JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol mekanizmaları ameliyat sonrası neuroinflammation ve davranış değişiklikleri ve doku rejenerasyonu yaşlanma sırasında çalışmaya parabiosis, birlikte çalışma için kullanılan ortopedik cerrahi bir fare modeli açıklar.

Özet

Cerrahi genellikle geliştirmek ve yaşam kalitesi sağlamak için kullanılır. Ne yazık ki, yaşlı gibi güvenlik açığı bulunan hastalarda, komplikasyonlar ortaya ve sonuç önemli ölçüde azalır. Gerçekten de, bir kırık onarmak için rutin ortopedik cerrahi sonra deliryum gibi nörolojik komplikasyonlar yaşlı hastalarda en çok % 50 muzdarip. Ayrıca, kapasite iyileşmek ve doku ameliyattan sonra yeniden yaşla azalır ve kırık tamir ve hatta kemik Tümleştirme implantları kalitesini etkileyebilir. Böylece, bu yaş bağımlı değişiklikleri sürücü mekanizmaları daha iyi bir anlayış gibi komplikasyon riskini en aza indirmek ve sonuçları optimize etmek için stratejik hedefleri sağlayabilir. Burada, tibial kırık bir klinik fare modeli tanıtmak. Bu fareler ameliyat sonrası değişimler bazı insanlarda rutin ortopedik ameliyat sonrası sık gözlenen bilişsel bozuklukları taklit. Kısaca, bir kesi kesinlikle aseptik koşullar altında doğru arka bacak içinde gerçekleştirilir. Kasları üretebilir ve 0,38 mm paslanmaz çelik PIN intramedüller kanal içinde Tibia üst kret eklenir. Osteotomi sonra gerçekleştirilir ve yara zımbalanır. Ameliyat sonrası neuroinflammation ve davranış değişiklikleri cerrahi travmanın etkileri araştırmak için bu modeli kullandık. Parabiosis, hangi 2 fareler anastomosed, cerrahi bir model ile birlikte bu kırık model uygulayarak hücreleri ve sistemik organ fonksiyon ve doku yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra yaralanma gençleştirmek salgılanan faktörler inceledik. Adım adım bizim protokol sonrası, bu modeller yüksek sadakat ile çoğaltılamaz ve cerrahi travma tarafından değiştirilmiş birçok biyolojik yollar sorguya çekmek için adapte edilebilir.

Giriş

Cerrahi Tıp sağlık sistemi dönüştürüldü ve kupür kenar teknoloji, gelişmiş güvenlik, sürekli olarak katkıda bulunmaktadır ve yaşam kalitesi saklanır. Ne yazık ki, ameliyat da yara enfeksiyonları, nörolojik bozukluklar ve hatta ölüm, özellikle yaşlı hastalarda1,2' gibi Postoperatif komplikasyonlara yol açabilir Etyopatogenezi yanıt neden olmaktadır. Ortopedik cerrahi düzenli olarak, yaşam kalitesini artırmak ve yaygın kemik kırıklarının onarmak için özellikle büyük erişkinlerde, yapılan. Ancak, 65 yaş ve ameliyat sonrası deliryum gibi büyük deneyim nörolojik bozuklukları ortopedik cerrahi hastaların % 50. Bu sürekli artış, 6 ay, kalıcı fonksiyonel düşüş, kötü prognoz, Yani, ölüm 5-fold riski ile ilişkilendirir süresinin her hastanede kalış hasta, artan uzunluğu ve Huzurevi yerleşim daha yüksek oranda Hemşirelik 3 , 4 , 5. ileri yaş, dahil olmak üzere bazı risk faktörleri tespit edilmiştir, ama az bilinen nörolojik güçlükleri için sorumlu mekanizmaları hakkında ameliyattan sonra.

