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要約

ここでは、従来のタバコの煙、電子たばこエアロゾルの抽出物を作成するためのプログラマブル試験装置について述べる。このメソッドは、従来のタバコと電子タバコの間の直接比較を行うための便利なツールを提供し、電子タバコ研究へアクセスできるエントリ ポイントです。

要約

電子タバコ中、高校生の間で最も人気のあるタバコ製品、大人の間で最も人気のある代替タバコ製品。高品質の電子タバコの使用の結果に再現性のある研究は公衆衛生の懸念を新興国や証拠をクラフト基づく規制政策の理解に不可欠です。論文数の成長は、電子タバコを議論しながら少し一貫性にあるメソッド グループ、結果にほとんどコンセンサス。ここでは、従来のタバコの煙、電子たばこエアロゾルの抽出物を作成するためのプログラマブル試験装置について述べる。このプロトコルのアセンブリおよび当該装置の操作のための指示の詳細し、2 つのサンプル アプリケーションで生成された抽出物の使用方法を示します:体外セル実行可能性の試金およびガスクロマトグラフィー質量分析法。このメソッドは、従来のタバコと電子タバコの間の直接比較を行うためのツールを提供し、電子タバコ研究へアクセスできるエントリ ポイントです。

概要

医療機関での集中的な努力にもかかわらずタバコ製品の使用タバコ喫煙1に帰因するこれらの死の大半の世界、予防可能な死の主要な原因のまま。2003 年に市場に入り、電子タバコは、タバコ製品のユーザーの間で人気の高まっています。現在、電子タバコはアメリカ大人 (~ 5%)2の間で慣習的なタバコ ・中間 (〜 5.3%) と高校生 (~ 16%)3の中で最も人気のあるニコチン配信システムに最も普及した代わりであります。現在の傾向が続けば場合、は、将来の世代のための慣習的なタバコを交換する電子タバコを期待できます。しかし、電子タバコの使用の健康への影響は不明します。

電子タバコの人気が増加 2013年3,4まで電子タバコに関する研究が本格的に開始されませんでした。それ以来、異なるモデルの数は、彼らの毒性の問題に対処するため採用されています。しかし、多くの研究結果が競合していると、電子タバコは、一般的にある慣習的なタバコより毒性が少ないと思える電子タバコの健康影響に関する現在のコンセンサスは5,を使わない6,7. 私たちの以前の研究は、電子タバコが大幅 DNA 損傷と酸化ストレスと細胞死8 の誘導を引き起こす能力にもかかわらず、従来のタバコよりも血管の内皮細胞に毒性を示します.しかしより多くの研究は、電子タバコの使用の健康への影響についての確固たる結論を描くことができます前に必要です。

慣習的なタバコは予防血管疾患9の主要な原因であるとは、電子タバコの血管の健康リスクの関心の高まりは、10、11,12を使用しています。電子タバコの血管系に及ぼす影響を研究するために私たちの研究室は8の作動マイコン喫煙/vaping デバイス (図 1) を開発しました。このデバイスは、水溶液や有機溶剤のいずれか従来のタバコの煙や電子タバコ エアロゾルの液体抽出物の生成が可能です。調節可能なレギュレーター フローと PBASIC タイミングのプログラムの組み合わせによる空気の流れを制御、デバイスが任意の数のユーザー定義のプロトコルによるとエキスを生成するのに使用できます。ここではアセンブリ、2 つの潜在的なアプリケーションと同様に、このデバイスの操作詳細:体外細胞生存率評価とガスクロマトグラフィー質量分析法。

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図 1: 喫煙/Vaping デバイス。たばこ/たばこ電子タバコ (電子セエグ) 構成 (A) のようなタンク電子タバコ構成 (B) で喫煙/vaping デバイスの物理的な組み立ての模式図。コンポーネント キー: 1) 吸入ポート;2) プライマリ コレクション インピン;3) オーバーフロー インピン;4) Buchner フラスコ真空トラップ5) 通常開電磁弁;6) BS1 マイクロ コント ローラー;7) 空気流量制御;8) 510 電子タバコ戦車ベースのスレッド。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

