープニングの直前に側面でブピバカイン (0.25%) を挿入します。目の潤滑剤を適用します。
    注: パラビオーゼ プロトコル実行できますない独立して脛骨骨折から。
  2. すべて体内縫合、4-0 polydioxanone 縫合糸を使用します。すべて外部縫合, 4-0 ポリプロピレン縫合糸を使用します。
  3. 肘、わき腹と結合する側の膝から連続した線に沿って 2 マウスのそれぞれのひげをそる。ヨードで消毒 + 70% アルコールの皮膚切開の準備でサイクルを交互 3 以上のスクラブします。
    オートクレーブの楽器を使用し、滅菌フィールドを維持します。
    注: は、eGFP マウスの右側に野生型マウスを置き、手術 (図 1) の野生型マウスの左のわき腹と eGFP マウスの右のフランクを準備します。
  4. 各マウスのハサミを使用して、脇腹に肘までの皮膚の下に筋肉を乱すことがなく、ただ近位に膝に近位に至るまでに沿って皮膚切開を行います。
  5. 2 縫合と動物の上腕三頭筋に参加します。
  6. 7-9 パスの実行, 連続縫合と側面に沿って体壁を結合します。
  7. 2 縫合の動物の大腿四頭筋に参加します。
  8. 縫合と 2 parabionts の皮膚を閉じます。
  9. 周囲の空気で覚醒するマウスを許可します。
  10. このプロトコルの成功を確保するためのペアの健康を維持する必要があります: 毎日ペアを監視週 2 回の得点の体の状態を実行します。週 2 回、ペアの重量を量る。
    注: 各ペアは個別に収容されています。
    注: 正規ブプレノルフィン (すなわち SR/遅いリリース) を使用して、3 日間の 0.1 mg/kg 1 日 2 回マウスあたり生理食塩水 1 mL で皮下を管理します。
  11. Parabionts 脛骨骨折の手術を行う場合の間共有の循環を確保するための回復時間の 4 週間かかります。

4. 脛骨骨折手術 (プロトコル 1 b)

  1. 鎮痛を管理 (ブプレノルフィン、0.1 mg/kg 皮下) 誘導後、手術操作の前に。手術部位の直前に膝に近位にブピバカイン (0.25%) を挿入します。目の潤滑剤を適用します。
  2. 外科領域を公開するマウスの右後肢の内側面を剃るし、ヨウ素 + 70% アルコール肌のスクラブとサイクルを交互 3 以上を消毒します。プロシージャ全体で滅菌手術野を維持します。汚染を制限するには使用オートクレーブ機器や手袋;(省略可能) 解剖顕微鏡下で手術を完了します。体の温度を維持するために加熱パッドを使用します。
    注: parabionts でプロトコルを実行する場合のみ 1 マウスはペア (マウスの右の右脛骨) に骨折しました。Parabionts の破壊の模式図は、図 1 bを参照してください。
  3. ハサミを使用して、マウスの右上右後肢の内側面に沿って皮膚切開を近位脛骨の骨幹に膝。
  4. 脛骨の骨幹を公開し、視覚的に骨幹を探します。フレックス膝や脛骨高原のランドマークとして膝蓋大腿靱帯を使用して可視化します。
  5. 膝蓋腱; を可視化します。手動で 25 ゲージ針を使用して髄運河で親指と人差し指 0.5 mm の穴をローリングでドリルします。
    注: 穴が通る脛骨に沿って平行に脛骨の高原。
  6. 抵抗を感じたとワイヤー カッターを使用して脛骨プラトーでフラッシュ カットまで髄腔に穴約 15 mm から 0.38 mm ステンレス鋼ピンを挿入 (三次元再構成のための補足のビデオ 1を参照)。
  7. ストレートのボンのはさみを使用して、脛骨骨幹 (骨幹) を破壊します。骨折の模式図は、図 1を参照してください。
  8. 骨折部位や隣接する組織破壊視力の安定化のために点検に視覚的に観察します。
  9. 皮膚ステープルを閉じます。
  10. きれいな家のケージに戻す前にリカバリする加熱パッドにマウスを配置します。流体交換のため各マウスの皮下 1 mL prewarmed (37 ° C) 通常生理食塩水を注入します。
  11. マウス跛行や感染症、出血の兆候を毎日確認してください。
    注: 正規ブプレノルフィン (すなわち SR/遅いリリース) を使用して、3 日間の 0.1 mg/kg の毎日の生理食塩水 1 mL の皮下を管理します。