Kırıkları Yaşlılarda çok yaygın olduğundan, ameliyat sonrası iyileşme ile neuroinflammation ve Beyin Sağlığı (bilişsel işlev)6, de dahil olmak üzere, periferik travmanın etkisini belirlemek için tibial kırık bir fare modeli kurduk 7. bu model aslında Harry vd tarafından açıklanan, 8, intramedüller sabitleme ve genel anestezi ve analjezi altında tibial kırığı oluşur ve böylece cilt yaralanma, kas travma, taklit eder ve kemik ortak uzun kemik kırığı ile ilişkili onarmak ve insanlarda onarım. Bu işlemden sonra fareler inflamatuar işaretleri benzer insanlar9,10, hem de mikroglial harekete geçirmek tanımlayıcı bellekte açıkları ile ilişkili olan Hipokampus içinde gözlenen değişiklikleri değişiklikleri göstermek ve Hipokampal nöroplastisite6,7,11. Bu kırık model daha önce parabiosis ile birleştirdik. Parabiosis içinde 2 fareler anastomosed ve böylece bir dolaşım sistemi paylaşmak cerrahi bir modeldir. Bu model hücreleri ve humoral faktörler organ işlev bağlamında,12,13,14yaş ve hastalık üzerinde dolaşan düzenleyici etkileri anlayış bir atılım sağlamıştır. Bu yaklaşımı kullanarak son zamanlarda şifa12yaş bağımlı kırığı ile ilişkili sistemik faktörler keşfettik.

Burada, parabiosis rejeneratif tıp ve neuroimmunology ilgili kemik beyin yaş bağımlı mekanizmaları incelemek için tibial kırık modeli birleştiren bir iletişim kuralı tanıtmak. İletişim kuralı 1A parabiosis yordam ve protokol 1B ayrıntıları tibial kırık yordam (şekil 1A) açıklar. Bunlar tek başına veya birlikte, sorgulama niteliğine bağlı olarak gerçekleştirilebilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri bakım ve kullanım laboratuvar hayvanlarının Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri uygun olarak yürütülen ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Duke Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. deneysel hayvan

  1. Fareler 12-h açık/koyu döngüleri ve uygun erişimi olan klimalı bir ortamda standart gıda ve su tutun. Kafes başına en fazla 5 littermates ev ve mücadele teşvik durumlardan kaçınmak.
  2. Kadın C57BL6/J fareler 3 ay-in yaş (genç) veya 18 ay-in yaş (eski) kullanın.
  3. Parabiosis için en az iki hafta önce ameliyat için birlikte 2 fareler alışmana. Fareler vahşi tipli C57BL6/J ya da eGFP + değildir.
  4. Vücut Sağlığı ve genel görünümünü fareler her gün kontrol edin.

2. ameliyat öncesi Kur Parabiosis ve ortopedik cerrahi için

  1. 2 fareler tartın.
  2. Genel anestezi 0,2 M/dak kullanımı % 5 isoflurane indüksiyon bir indüksiyon odasında için bir sabit O2 akış hızı bir anestezi sistemi üzerinden yönetmek.
    Not: Anestezi derinliği bir ayak çimdik kullanarak teyit edilmesi.
  3. Sırtüstü pozisyonda bir ısıtmalı bir yastık üzerinde fareyi yerleştirin. Bir rektal sonda vücut ısısı cerrahi işlem boyunca izlemek için kullanın.
  4. Anestezi korumak için isoflurane %2.0 0,2 L/dak bir sağlamlılık aracılığıyla inhale konsantrasyonu düşük. Yeterli anestezi derinliği sağlamak için izleyin.
  5. (Non-invaziv bir nabız oksimetre (isteğe bağlı)kullanarak solunum hızı, oksijen doygunluğu ve kalp beat) fizyolojik parametrelerini izlemek.

3. parabiosis ameliyatı (iletişim kuralı 1A)