プロトコル

1. デバイスの組立

  1. Buchner フラスコ (図 1#4) 鋼のリングに立つし、乾燥剤として塩化カルシウムの 50 g でそれを充填して真空トラップを作成 100 mL を保護します。ゴム貫通穴栓付けフラスコを密封、パラフィン フィルムとストッパーの接合部をラップし、スルーホール ピペットを実行します。
  2. ビニール チューブを使用すると、t 字路のホース コネクタ ストッパーから延びるピペットを接続します。
  3. ビニール チューブを使用すると、互いに 2 つインピン (図 1#2 & #3) を接続し、2 番目のインピンの出力を t 字のホース コネクタに接続します。
  4. ビニール チューブを使用して、吸入ポート (図 1#1) として最初のインピンの入力ポートに接続します。
  5. ビニール チューブを使用して空気レギュレータ (図 1#7) の入力ポートに Buchner フラスコのサイドアームを接続し、真空ポンプに空気レギュレータの出口ポート。
  6. 図 2 aの回路図によると回路を組み立てます。
  7. シリアル アダプターと製造元のソフトウェアを使って BS1 マイクロ コント ローラー (図 1#6) に PBASIC プログラム SVL.bs1 (図 2 b、また https://github.com/ChastainAnderson/SVL で入手可能) をアップロードします。
  8. リングの場所、510 スレッド ベース (図 1 #8) スタンド クランプです。
  9. ビニール チューブを使用すると、t 字路のホース コネクタの自由端にソレノイド バルブ (図 1#5) に接続します。
    注: デバイスする必要があります完全な操作の準備ができて、タイトな空気が、ホースク ランプおよび必要に応じて真空グリースを適用ことを確認するすべての関節をチェックします。

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図 2: 電気回路図と PBASIC コード。図 2 aは両方通常開電磁弁をアクティブ化に必要な電気回路を組み立てるための電気回路図を表示し、ボタンの加熱コイルは、電子タバコを活性化 (、510 をスレッド電子タバコ タンク基本)。加熱コイル (p: 電源の電気的パラメーターR: 抵抗;i: 電流) 投影され、デジタルマルチメータ ポスト アセンブリを実証する必要があります。図 2 bには、図 2 a (https://github.com/ChastainAnderson/SVL も入手可能) に回路を制御するために必要な PBASIC タイミングのプログラムが表示されます。SVT ・ IPT (#5 & #6) タイミング定数は、ms の単位と活性化時間は 2 秒と 28 のダウンタイムを提供するために設定されて s.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

2. サンプルの調製及び保存

  1. 室温で気密のポリ袋で暗闇の中ですべて未開封従来と電子タバコのサンプルを格納します。
  2. 開くと、余分な水分を吸収する紙タオルで 4 ° C で、気密のポリ袋でサンプルを格納します。
  3. 前 ~ 60% 湿度室温ヒュミドールのすべてのサンプルを平衡させ、使用前に少なくとも 30 分間。

3. 一般的なタバコ煙/電子タバコ エアロゾル抽出装置の操作

  1. 各電子タバコ cartomizer/タンク前-vaping 分析用天秤を使用して量を決定します。プレ/ポスト ポスト vaping 重量の差は、適切な投与量を決定する使用されます。
    注: 3R4F 参照タバコは、ニコチン 0.7 mg 含まれていると見なされます、商業たばこブランドのニコチン含有量は、従来の分析法13によって定めることが。
  2. サンプル アプリケーション 1 の血管内皮細胞培養培地の 4.3 ml プライマリ インピンの貯水池を入力します。サンプル アプリケーション 2、アセトン 5 mL でタンクを埋めます。
  3. 電子タバコや抽出のためタバコの従来を準備します。
    1. 従来のタバコを使用して、フィルター周りにクリアのテープの一部を適用、シガレット ペーパーがフィルターを結合容易に目に見える印を置きます。
    2. 電子タバコのようなタバコを使用している場合も充電がバッテリーに堅くねじで締まる、cartomizer いることを確認します。
    3. 電子タバコ タンクを使用する場合は、電子タバコの液体の適切な量がタンクに読み込まれているかどうかを確認し、510 スレッド ベースの上にタンクのネジします。
  4. 吸入ポート (図 1#1) に従来または電子タバコの先端を挿入し、ホースをクランプで固定します。
  5. 真空ポンプをオンにします。
  6. プル 1.65 リットル/分 55 mL パフ 2 秒以上を確保するためにフロー メーターを調整します。
  7. マイクロ コント ローラーをオンにします。従来のタバコを使用している場合は、最初のパフにタバコを点灯します。
  8. 投影まで実行希望濃度 (百万または % 単位で重量/体積) を実現します。
  9. 分析用天秤を使用して蒸発後各電子タバコ cartomizer/タンクの質量を決定します。この測定測定は、大量消費の合計を決定するステップ 3.1 の撮影に比較します。溶剤量/消費質量濃度を計算します。製品間の正規化に消費されるニコチンのモル濃度を使用します。
    1. 十分な質量が消費された場合は、デバイスに電子タバコを返すし、さらに消費します。
    2. 十分なまたは余分な固まりが消費された場合は進みます。