結果

横骨切り術をピンと適切な縫合の安定挿入無菌条件下で慎重に行った後、マウスは跛行や感染症、手術後左下肢の出血の兆候を示した。サフラニン O 後レントゲン解析と強度を使用して査定された整形外科治療 (図 2) を染色します。骨幹部骨折脛骨のレントゲン写真には、若いマウスより老齢マウスの破壊角質の破壊角質より組織沈着が示されます。破壊角質は脱灰され、組織学的解析のための準備でパラフィンに埋め込まれました。サフラニン O 染色、強度解析を用いて組織沈着を定量化します。破壊角質若いマウスの骨老齢マウスから破壊角質より小さい線維組織を含まれています。

脛骨骨折は、全身および中央炎症6,7,11,15,16を誘導します。確かに、末梢レベルのプロ炎症性サイトカインと危険性関連分子パターン (DAMPs) は、マウスとヒトの7,17,18両方整形外科後急速に昇格されます。これは、細胞、体液、神経経路7,15,19,20を含むいくつかのシグナル伝達メカニズムを介して脳のミクログリア細胞の活性化に貢献します。 21。次の手術、内皮機能障害、血液脳関門のオープニング、周辺マクロファージ浸潤は野生型と Ccr2 急性海馬 neuroinflammation に貢献RFP/+ Cx3cr1GFP/+アダルト マウス15,19、人間せん妄と術後認知機能障害15,19,22のようにその後記憶障害に関連付けられているとします。IBA 1 免疫染色 (図 3) によって検出された、このアミロイドの応答、ミクログリアの形態の大幅な変更と高齢動物で悪化します。

ここで説明する脛骨骨折モデルを使用して、またわかった一過性障害海馬ニューロン新生、海馬歯状回20doublecortin (DCX) 免疫染色の減少によって証明されるよう.長期増強 (LTP)、メモリー機能のためのサロゲートの電気生理学的測定は、術後神経可塑性の時間依存型破壊を明らかに11。手術後のマウスは海馬依存性の記憶関数、たとえば恐怖条件付け行動評価 (図 4) を使用して、障害を表示します。恐怖条件付けマウスが商工会議所に配置し、有害な刺激 (すなわち、フット ショック) 続いて聴覚手がかりにさらされています。脛骨の手術後 3 日間はあらゆる聴覚や嫌悪刺激せず今回エアコン室でマウスをテストし、凍結挙動 (詳細なプロトコルを参照してください23) のメモリのインデックスとして記録されます。

高齢者は、記憶低下の重要な危険因子です。まだ、私たちの年齢として組織の修復と再生の能力も減少するこれらのメカニズムの理解が不十分なまま。したがって、我々 は記載 (ヤング/古い動物をペアリング) heterochronic パラビオーゼを実行するプロトコルを使用、破壊 (詳細なパラビオーゼ プロトコルを参照してください24) の高齢のマウスの中に癒しを評価しました。Parabiotic ペア間血共有だった確認し、等しい12のあることが判明します。以前組合と若々しい循環強化骨修復への暴露は、骨沈着を増加し、線維化 (図 5)12を減少します。骨再生のこの若返り内因性オステオカルシン陽性骨芽細胞 (図 5、茶色のセル) の独立が発生しましたが、むしろ若い parabiont (図 5、青いセル) から移行 CD45 陽性細胞に頼って.CD45 陽性造血細胞がよりアクティブになるそれらを誘発する高齢者の骨芽細胞に信号が若々しく、健康的なニッチを分泌することが示唆されました。