  1. Analjezi yönetmek (buprenorfin, SR/yavaş serbest bırakmak, 0.1 mg/kg subkutan) indüksiyon sonra cerrahi işleme önce. Bupivacaine (%0.25), yanları açmadan önce enjekte et. Göz yağ uygulayın.
    Not: Parabiosis Protokolü tibial kırık bağımsız olarak gerçekleştirilebilir.
  2. Dikiş tüm iç vücut için 4-0 polydioxanone suture maddi kullanın. Tüm dış dikiş için 4-0 polipropilen sütür malzeme kullanın.
  3. Her bir dirsek, yan tarafı ve diz birleştirilecek olan tarafında bitişik bir çizgi boyunca 2 fareler tıraş. İyot ile dezenfekte + % 70 alkol cilt üzerinde döngüleri kesi hazırlığında alternatif 3 fırçalayın.
    Steril bir alanı korumak ve autoclaved aletler kullanılır.
    Not: yer vahşi tipi fare sağ tarafındaki eGFP fare ve vahşi tipi fare sol kanat ve eGFP fareyi sağ kanadı (şekil 1) ameliyat için hazırlayın.
  4. Her fare, makas boyunca sadece proksimal dirseğe ve deri altındaki kas bozmadan diz proksimal değişen kanat, bir cilt kesi yapmak için kullanın.
  5. 2 kesintiye uğramış dikiş hayvanlarla triceps katılın.
  6. Yanları ile çalışan, sürekli dikiş in 7-9 yolcu vücut duvarlarda katılın.
  7. 2 kesintiye uğramış dikiş hayvanla kuadriseps katılın.
  8. Kesintiye uğramış dikiş ile 2 parabionts cilt kapatın.
  9. Ortam havası uyanmaya fareler sağlar.
  10. Bu protokol başarılı olmasını sağlamak için çiftleri sağlığını muhafaza edilmesi: izlemek belgili tanımlık çift her gün; Vücut sağlığı haftada puanlama gerçekleştirmek; ve çiftleri haftada tartın.
    Not: Her çifti tek tek yer alır.
    Not: düzenli buprenorfin (yani değil SR/yavaş serbest bırakmak) kullanarak, sonra 3 gün boyunca günde iki kez fare başına tuz 1 mL subkutan 0.1 mg/kg yönetmek.
  11. 4 hafta tibial kırık ameliyat Eğer parabionts arasında paylaşılan dolaşımını sağlamak için kurtarma zaman tanıyın.

4. tibial kırığı ameliyatı (iletişim kuralı 1B)

  1. Analjezi yönetmek (buprenorfin, 0.1 mg/kg subkutan) indüksiyon sonra cerrahi işleme önce. Açılıştan önce diz proksimal cerrahi sitesinde Bupivacaine (% 0,25) enjekte. Göz yağ uygulayın.
  2. Cerrahi alan ortaya çıkarmak için fare sağ hind uzuv medial yönünü tıraş ve iyot + % 70 alkol deri bodur ile üzerinde döngüleri alternatif 3 dezenfekte. Steril cerrahi alan prosedürü boyunca korumak. Kirlenme sınırlamak için; autoclaved aletleri ve eldiven kullanın; (isteğe bağlı); diseksiyon mikroskop altında ameliyat tamamlamak ve vücut ısısını korumak için bir Isıtma yastığı kullanın.
    Not: protokol üzerinde parabionts gerçekleştirilirse, sadece 1 fare çifti (sağ fare sağ tibia) kırılmış. Şekil 1B parabionts kırık bir şematik diyagramı için bkz:.
  3. Makas, sağ arka bacak boyunca orta boy bir cilt kesi proksimal tibia midshaft aşağı diz için üzerinde farenin sağ olun
  4. Tibia midshaft açığa ve görsel olarak diaphysis bulun. Flex diz ve diz kapağı-femoral bağ bir dönüm noktası kullanarak tibial Plato görselleştirmek.
  5. Patellar tendon görselleştirmek; el başparmak ve işaret parmağı bir 0,5 mm delik 25 lik bir iğne kullanılarak intramedüller kanala haddeleme tarafından matkap.
    Not: Açılmış delik olarak tibial Plato tibia paralel çalışır.
  6. Kadar direnç hissetti ve floş bir Tel makası kullanarak tibial Plato ile kesilmiş bir 0,38 mm paslanmaz çelik iğne 15 mm delikten medüller boşluğa yerleştirmek (bkz. 3D bir yeniden yapılanma için ek Video 1 ).
  7. Düz Bonn makas kullanırken, tibia midshaft (diaphysis) kırık. Şekil 1 c bkz: kırık bir şematik diyagramı için.
  8. Görsel olarak incelemek için kırık görme istikrar için bitişik doku ve kırık site gözlemlemek.
  9. Dermal zımba ile kapatın.
  10. Fareler için temiz ev bir kafes dönmeden önce kurtarmak için ısıtmalı yastıkları üzerine yerleştirin. 1 prewarmed mL (37 ° C) normal salin subkutan sıvı değişimi için her fare enjekte.
  11. Fareler topallık, enfeksiyon ya da kanama belirtisi için her gün kontrol edin.
    Not: normal buprenorfin (yani değil SR/yavaş serbest bırakmak) kullanarak, sonra 3 gün boyunca 0.1 mg/kg 1 mL serum fizyolojik günlük subkutan olarak yönetmek.

