アダルト マウス後根神経節外植体し、解離細胞モデル神経可塑性とウイルス感染を含む環境の侮辱への応答を調査するため

要約

ニューロン-グリア相互作用、神経可塑性、関連付けのメカニズムの広い範囲を調査するこのレポートで切片培養、マウス由来後根神経節細胞の初代培養の解離の利点が強調表示されます。neuroinflammation、およびウイルス感染への応答。

要約

このプロトコルでは、マウス由来の後根神経節 (DRG) 植と体外後根神経節由来培養の解離の感覚ニューロンとグリアの衛星細胞の前のヴィヴォモデルについて説明します。これらは様々 なニューロン-グリア相互作用、神経可塑性に至る末梢神経系 (PNS) の生理学的および病理学的条件に関連する生体の反応を調査するための便利で多機能なモデルです。neuroinflammation、およびウイルス感染。DRG 植の使い方は、複数の理由から単純な単一細胞モデルと比較して科学的に有利です。例えば、として、培養 DRG 植によりすべての神経細胞およびグリア細胞の機能に重要な役割を果たす細胞外微小環境を含む全体の神経ネットワークの転送前のヴィヴォ。さらに、DRG 植も維持できる前のヴィヴォとしてすることができますは、数日と培養条件の希望します。さらに、収穫の DRG がさらの第一次感覚ニューロンと神経細胞とグリア相互作用、神経突起形成、細胞と軸索のコーンの相互作用を調査するため衛星グリア細胞の生体外で共培養に解離することができます。微小環境、そしてより一般的な神経の代謝に関連するあらゆる側面。したがって、DRG 植システムは、多大なコスト効率の高い方法で生物学、生理学、病理学的条件に関連するイベントの広い配列を研究する柔軟性を提供します。

概要

本稿で報告するニューロン-グリアに至る PNS 侮辱に対する生体の応答の広い範囲を調査する保存の組織のような微小環境として派生したマウス後根神経節のモデル システムの切片ex vivoモデルを取得する方法相互作用、神経可塑性、ウイルス感染、炎症のマーカー。さらに、我々 はさらに後根神経節から派生した単一ニューロンと衛星細胞の共培養を作成するプロトコルを開発しました。

DRG は、衛星グレー-問題-単位脊髄神経の背側脊髄神経根に沿って中枢神経系 (CNS) の外側に位置します。DRG、椎間孔、家 pseudounipolar 感覚ニューロンと衛星細胞の近くに位置します。Pseudounipolar ニューロン細胞体へ周辺ターゲットから体性および内臓の入力を運ぶ末梢プロセスと中枢神経系に細胞体から感覚の情報を送信する中央のプロセスに分割単一の神経突起を備えています。結合カプセルを定義し、中枢神経系のニューロンとグリア細胞のこの周辺のクラスターを分離します。ローカルの幹細胞ニッチ、ライフ¹で発生する神経因性のイベントを担当して生後細胞移動したり、DRG からこれまで説明されています。したがって、このモデルは成体、axonogenesis、咬合性外傷、および細胞死^{2,3,4,5,6,7 への応答の研究に特に適して ,8,9} 。

再生に関する分野で体内から採取した DRG と explanted体外axonotmesis を再現、どの軸索が完全に切断された神経細胞の細胞体の損傷状態が神経ターゲット^{10 から切断されました。 ,11}。末梢神経損傷は、DRG の減少と増加の遺伝子発現を引き起こす可能性が、これらの変更の多くは、再生プロセスの結果が免疫応答の非神経細胞から別の応答可能性がありますも多く知られています。前のヴィヴォを使用して孤立した後根神経節で、この複雑さのいくつかのシステムが削除され、生成経路をより簡単に調べることができます。

ほかに中枢神経系の GABA^12,13,14,15神経相馬のレベルを含む多くの神経伝達物質の受容体の豊かさへの感覚入力を伝える上で中心的な役割と同様介在ニューロン間励起の証拠は、DRG が感覚入力^16,17の洗練された予備的インテグレーターであることを提案するかもしれない。これらの新しい発見を与える DRG 植にミニ神経ネットワーク システム神経組織特異オルガノイドの調査のより広範な実験的フィールドの使用は、他の「ミニ脳」モデルと同様治療の特性神経疾患^18,19へのアプローチ。DRG は神経組織に囲まれて結合カプセルの離散と明確に定義されたクラスターであるという事実と共にこれらの証拠はそれ前のヴィヴォ移植のために臓器を作る。