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図 1: パラビオーゼと脛骨骨折手術の模式図.(A) パラビオーゼと脛骨骨折 (プロトコル 1 a) や脛骨骨折だけで (プロトコル 1 b) を実行するためのタイムラインです。(B) バイノーラルビートまたは heterochronic parabiotic のペアで 20 ヶ月齢マウスの脛骨がフラクチャされた (マウスの右の右脚がフラクチャされている X と示された)。グリーン マウスは eGFP マウスを描写しながら、灰色のマウスは野生型マウスを描いています。(C) 髄内固定と骨幹骨折脛骨骨折モデルの模式図。後肢の 3次元再構成と脛骨の固定の補助ビデオ 1も参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 2: 脛骨骨折は、老いも若きもマウス モデル内で治癒します。若いまたは古いマウスの脛骨を骨折した、破壊角質調査の 21 日のポスト傷害。(A) 放射線イメージングおよび組織学的染色 (サフラニン-O) 破壊角質 21 日ポスト破壊を評価する使用されました。染色は、青と赤でプロテオグリカン (軟骨内) で膠原線維組織を示しています。破線は、破壊のカルスのおおよその位置を示しています。(B) 強度は、骨、軟骨、および線維化組織破壊カルス 21 日ポスト破壊内堆積量を評価するために使用されました。平均 ± 95% 信頼区間データを表現する、* P < 0.05 で、統計的に有意な (一方通行 ANOVA、Dunnett のテスト)、スケール バーが 2 mm を表し、顕微鏡、1.25 倍の目的を使用して画像を得た。n = 各サンプルの 9。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 3: 手術による海馬における年齢依存性ミクログリア活性化。脛骨骨折手術は高齢マウス (20 ヶ) 4 ヶ C57BL6/J マウスと比較された大きい海馬 neuroinflammation を誘導します。脳セクション ミクログリア マーカー IBA 1 染色より積極的な手術後 24 h ・ グループのセルと外科の形態学的変化を示しています。100 倍の倍率で epifluorescent 顕微鏡で画像が得られた;。スケール バーを表す 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 4: 脛骨骨折手術後の神経新生、長期増強と記憶機能の障害です。(A) DCX、神経、定量的なマーカーが手術後 24 h で海馬歯状回に削減します。10 x の倍率で共焦点レーザー スキャン顕微鏡目的で画像が得られました。バー μ m 10 を表します。 コントロールまたはマウス 24 h から海馬スライスで (B) を電気生理学手術後スケールします。長期増強 (LTP) 高頻度刺激 (HFS) によって誘導され、記録 1 時間以上定期的に満たされた細胞外記録ピペットを使用して CA1 地層結腸寄生虫から記録されたフィールド興奮性シナプス後電位 (fEPSPs)人工髄液。手術後 24 時間は、ltp は制御マウスに比べて激減します。データは平均 ± s.e.m. n で表される = 3、* p < 0.05 1 ウェイ分散。(C) 海馬依存メモリ機能 (トレースを使用して凍結の % として定義されている恐怖) はマウスのコントロールと比較しての手術と麻酔だけに暴露された動物後損なわれます。データは平均 ± s.e.m. n で表される 9-10 = * p < 0.05 1 ウェイ分散。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 5: パラビオーゼ手術は骨折の治癒、血共有、およびドナー細胞の生着の若返りにつながる。バイノーラルビートと heterochronic パラビオーゼの組み合わせが確立され、各ペアの高齢マウスは骨折し骨の治癒を評価しました。(A) 破壊放射線イメージングを使用して角質を調べた。破線は、破壊のカルスのおおよその位置を示しています。(B) 生着 eGFP 陽性細胞の骨髄内で確認されました。破壊カルスの (C) を免疫組織化学は、eGFP+ドナー細胞 (青) とオステオカルシン+骨芽細胞 (茶色)、parabiont からを識別するために使用されました。スケール バーは、50 μ m を表し、40 × 対物を使用して画像を得た。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

補助ビデオ 1: 三次元の後肢と脛骨を固定します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

ディスカッション

骨折は共通の臨床問題であり、罹患率、特に急速に成長のシニア人口の主要な原因のまま。脛骨骨折術後 neuroinflammation と認知障害の責任のメカニズムを研究するためのマウスモデルのステップバイ ステップ プロトコルを紹介します。このモデルは、神経免疫の相互作用、組織再生、他のシグナル伝達過程を研究するパラビオーゼ手術と併用することができます。これらのメカニズムを理解することと、術後合併症のリスクを最小限に抑え、結果を最適化する戦略的なターゲットを提供します。

いくつかの整形モデルは齧歯動物25骨修復を研究して開発されています。採用し、もともとハリーらによって記述された、この脛骨骨折手順を変更8、整形外科の脳機能に及ぼす影響を研究します。また使いましたこの破壊モデルの組み合わせでパラビオーゼ モデル骨の治癒、年齢依存性組織の再生に責任がある要因を検討します。この脛骨骨折手順動物 (マウスおよび基になる遺伝的感受性の年齢)、に応じて最小限の死亡率ゼロの結果につき約 15 分を必要とし、共通を繰り返す揮発性全身麻酔下で実行されると、侮辱は長管骨骨折や整形外科的外傷に関連付けられています。したがって、このモデルは、生物学的経路を問い合わせると縦断的評価を行うに最適です。しかし、それは重要ですが、骨切り術と固定、再現可能な一貫性のある軟部組織を損傷。たとえば軟部組織損傷は、骨膜を剥離し、手術を外傷性に周囲の筋肉をつまんででは調整できます。鈍的外傷の非固定または三点曲げによる外傷性骨折モデルこのような整合性や精度、できません。これらのプロシージャは頻繁長引く炎症反応につながる再傷害で起因します。逆に、厳格な固定を伴う破壊のモデルは、整形外科26,27に関連付けられている被害を完全に再現できないより穏健な炎症を持っています。