Sonuçlar

Enine osteotomiler dikkatle pimleri ve uygun dikiş sürekli ekleme ile steril koşullar altında gerçekleştirilen sonra fareler topallık, enfeksiyon veya sol bacağından ameliyat sonrası kanama belirtisi gösterdi. Ortopedik şifa değerlendirildi radyografik analizi ve Histomorfometri Safranin-O sonra kullanarak boyama (Şekil 2). Metakorpal kırık tibiae ilerlemenin daha fazla doku birikimi kırık Nasır ın genç farelerde kırık Nasır yaşlı farelerin belirtti. Kırık Nasır decalcified ve parafin histolojik analiz için hazırlık içinde gömülü. Bölümler Safranin-O ile lekeli ve doku birikimi Histomorfometri analizi ile sayısal. Kırık Nasır genç farelerin daha fazla kemik ve kırık Nasır yaşlı fareler üzerinden daha az fibrotik doku içinde.

Tibial kırık sistemik ve merkezi iltihap6,7,11,15,16neden olmaktadır. Nitekim, pro-inflamatuar sitokinlerin ve moleküler desen (DAMPs) tehlike ilişkili çevresel düzeyleri hızla fareler ve insanlar7,17,18ikisinde ortopedik ameliyat sonrası yüksek. Bu mikroglial hücreleri humoral, hücresel ve nöronal yolları7,15,19,20içeren çeşitli sinyal mekanizmalar yoluyla beyindeki aktivasyonu için katkıda bulunur, 21. Cerrahi, endotel disfonksiyonu, kan - beyin bariyerini açılış ve periferik makrofaj infiltrasyon katkıda bulunmak vahşi-tipleri ve Ccr2 akut Hipokampal neuroinflammationRFP / + Cx3cr1GFP / + yetişkin fareler15 , 19ve insan deliryum ve ameliyat sonrası bilişsel işlev bozukluğu15,19,22benzer sonraki bellek açıkları ile ilişkili bulunmuştur. IBA-1 immunostaining (şekil 3) tarafından tespit olarak bu neuroinflammatory yanıt mikroglial Morfoloji, önemli değişiklikler ile yaşlı hayvanlarda arttığını olduğunu.

Burada açıklanan tibial kırık modeli kullanarak, Ayrıca geçici Engelli Hipokampal neurogenesis, doublecortin (DCX) immunostaining dentat gyrus20azalma kanıtladığı gibi bulduk. Uzun vadeli kullanılmasının muhtemelen (LTP), Hafıza fonksiyonu için bir vekil electrophysiologic ölçümleri ortaya nöroplastisite zamana bağımlı bozulma postoperatively11. Fareler ameliyat sonrası da örnek davranış değerlendirme (şekil 4) Klima korku kullanarak bağımlı Hipokampal bellek işlevinde bozuklukları görüntüler. Korku Klima fareler bir odaya yerleştirilir ve bir işitsel işaret tarafından bir caydırıcı uyarıcı (örneğin, footshock) takip maruz. Tibial ameliyat sonrası üç gün fareler klima odasında bu sefer herhangi bir işitsel ya da itici stimülasyon olmadan test edilir ve davranış buz gibi bir dizinin (için bir detaylı iletişim kuralı bkz:23) bellek olarak kaydedilir.

İleri yaş bellek düşüş için önemli bir risk faktörü olduğunu. Biz yaş olarak, bu mekanizmalar kötü anlaşılır kalır, ancak henüz, doku onarımı ve yenilenme için kapasitesi de azalır. Bu sayede heterochronic parabiosis (genç/yaşlı hayvan eşleştirme) gerçekleştirmek için burada açıklanan protokollerin kullanılacağını ve yaşlı fare (için detaylı parabiosis Protokolü Bkz:24) içinde şifa kırık değerlendirildi. Kan parabiotic çiftleri arasındaki paylaşımı doğruladı ve eşit12bulundu. Bir genç dolaşım gelişmiş kemik onarımı önceki Birliği ile maruz kemik birikimi artar ve fibrozis (şekil 5)12azalmıştır. Bu gençleşme kemik rejenerasyon endojen osteokalsin pozitif dokusunu (şekil 5, kahverengi hücreleri) bağımsız oluştu ama oldukça genç parabiont (şekil 5, mavi hücreler) göç CD45 pozitif hücreler dayanıyordu . Bu sonuçlar CD45 pozitif hematopoetik hücreler daha aktif olmak için onları ikna yaşlı osteoblastik hücrelerin sinyal yapabiliyor bir genç ve sağlıklı niş salgılar gösterir.