培養マウス後根神経節には、種の間の構造および遺伝の類似のため人間病態生理を持ってモデル化する魅力的な多細胞オプションが表示されます。さらに、トランスジェニック マウス系統の大規模なリポジトリは将来解明に非常に助長します。開発時および損傷後の神経突起の伸展成長円錐形、基板^20,21力学的相互作用が必要です。ナノ-マイクロ パターン基板は、神経突起伸長を指示し、微小の地形に対応する能力を発揮するツールとして使用されています。ニューロンは、生き残るため、付着、移行、および基板^22,23溝などの表面機能を操作する軸索の方向に示されています。しかし、これらの研究は、培養細胞を利用した通常、プライマリ神経細胞の意志を予測することは困難だ明確に定義された、物理的なキュー体内または体外への対応します。

マウス後根神経節この提案の使用の前のヴィヴォ植モデルは、実質細胞間相互作用と成長軸索を取り巻く生化学的手がかりを模倣します。多くの異なった実験パラダイムに至る軸索再生、neurosphere 生産 neuroinflammation、DRG 外植片の間でモデルは引き続き感覚内ウイルス感染と待ち時間の側面を調査するための貴重なツールとして大脳基底核^24,25,26,27。

神経系 (NS) は、一般的にウイルス感染症^28,29,30のターゲットです。ほとんどのウイルスは上皮と内皮細胞表面に感染し、感覚と運動線維末梢神経を介して NS に表面の組織から彼らの方法を作る。単純ヘルペス ウイルス タイプ 1 (HSV-1) 上皮細胞に初期感染は好ましくは、知覚神経節に生涯潜伏を確立後 PNS^31,32の DRG。PNS に感染した HSV-1 neuroptropic 機能は、最終的に神経疾患³³に します。

プロトコル

動物の使用を含むすべての手順は、倫理委員会承認プロトコル (IACUC 中西部大学) によって承認されています。

1. マウス胚から後根神経節の収穫

1. 斬首に続いて窒息法 (CO₂) による成体を安楽死させます。すぐに手術、脊柱を削除に進みます。
   1. 背高級はさみを使用して皮膚の層を切断することによって、脊柱を公開します。列の両側に肋骨と脊柱を動物の残りの部分から分離する仙骨を通して切断することによって、脊柱を分離します。
   2. 針・ ピンを用いた手術マットの上に脊柱 (を腹側) をマウントします。
2. ダブル高級はさみを使用して脊柱管の腹側を公開するため椎体の両側にカット。
3. 手術顕微鏡 (倍率を 4 倍に設定)、[側と対側の背側脊髄根を公開しに末梢神経の後根に沿って、DRG を見つける脊髄をゆっくり移動するのにはさみを使用します。各神経節は部分的に椎間孔内に隠されます。
4. DRG を収穫するには、1 つの鉗子 (脊髄の後根神経節間) 後根をピンチし、椎間孔から DRG をそっと引き出します。
5. DRG に末梢の脊髄神経に 2 番目の鉗子を配置し、脊髄神経と脊髄後根神経節を引きます。
6. 35 mm シャーレ冷たい血清の自由なメディア (SFM) の³⁴の 3 mL を含む収集した DRG を配置します。
7. 乾燥ガラス シャーレにそれぞれ個々 の DRG を転送、手術顕微鏡下できれいし、過剰な線維と結合組織の刃を使用して DRG にまだ接続されているを切り落とします。DRG、白い脊髄神経/ルートに沿って隆起した透明な構造として容易に識別できます。血管は、しばしば周囲の DRG を発見されています。
8. 冷たい SFM メディアを含む新しいペトリ皿に掃除の DRG を配置します。
9. ゼラチンのタンパク質混合物を希薄化 (材料の表を参照してください) 冷たい SFM (1:1) で。
10. 後根神経節前のヴィヴォ12 ウェルのプレートはゼラチン状の蛋白質の混合物の 10/20 μ L でプレコートし、37 ° C、5% CO₂で 30-60 分の孵化器の中それらを設定します。
11. 優しく全体の外植体をカバーし、維持、分化培養条件 (37 ° C、5% CO₂) 培養系に SFM の 1.5-2 mL を追加します。
    注: これは DRG は重合ゼラチン質蛋白質の混合物によってのみガラス皿に固定されているためにの重要なステップです。重合とピペッティング スキルの時は、浮動を回避にとって重要です。
12. すべて 72 h DRG を成長媒体を変更し、限り必要に応じて成長後根神経節を聞かせてください。