4. ろ過とストレージ

  1. エキスの細胞培養に使用する場合は、0.22 μ m ペス シリンジ フィルターを介してフィルターします。
  2. すぐに抽出物を使用または-80 ° C で保存します。アンダーソン、他のための準備の一部として8、電子タバコ エアロゾルを示した、少なくとも 2 週間安定である、タバコの煙まで 2 年間の安定性は、詐欺師、らによって確立されています。13。

5. デバイスのクリーニング

  1. それぞれの抽出後チューブを洗い、70% エタノールと脱イオン水を防ぐためにデバイスの貯水池がサンプル間引き継ぐ。
  2. 次の洗浄、簡単にラインの乾燥を支援するために気流を許可する空のデバイスを実行します。

6. サンプル アプリケーション 1: 中性赤の取り込みセル実行可能性の試金

  1. 内皮細胞成長培地の 4.3 mL に上記のように抽出を実行します。
  2. 1 日前、1 x 10 の4セル/好演内皮細胞成長培地の 100 μ L の密度の 96 ウェル プレートにひと臍帯静脈内皮細胞をシードします。
  3. コントロールとして機能する新鮮な内皮細胞培地のいずれかの 100 μ L または 75 μ L 消費 2 mM ニコチン濃度エキス (1.4 mg を 25 μ l 添加混合内皮細胞成長培地の古い血管内皮細胞の培養液に置き換えてセルを扱う4.3 mL 内皮細胞成長培地にニコチンを消費) 治療として 500 μ M の最終的な集中に。
  4. 両方のタバコの煙、電子たばこエアロゾルのコンポーネントの多くは揮発性、井戸の気密を保つために箔シールを使用します。
  5. インキュベート プレート 18-24 h 37 ° C および 5% の CO2。
  6. ニュートラルレッド染色液を準備します。
    1. バッファー内の塩溶液 10 mL に中立赤の染料 33 mg を溶解して 100 x 中性赤ストック溶液を作成します。
    2. 直前の使用、ニュートラルレッド染色液 x 1 を作成する細胞培養液の原液を 1: 100 x 100 を希釈します。
    3. ニュートラルレッド染色の使用、および使用する前に、少なくとも 30 分の 37 ° C で液をすぐに孵化させなさい。
      メモ: それは潜伏時に析出する結晶の正常です。細胞文化の井戸にこれらの結晶を適用しないようにするには、注意が必要です。必要な場合は、中立赤在庫および染色ソリューションをフィルター処理する.22 μ m フィルターを使用できます。
  7. 抽出を削除し、ニュートラルレッド染色液適切な定量化のための少なくとも 3 つの空井戸を作成するまあ、超過分の使用あたりの 100 μ L を追加します。
  8. 37 ° C、5% CO2で 2-4 h でプレートを孵化させなさい。
  9. ニュートラルレッド染色液を削除し、PBS の水没で 3 x を洗ってください。
  10. 中立的な赤を適用解除ソリューション (50% 脱イオン水、49% エタノール, 1% 酢酸) を染色します。
  11. 揺れで部屋の温度で、少なくとも 10 分間、インキュベートします。
  12. 540 で吸光度を読み nm。
  13. データを分析するには、空白の井戸の平均値を引き算すること、空白の調整コントロールよく価値の平均を正規化します。