figure-results-4731
Şekil 1: parabiosis ve tibial kırığı ameliyatı şematik gösterimi. (A)zaman çizelgesi parabiosis ve tibial kırığı (iletişim kuralı 1A) veya tibial kırık yalnız (iletişim kuralı 1B) gerçekleştirmek için. (B) Tibiae isochronic veya heterochronic parabiotic çiftler halinde 20 aylık farelerin kırılmış (sağ fare sağ bacak kırılmış, bir X ile gösterilen). Yeşil fareler eGFP fareler tasvir ederken gri fareler wildtype fareler tasvir. (C) tibial kırığı intramedüller sabitleme ve orta şaft kırılma modeliyle şematik diyagramı. Ayrıca ek Video 1 hind uzuv 3D inşası ve tibia sabitleme için bkz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-5717
Şekil 2: genç ve yaşlı fare modelleri içinde şifa Tibial kırık. Genç ya da yaşlı farelerin tibiae kırılmış ve kırık Nasır incelenen 21 gün sonrası yaralanma vardı. (A)radyografik görüntüleme ve histolojik (Safranin-O) Boyama kırık Nasır 21 gün sonrası kırık değerlendirmek için kullanılmıştır. Boyama kolajen doku mavi ve kırmızı Proteoglikanlar (kıkırdak içinde bulunan) gösterir. Kesikli çizgiler kırık Kallus yaklaşık konumunu gösterir. (B) Histomorfometri kemik, kıkırdak ve kırık Kallus 21 gün sonrası çatlak içinde yatırılır fibrotik doku miktarını değerlendirmek için kullanıldı. Veri ifade ± % 95 güven aralıkları, demek gibi * P < 0,05, istatistiksel olarak anlamlı (tek yönlü ANOVA, Dunnett'ın test), ölçek çubukları temsil 2 mm ve görüntüleri elde kullanma mikroskop, 1,25 x amaç. n = 9 her örnek için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-6898
Şekil 3: cerrahi indüklenen yaş bağımlı mikroglial harekete geçirmek oluşur içinde. Tibial kırığı ameliyatı yaşlı fareler (aylık 20) 4 aylık C57BL6/J farelere göre daha fazla Hipokampal neuroinflammation neden olmaktadır. Beyin-bölüm mikroglial marker IBA-1 ile boyama hücreleri ve morfolojik değişiklikler cerrahi ameliyat sonrası 24 h gruplar daha olumlu gösterir. 100 x büyütme ile bir epifluorescent mikroskobu ile elde edilen görüntüler.; Ölçek çubuğu temsil eden 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-7703
Şekil 4: Engelli neurogenesis, uzun vadeli kullanılmasının muhtemelen ve hafıza fonksiyonu tibial kırık ameliyattan sonra. (A)DCX, neurogenesis, nicel bir marker önemli ölçüde azalır Hipokampus dentat gyrus 24 h içinde ameliyattan sonra. Görüntüleri ile bir confocal lazer tarama mikroskop objektif 10 x büyütme ile elde edilmiştir; temsil 10 µm. (B) Elektrofizyoloji Hipokampal dilimleri denetimleri veya fareler 24 saat içinde ameliyat sonrası çap. Uzun vadeli kullanılmasının muhtemelen (LTP) yüksek frekans stimülasyon (HFS) tarafından indüklenen ve 1 h. kaydedilen alan eksitatör postsinaptik potansiyeller (fEPSPs) düzenli ile dolu bir hücre dışı kayıt pipet kullanarak CA1 stratum radiatum üzerinden kaydedildi yapay serebrospinal sıvı. Ameliyat sonrası 24 h LTP indüksiyon son derece kontrol fare ile karşılaştırıldığında azalır. Verileri ortalama ± s.e.m. n ifade edilen = 3, * p < 0,05 1 yönlü ANOVA. (C) Hippocampal bağlı Hafıza fonksiyonu (% izleme kullanma buz gibi ' tanımlanan Klima korku) farelerde kontrollere göre cerrahi ve anestezi için sadece maruz hayvanlar sonra Engelli. Verileri ortalama ± s.e.m. n ifade edilen = 9-10, * p < 0,05 1 yönlü ANOVA. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-9272
Şekil 5: Parabiosis cerrahi yol açar kırık şifa, kan paylaşımı ve donör hücreli engraftment gençleştirme için. Isochronic ve heterochronic parabiosis eşlendirme kuruldu ve her çift yaşlı fare kırılmış ve kemik iyileşmesi için değerlendirildi. (A)kırık Nasır soruşturma radyografik Imaging'i kullanma. Kesikli çizgiler kırık Kallus yaklaşık konumunu gösterir. (B) Engraftment eGFP + hücre içinde kemik iliği doğrulandı. (C) immünhistokimya kırık Kallus, eGFP+ donör hücreleri (mavi) ve osteokalsin+ osteoblastik hücrelerin (kahverengi) parabiont tanımlamak için kullanıldı. Ölçek çubukları 50 µm temsil ve görüntüleri bir 40 x hedefi kullanarak elde edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek Video 1: 3D imar hind vücudu ve tibia sabitleme. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Kırıklar ortak bir klinik sorun ve morbidite, özellikle hızla büyüyen üst düzey popülasyonda önde gelen nedenidir. Burada, ameliyat sonrası neuroinflammation ve kognitif bozukluk sorumlu mekanizmaları incelemek için tibial kırık bir fare modeli için adım adım bir protokol tanıtmak. Bu model nöro-bağışıklık etkileşim, doku rejenerasyonu ve sinyal diğer işlemler çalışma için parabiosis ameliyat ile kombine edilebilir. Bu mekanizmalar anlama stratejik hedeflere ameliyat sonrası komplikasyon riskleri en aza indirmek ve sonuçları optimize etmek sağlar.