2. 単一のセル後根神経節からニューロンの分離

1. 場所すべての DRG IV コラゲナーゼの 1.25 mg/mL を含む F12 メディアの 1.2 mL と 1.5 mL の生殖不能の管に収集し、37 ° C と 5% CO₂ 45 分インキュベートは最初のインキュベーション後別の 45 分のこの手順を繰り返します。
2. 2 ml 37 ° C、5% CO₂でコラゲナーゼ IV 治療後すぐに 30 分のトリプシン (0.025%) を含む F12 メディアの外植体を扱います。
3. 15 分の CO₂を 37 ° C、5% ウシ胎児血清 (FBS; 33%) を含む F12 メディアの 2 mL で孵化させなさい。
4. F12 メディアの 2 mL で 3 回外植体を洗うし、メディアに曇った回るまで機械的にガラス ピペットでそれらを分離するに進みます。
   注: この手順には、きれいにトリミング前のセクションで説明したように動物から後根神経節のコレクションが含まれます。外植片の機械的解離を実行すると、穏やかな、それは流出と作業材料の損失につながることができますので、過度の力を使用しないでください。
5. 任意の不純物や余分な結合組織除去する 0.22 μ m のフィルターを通して解離細胞の培養をフィルターします。遠心分離機のフィルターが適用されたセル (2,500 x g) にて 2 分間。
6. 上澄みを除去し、神経文化 (1 x)、抗生の混合物 (1 x)、L-グルタミン酸 (0.5 mM) のためのサプリメントを含む neurobasal メディアを 500 μ l 添加で細胞ペレットを再懸濁し、神経の成長因子 (5 μ g/mL) (材料の表を参照してください)。
7. 最寄りの細胞密度でラミニン コート カバー スライド (50 μ G/ml; 参照テーブルの材料) 解離細胞をプレートします。細胞カウンターを使用してセル密度を決定します。
   注: 我々 は 25,000 セル/カバー スライドでセルをメッキしました。この手法では、ニューロンとグリアの衛星細胞解離をことができます。Pseudounipolar ニューロンとグリアのコンポーネントは、神経細胞の生存に重要な役割を果たしています。

3. 後根神経節および後根神経節細胞解離 HSV-1 感染症

注: この作業は、中西部大学バイオ セーフティ委員会によって承認されている設備の整ったラボを持って我々 をバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) の要件に厳密に従うことによって行われました。HSV - 1 コスのひずみは、この研究で使用されました。ウイルスを使用して場合は、適切な測定や地方機関のガイドラインに従って安全対策がください。

1. 判断し、SFM モデルに感染するメディアの正しい希釈でウイルスを準備します。本研究で使用されているウイルスは、HSV - 1 コスひずみです。後根神経節由来の操作は、細胞解離場合、ウイルス等しいセルの数の数を意味する感染症の感染 (MOI) の多様性の 1 単位を使用します。
2. 後根神経節に感染外植片する場合、植のセルの正確な数を特定できないため (例えば、10,000 ウイルス粒子) はウイルス粒子の数を使用します。
3. 滅菌のセル板や SFM メディアとウイルスの混合物を含んでいる管にウイルスに感染して植/セルを配置します。
   注意: 25,000 セル (1 MOI) を含むカバー スライドの 25,000 の粒子を使用しています。感染、植を 10,000 ウイルス粒子を使用します。
4. 開催; 感染症 37 ° C でセル板やチューブを配置します。ウイルス暴露の時間は、ウイルス感染によって異なる場合があります。
   注: ウイルスのエントリは、オルト-ニトロフェニル-β-ガラクトシド (ONPG) と 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) 試金²⁶を使用して確認されました。