7. サンプル アプリケーション 2: ガスクロマトグラフィー質量分析法

  1. 上記としてアセトン 5 mL に抽出を実行します。
  2. 1 ~ 100 の部品の最終的な集中を達成するためにデバイスを実行百万 (e-液体消費/アセトンの量量の重量) サンプルの。
  3. 高精度ガラス製注射器を使用すると、1 μ L を GC-MS によるデバイスのインジェクターに注入します。250 ° C で、1:20 次のオーブン プロトコルで ZB 5 列の結合ガスクロマト/四重極分光システム分割比率注入: 50 ° C で 1 分ランプを 10 ° C/分 140 ° c;300 ° C まで 20 ° C/分と 10 分間保持します。
  4. エアロゾル成分を識別するために対象のライブラリに結果として得られる質量スペクトルに一致します。

結果

ひと臍帯静脈の露出の 24 時間以内に従来のタバコの煙のエキス (CSE) または電子タバコ エアロゾルに内皮細胞抽出 (EAE) は重要な (CSE P対コントロール < 0.001; 対 EAE P制御< 0.01;n = 6) セル実行可能性 (図 3 a) の減少。抽出物は、2、2 秒、毎分 55 mL パフの噴き出しプロファイルで生成されて、デバイスによって消費されるニコチンのに基?...

ディスカッション

このプロトコルの最も重要な要素は、デバイスがきれいなスタートを確実とそれぞれの抽出の完了し、確実にすべてのシールが保持されますので空気の流れが一定です。デバイスが適切にクリーンアップされない場合リスクがあるキャリーの上のサンプルの間です。さらに、装置は長時間時間凝縮したエアロゾルの汚れたまま、乾燥溶媒はシステムをブロックできます。注意してください、?...

開示事項

チューレーン大学によって管理されるタバコ製品規制科学研究員プログラムはアルトリア クライアント サービス規制によって資金を供給します。

謝辞

著者はチューレーン大学細胞部と原稿を編集の彼の援助のための分子生物学の博士ロバート dotson さんと彼の援助のため化学のチューレーン大学科の博士ジェームズ ・ ボリンジャーの支援を認める質量分析のプロトコル設計。さらに著者は、チューレーン大学講座細胞・分子生物学化学のチューレーン大学の部門のサポートと空間や設備の使用を認めます。この作品は、チューレーン大学理学と工学から c. アンダーソンにタバコ製品規制科学研究奨学金によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
12 V AC/DC Wall Mount AdaptorDigi-KeyT1099-P5P-ND
2.2 Ohm ResistorsDigi-KeyA105635-NDUsed in tandem to generate the 4.4 Ohm resistance in Figure 2A
330 Ohm ResistorsDigi-Key330QBK-ND
510 Threaded BaseNJoyN/ARecovered by dismantalling a second generation NJoy electronic cigarette
Acetic Acid, GlacialSigma-AldritchA6283
Acetone (Chromatography Grade)Sigma-Aldritch34850
Basic Stamp Project BoardDigi-Key27112-NDThis board contains the BS1 Microcontroller, serial adaptor, power switch, and a barrel pin connector for the AC/DC Wall Mount Adaptor
Basic Stamp USB to Serial AdapterDigi-Key28030-NDAn optional component to allow the BS1 serial adaptor to communicate through USB
Buchner Flask (Vacuum Flask) 250 mLVWR10545-854
Clear Tape3MS-9783
Clear Vinyl Tubing, 3/8" IDWatts443064
EGM-2 Endothelial Cell Culture MediumLonzaCC-3162
EthanolPharmco-Aaper111000200
Flow RegulatorDwyerVFA-23-BV
Gas ChromatographVarian450-GC
Glass Syringe, 10 mLSigma-AldritchZ314552
Glass Syringe, 10 µLHamilton80300
High Vacuum Silicon GreaseDow Corning146355D
Hose ClampPrecision Brand35125
Human Umbilical Vein Endothelial CellsATCCPCS-100-013 
Mass SpectrometerVarian300-MS
Midget ImpingerChemglassCG-1820-01
Neutral RedSigma-AldritchN4638
Paraffin Film3MPM-992
Plate Seal RollerBioRadMSR0001
Plate Seal; FoilThermo276014
Ring Stand 20"American Educational Products7-G15-A
Solenoid Valve (normally open)US SolidUSS2-00081
Solid State RelayDigi-KeyCLA279-ND
Stand ClampEiscoCH0688
Syringe Filter, PES, 0.22 umMilliporeSLGP033RS
Syringe, 10 mLBD Syringe309604
Through Hole Stopper, Size 6VWR59581-287
Vacuum PumpKNF NeubergerN86KTP

参考文献

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