Ortopedik modelleri çeşitli kemirgenler25kemik tamir eğitim için geliştirilmiştir. Biz kabul ve aslında Harry vd tarafından açıklanan bu tibial kırık yordamı modifiye Ortopedik Cerrahi beyin fonksiyonları üzerindeki etkilerini incelemek için 8. Biz de bu kırık modeli birlikte bizim parabiosis modeli ile kemik iyileşmesi ve yaş bağlı doku rejenerasyonu için sorumlu etkenler araştırmak için kullandık. Geçici genel anestezi altında gerçekleştirildiğinde bu tibial kırık yordam sadece yaklaşık 15dk hayvan, minimal mortalite (bağlı olarak fare ve altta yatan genetik duyarlılıkları yaş) sıfıra sonuçlarında başına gerektirir ve ortak beyannamedir uzun kemik kırığı ve ortopedik cerrahi travma ile ilgili hakaret. Böylece, bu model biyolojik yollar sorguluyor ve boyuna değerlendirmeler yapmak için idealdir. Ancak, bu önemlidir bu osteotomi ve sabitleme tekrarlanabilir ve yumuşak doku hasarı tutarlıdır. Yumuşak doku hasarı, örneğin kapaklarini sıyırma ve ameliyat daha travmatik yapmak çevresindeki kaslar pinching modülasyonlu. Travmatik kırık sabit olmayan künt travma ya da üç nokta bükme tarafından indüklenen modellerinin böyle tutarlılığı ve doğruluğu sağlar değil. Bu yordamları kez uzun süreli inflamatuar yanıt-e doğru yol açar re yaralama, neden. Diğer taraftan, rijit fiksasyonu içeren kırık modellerinde tam ortopedik cerrahi26,27ile ilişkili hasar özetlemek değil daha ılımlı bir iltihap.