チタン合金の固定を使用して他のモデル密接に模倣人間人工関節を開発されているし、義足が不安定、融解、マウス28,29 人工合併を審尋に関連する場合があります。.ドリル穴モデル紹介、1 つ提供十分な安定化などのタスクを混同できる大幅な赤字なし行動パラダイムの中でマウスをテストことができますよう恐怖エアコンまたはオープン フィールド歩行/不安テスト6 ,7,11,15,19,20。ただし、回転変形は固定が正しくロックされていない場合に発生します。いくつかのモデルを使用、創外固定器、優れた安定化を提供していますが、マウス脛骨に実装する難しいのマウス大腿骨27で正常に実装できます。

せん妄など術後の高次脳機能障害、認知障害、骨折修復、特に高齢者や虚弱患者30整形外科後の一般的な合併症。脛骨骨折手術のこの臨床的に関連するマウスのモデルを示して、術後全身サイトカインのリリース6,7,17, 障害血液脳関門機能15,19、ミクログリアの形態16,22を変更、記憶障害に貢献し、整形外科手術後多くの患者に見られる術後の神経学的合併症の重要な機能があります。他の手術は術後認知機能障害をモデルに使用されていることに注意してくださいすることが重要です。腹部31,,3233 34血管外科と表面的な外傷35,36が含まれます。パラビオーゼ技術は、すべての炎症、グリアの活性化を共通のメカニズムによって媒介される可能性があります行動の赤字など、類似の端点を共有するこれらのモデルに適用されます。

パラビオーゼを含む研究は、高齢動物37,38,39,40 の組織が若返り、neuroinflammation、認知機能に影響を与える循環要因のあらたな役割を明らかにしました。 ,,4142。我々 はそのパラビオーゼが正常に記載されている再生経路を照会および血液媒介要因影響の治癒と破壊が12を修復を含むメカニズムを研究する脛骨骨折モデルと組み合わせることを示しています。ここでは、高齢の動物は、若い動物に吻合だときに活性化することができます高齢動物の骨折修復能力を示した。年齢のこの逆転は、骨折部位に造血細胞の生着に根ざしていた。興味深いことに、このような若返りは老齢マウスに若い骨髄の移植をまた達成できます。この点では、骨髄移植パラビオーゼにより直接的より簡単な方法を考えることができます。しかし、パラビオーゼは循環細胞と要因の機能を調査するためにより堅牢なモデルです。我々 は、パラビオーゼと整形外科手術モデルの組み合わせが周術期ケアおよび老化の生物学の重要な質問に答えることで重要な役割を果たすことを期待します。

要約すると、脛骨骨折術後 neuroinflammation と整形外科手術後の認知機能障害のための責任のメカニズムを研究するためのマウスモデルのステップバイ ステップ プロトコルを紹介します。このモデルは、神経免疫の相互作用、組織再生、他の経路を研究するパラビオーゼ プロシージャと併用することができます。これらのメカニズムを定義すると、術後合併症のリスクを最小限に抑え、結果を最適化する戦略的なターゲットを提供します。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

キャシー ゲージ、BS (デューク大学医療センター麻酔科ダーラム、ノースカロライナ州) は、編集者の支援を感謝いたします。NT は、デュークの麻酔から NIH/ニア R01 AG057525-01 夢の革新助成金からのサポートを認めています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
IsofluranePiramal HealthcareNDC 66794-017-25Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used
BuprenorphineReckitt-Benckiser PharmaceuticalsNDC 12496- 6757-1Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations
EthanolFisher Scientific04-355-45170% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning
10% povidone IodineDynarexFor antiseptic treatment of skin
SomnoSuiteKent ScientificSS-01Low Flow  Anesthesia system
MouseSTATKent ScientificPS1161Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor
ShaverWahl9854L
StereomicroscopeLeicaMZ6
Scalpel HandleFine science tools10003-12
Scalpel Blades - #11Fine science tools10011-00
Adson ForcepsFine science tools11006-12Needed for stripping the periosteum
Iris ForcepsFine science tools11066-07Useful (1x2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma
Bonn Scissors (Straight)Fine science tools14084-08Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt
Fine ScissorsFine science tools14058-09Sharp scissors for cutting sutures
22G x 3.5 In Quincke  Spinal NeedleBD405181Use inner rod for pinning
Needle HoldersFine science tools12001-13
SutureLook1079B
C57BL6/JJackson Laboratory stock no. 000664
eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously)Jackson Laboratory stock no. 003291

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