4. 蛍光抗体法

1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で作製した 4% ホルマリンで植と単一細胞サンプルを修正します。3 回 10 分ずつのサンプルを PBS で洗浄します。
2. 目的の一次抗体 (抗ヘパラン硫酸 (HS)、および/または抗糖 D (gD) 抗体、抗 peripherin 抗 β-チューブリン; 希釈液の材料表参照) 0.3% と PBS バッファーで希釈したサンプルをインキュベート トリトン X (pbst;) と 10% ヤギ血清。一晩で 4 ° C のサンプルを格納します。
3. 3 回 PBS で 10 分ずつのサンプルを洗います。適切な二次抗体 1 時間室温でサンプルをインキュベート (488 や希釈液の材料表を参照してください; Cy3) PBS で希釈しました。
4. 3 回 PBS で 10 分ずつのサンプルを洗います。取付工程の前に 20 分の PBS のヘキスト染料 (1.5 μ M) でサンプルをインキュベートします。
5. スライド ガラス蛍光メディアをマウントして coverslip のサンプルをマウントします。

結果

神経可塑性と神経環境相互作用の複数の側面は、後根神経節と 1 つの解離細胞培養モデルを使用して調べることができます。DRG 植と模式的に図 1に表される後根神経節由来の解離細胞を分離することによって研究を始めました。組織と単一細胞モデルの両方は、さまざまな蛍光、西部のしみ、ゲノムの試金、実験的なデザインと目的の性質によっては他の分析手法など?...

ディスカッション

前のヴィヴォDRG モデルは、ニューロン ・ グリア相互作用などのイベントの広い範囲と同様、両方の神経細胞およびグリア代謝³⁷の制御の効果を調査するため非常に便利です。さらに、DRG モデルをコスト効果の高いツールとして使用して、発症機序、関連マーカーの特定の疾患、感染症の急性の慢性および潜在期の ex vivoシステム開発に関連する質問に対処可?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mice NIH/Swiss	Harlan Laboratories
35mm petri dish	Cell Treat	229635
Matrigel ECM	Sigma-Aldrich	E1270	gelatinous protein mixture
F12 Media	Gibco	11765-054	*Part of SFM media
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Trypsin	Sigma-Aldrich	25200-056
FBS	Sigma-Aldrich	F6178
0.22um filter	BD Falcon	352350
Neurobasal media	Gibco	10888-022
B27 supplement	Gibco	17504-044	Supplement for neuronal culture
PSN antibiotics	Gibco	15640-055	*Part of SFM media Antibiotic mixture
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G7513	*Part of SFM media
NGF	Alomone Labs	N-100	Nerve growth factor
Laminin coated coverslide	Neuvitro	GG-14-Laminin
ONPG subtrate	Pierce	34055
X-gal	Invitrogen	15520034
Antibody anti-B-tubulin	Sigma-Aldrich	T8328	1:2000 dilution
Antibody anti-peripherin	Millipore	AB1530	1:1000 dilution
Hoechst dye	Thermo Fisher	62249	1.5 µM final concentration
Anti-heparan sulfate	US Biological	H1890-10	0.180555556
Anti gD antibody	Virostat	196	1:10 dilution
BSA	Sigma-Aldrich	A2153-100G	*Part of SFM media
BME	Gibco	21010-046	*Part of SFM media
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	*Part of SFM media
KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A)	Gibco	51300-044	*Part of SFM media
Vitamin-C	Sigma-Aldrich	A4403	*Part of SFM media
Putrescine	Sigma-Aldrich	P7505	*Part of SFM media
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029
Cy3 (goat anti-rabbit)	Jackson Immunoresearch laboratories	111-165-003
Normal Goat serum	Vector	S-1000
Formalin Solution	Sigma-Aldrich	HT5014-120ML
PBS	Gibco	10010-031
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
VectaShield	Vector	H-1500	Flurescence mount
Diamond White Glass Coverslides	Globe Scientific	1380-20