Titanyum alaşımlı bağlantılarını kullanarak diğer modelleri yakından kopyalama insan artroplasti için geliştirilmiştir ve protez istikrarsızlık, mekanizmaları ve protez ilişkili komplikasyonlara fareler28,29 sorguya daha alakalı olabilir . Matkap delik modelleri gibi burada anlatılan bir sağlamak yeterli istikrar ve fareler gibi görevler yıkmak önemli açıkları olmadan davranış paradigmalar test edilebilir Klima veya açık alan hareket/6 test anksiyete korku ,7,11,15,19,20. Fiksasyonun düzgün kilitli değilse ancak, rotasyonel deformiteleri oluşabilir. Bazı modellerde üstün istikrar sağlar ancak bir fare uyluk27' başarıyla uygulanabilir, ancak bir fare tibia uygulamak zordur bir eksternal fiksatör kullanın.

Bilişsel bozukluklar, deliryum ve ameliyat sonrası bilişsel işlev bozukluğu, dahil olmak üzere ortak komplikasyonlar kırık tamir, özellikle yaşlı ve zayıf hastalarda30için ortopedik ameliyat sonrası vardır. Bu ameliyat sonrası sistemik sitokin sürüm6,7,17, kan - beyin bariyerini işlev15,19 Engelli tibial kırığı ameliyatı bu klinik fare modeli gösterir ve mikroglial Morfoloji16,22değişmiş, bellek bozukluğu için katkıda bulunmak ve birçok hasta ortopedik ameliyat sonrası görülen nörolojik komplikasyonlar Ģunları kritik özellikleri temsil edebilir. Diğer cerrahi ameliyat sonrası bilişsel işlev bozukluğu farelerde modellemek için kullanılmadığından emin unutmamak gerekir. Bunlar karın31,32,33 ve34 vasküler cerrahi gibi yüzeysel travma35,36içerir. Parabiosis tekniği tüm iltihabı, gliyal harekete geçirmek ve ortak mekanizmaları tarafından aracılı davranış açıkları, dahil olmak üzere benzer bitiş noktaları paylaşmak bu modelleri için geçerlidir.

Parabiosis içeren çalışmalar bilişsel işlev, neuroinflammation ve Doku gençleştirme yaşlı hayvanlar37,38,39,40'etkileyebilir dolaşımdaki faktörleri için yeni roller indirdik ,41,42. Biz o parabiosis başarıyla rejeneratif yolları sorgulayacak ve12onarım etkisi şifa ve kırık kan kaynaklı faktörler içeren mekanizmaları incelemek için burada açıklanan tibial kırık modeli ile kombine edilebilir göstermiştir. Burada, biz yaşlı hayvan kırık-onarım kapasitesi yaşlı hayvan için genç bir hayvan anastomosed gençleşmek gösterdi. Bu ters çağın kırık sitesinde hematopoetik hücrelerin engraftment köklü. İlginçtir, bu tür gençleşme da yaşlı fareler içine genç kemik iliği nakli yoluyla elde edilebilir. Bu bağlamda, kemik iliği nakli parabiosis bir daha doğrudan ve basit alternatif yaklaşım olarak kabul edilebilir. Ancak, parabiosis hücreleri ve faktörler dolaşan işlevi araştırma için daha sağlam bir modeldir. Biz parabiosis ve ortopedik cerrahi modelleri bir arada perioperatif bakım ve yaşlanma Biyoloji kritik sorulara cevap önemli bir rol oynayacak bekliyoruz.

Özetle, biz ameliyat sonrası neuroinflammation ve ortopedik cerrahi işlemler sonra bilişsel bozulma sorumlu mekanizmaları incelemek için tibial kırık bir fare modeli için adım adım bir protokol tanıtmak. Bu model nöro-bağışıklık etkileşim, doku rejenerasyonu ve diğer yolları çalışmaya parabiosis yordam ile kombine edilebilir. Bu mekanizmalar tanımlama stratejik hedeflere ameliyat sonrası komplikasyon riskleri en aza indirmek ve sonuçları optimize etmek sağlar.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Kathy Gage, BS (anestezi bölümü, Duke Üniversitesi Tıp Merkezi, Durham, NC) Editör Yardım için teşekkür ederiz. NT Duke Anesteziyoloji ve NIH/NIA R01 AG057525-01 bir rüya yenilik hibe desteğinden kabul eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
IsofluranePiramal HealthcareNDC 66794-017-25Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used
BuprenorphineReckitt-Benckiser PharmaceuticalsNDC 12496- 6757-1Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations
EthanolFisher Scientific04-355-45170% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning
10% povidone IodineDynarexFor antiseptic treatment of skin
SomnoSuiteKent ScientificSS-01Low Flow  Anesthesia system
MouseSTATKent ScientificPS1161Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor
ShaverWahl9854L
StereomicroscopeLeicaMZ6
Scalpel HandleFine science tools10003-12
Scalpel Blades - #11Fine science tools10011-00
Adson ForcepsFine science tools11006-12Needed for stripping the periosteum
Iris ForcepsFine science tools11066-07Useful (1x2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma
Bonn Scissors (Straight)Fine science tools14084-08Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt
Fine ScissorsFine science tools14058-09Sharp scissors for cutting sutures
22G x 3.5 In Quincke  Spinal NeedleBD405181Use inner rod for pinning
Needle HoldersFine science tools12001-13
SutureLook1079B
C57BL6/JJackson Laboratory stock no. 000664
eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously)Jackson Laboratory stock no. 003291

Referanslar

  1. Terrando, N., et al. Perioperative cognitive decline in the aging population. Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).
  2. Lord, J. M., et al. The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment. Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).
  3. Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S. Delirium in elderly people. Lancet. 383 (9920), 911-922 (2014).
  4. Han, J. H., et al. Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months. Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).
  5. Marcantonio, E. R., Flacker, J. M., Wright, R. J., Resnick, N. M. Reducing delirium after hip fracture: a randomized trial. J Am Geriatr Soc. 49 (5), 516-522 (2001).
  6. Cibelli, M., et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 68 (3), 360-368 (2010).
  7. Terrando, N., et al. Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20518-20522 (2010).
  8. Harry, L. E., et al. Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model. J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).
  9. Hirsch, J., et al. Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery. J Neuroinflammation. 13 (1), 211(2016).
  10. Neerland, B. E., et al. Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture. J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).
  11. Terrando, N., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline. FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).
  12. Baht, G. S., et al. Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin. Nat Commun. 6, 7131(2015).
  13. Brack, A. S., et al. Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis. Science. 317 (5839), 807-810 (2007).
  14. Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90(2011).
  15. Terrando, N., et al. Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline. Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).
  16. Terrando, N., et al. Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice. Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).
  17. Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages. Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).
  18. Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).
  19. Degos, V., et al. Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction. Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).
  20. Zhang, M. D., et al. Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).
  21. Lu, S. M., et al. S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway. Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).
  22. Feng, X., et al. Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice. JCI Insight. 2 (7), e91229(2017).
  23. Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. Trace fear conditioning in mice. J Vis Exp. (85), (2014).
  24. Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
  25. Ning, B., et al. Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review). Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).
  26. Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D. Fracture healing: the diamond concept. Injury. 38, Suppl 4. S3-S6 (2007).
  27. Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
  28. Yang, S. Y., et al. Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening. J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).
  29. Zhang, T., et al. The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure. Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).
  30. AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults. J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).
  31. Li, Y., et al. Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction. J Neuroinflammation. 13 (1), 268(2016).
  32. Tang, J. X., et al. Modulation of murine Alzheimer pathogenesis and behavior by surgery. Ann Surg. 257 (3), 439-448 (2013).
  33. Ren, Q., et al. Surgery plus anesthesia induces loss of attention in mice. Front Cell Neurosci. 9, 346(2015).
  34. Fan, D., Li, J., Zheng, B., Hua, L., Zuo, Z. Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment of Learning, Memory, and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression. Mol Neurobiol. 53 (1), 344-354 (2016).
  35. Rosczyk, H. A., Sparkman, N. L., Johnson, R. W. Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery. Exp Gerontol. 43 (9), 840-846 (2008).
  36. Zhang, X., et al. Surgical incision-induced nociception causes cognitive impairment and reduction in synaptic NMDA receptor 2B in mice. J Neurosci. 33 (45), 17737-17748 (2013).
  37. Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90-94 (2011).
  38. Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med. 20 (6), 659-663 (2014).
  39. Smith, L. K., et al. beta2-microglobulin is a systemic pro-aging factor that impairs cognitive function and neurogenesis. Nat Med. 21 (8), 932-937 (2015).
  40. Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
  41. Sinha, M., et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle. Science. 344 (6184), 649-652 (2014).
  42. Castellano, J. M., et al. Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice. Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

la sorunu 132ya lanmadavransitokinlerdeliryumifafare modelineuroinflammationortopediparabiosisameliyat sonras bili sel i lev bozuklu urejenerasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır