성인 마우스 DRG Explant와 해리 셀 모델 Neuroplasticity 바이러스 성 감염을 포함 한 환경 모욕에 대 한 응답을 조사 하

요약

이 보고서에서 organotypic 문화와 지 루트 마우스 파생 중추의 해리 주 문화의 장점 다양 한 메커니즘 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해와 관련 된 조사를 강조 표시 됩니다. neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염에 응답입니다.

초록

이 프로토콜 지 루트 마우스 파생 중추 (DRG) explant 및 생체 외에서 DRG 파생 공동 문화 해리 감각 신경 그리고 glial 위성 세포의 비보 전 모델을 설명합니다. 이들은 다양 한 생물학 응답 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해에서 이르는 말 초 신 경계 (PNS)의 생리 적 및 병 적인 상태와 관련 된 조사를 유용 하 고 다재 다능 한 모델 neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염입니다. DRG explant의 사용은 여러 이유로 단순한 단일 셀 모델에 비해 과학적으로 유리 하다. 예를 들어, organotypic 문화, DRG explant 비보 전 모든 신경 그리고 glial 기능에 중요 한 역할을 재생 하는 세포 외 microenvironment를 포함 하 여 전체 신경 네트워크의 전송을 수 있습니다. 또한, DRG explants 또한 유지할 수 있습니다 비보 전 위해 몇 일 및 문화 조건으로 불안정 수 있습니다 원하는. 또한, 수확된 DRG 수 수 더 해리를 생체 외에서 공동 문화에 기본 감각 신경 그리고 glial 신경 상호 작용, neuritogenesis, axonal 콘 상호는 extracellular 조사 위성 glial 세포의 microenvironment, 그리고 더 일반적으로, 신경 물질 대사와 관련 된 모든 측면. 따라서, DRG explant 시스템 유연성을 다양 한 비용 효율적인 방식으로, 생리 적, 생물 학적 및 병 적인 조건에 관련 된 이벤트를 연구의 큰 거래를 제공 합니다.

서문

이 원고에서 우리를 PNS 모욕 신경 폐해에서 배열에 생물학 응답의 넓은 범위를 조사 하는 보존된 조직 같은 microenvironment로 파생 된 마우스 DRG 모델 시스템의 organotypic ex vivo 모델을 받는 방법을 보고합니다 상호 작용, neuroplasticity, 염증 성 마커, 바이러스 성 감염. 또한, 우리는 더 DRG 파생 한 감각 신경 및 위성 세포의 기본 공동 문화를 만들려는 프로토콜 개발.

DRG는 위성 회색-문제-단위 척추 신경의 등 쪽 척추 뿌리 따라 중앙 신경 시스템 (CNS) 밖에 위치 해 있습니다. DRG, 척추 foramina의 근접에 있는 pseudounipolar 감각 뉴런 하며 위성 glial 세포. Pseudounipolar 신경 셀 시체 주변 대상에서 체세포와 내장 입력을 들고 주변 프로세스 및 CNS에 세포 체에서 감각 정보를 전송 하는 중앙 프로세스에 분할 단일 neurite 기능. 연결 캡슐 정의 CNS에서 신경 그리고 glial 세포의 주변이 클러스터를 분리 하 고. DRG에서 출생 후 셀 마이그레이션 없음 설명 적 이며 지방 줄기 세포 틈새 생활¹에 걸쳐 발생 하는 neurogenic 이벤트에 대 한 책임. 따라서,이 모델은 특히 성체, axonogenesis, 외상 성 병 변, 및 세포 죽음^{2,3,,45,6,7 공부에 적합 ,,89} .

Neuroregeneration의 분야에는 DRG vivo에서 에서 수확 explanted 시험관에서 재현 axonotmesis, 신경 세포 체는 축 삭은 완전히 절단에 부상 상태 innervated 대상^{10에서 분리 ,11}. 그것은 잘 알려져 주변 신경 상해는 DRG에 감소 및 증가 유전자 발현을 발생할 수 있습니다 및 이러한 변경의 많은 재생 프로세스의 결과 있지만 많은 비 신경 세포에서 면역 반응 또는 다른 결과 수도 있습니다. 비보 전 을 사용 하 여이 복잡성의 일부 고립 된 DRG의 시스템을 제거 하 고 기계적 경로 보다 쉽게 조사 수 있습니다.

CNS, 많은 신경 전달 물질 GABA^12,13,,1415 신경 소마의 수준에서를 포함 하 여에 대 한 수용 체의 풍부에 감각 입력을 전달에 중앙의 역할 외에도 interneuronal 크로스-여기의 증거는 DRG 감각 입력^16,17의 정교한 예비 통합자는 제안할 수 있습니다. 이러한 새로운 결과 부여 DRG explant에 비슷한 신경 조직 특정 organoids의 광범위 한 실험 분야에 사용 되는 다른 "미니 두뇌" 모델 및 치료 미니 신경 네트워크 시스템의 특성 신경 질환^18,19에 접근. 이러한 증거는 사실은 DRG 연결 캡슐에 의해 포위 하는 신경 조직의 개별 및 잘 정의 된 클러스터 함께 비보 전 이식에 대 한 적합 한 장기 게.

자란 마우스 DRG 매력적인 다세포 옵션 종 간의 구조 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 pathophysiologies 모델을 제공 합니다. 또한, 유전자 변형 마우스 긴장의 큰 저장소 미래 기계 론 적인 연구에 매우 도움이 되는. Neurite 확장 모두 개발 및 그 이후 부상 성장 콘 및 기판^20,21사이 기계적인 상호 작용을 요구 한다. 나노 및 마이크로 패턴이 기판 neurite 결과와 그들의 microenvironments에서 지형 기능에 대응 하는 자신의 능력을 보여주는 도구로 사용 되었습니다. 뉴런, 준수, 마이그레이션, 생존과 기판^22,23에 홈 같은 표면 기능 탐색에 그들의 축 삭의 방향을 표시 되었습니다. 그러나, 이러한 연구는 일반적으로 교양된 셀 라인 활용 하 고 어떻게 기본 신경 세포 지 예측 하기 어려운 비보 전또는 vivo에서 잘 정의 된, 물리적 신호에 응답.

마우스 사용이 제안에 대 한 DRG explant 모델 비보 전 진짜 셀 상호 작용 및 생 화 확 적인 신호 성장 축 삭을 둘러싼 모방 합니다. 많은 다른 neuroinflammation, axonal 재생, neurosphere 생산에서에서 배열 하는 실험적인 패러다임에서 DRG explant 가운데 모델 감각 내 바이러스 성 감염 및 대기 시간 측면을 조사 하는 유용한 도구 역할을 계속합니다 중추^24,25,,2627.

신경 계통 (NS)는 일반적으로 바이러스 감염^28,,2930에 대 한 대상입니다. 대부분 바이러스 감염 상피 그리고 내 피 세포 표면 그리고 주변 신경 통해 ns 표면 조직에서 그들의 방법을 감각 및 모터 섬유. 특히, 포진 심 플렉스 바이러스 타입 1 (HSV-1) 상피 세포에 초기 감염 감각 중추에 선호, 평생 대기 시간을 설정 후 PNS^31,32의 DRG. PNS 감염 HSV-1 neuroptropic 기능 신경 질환³³에 궁극적으로 지도 한다.

프로토콜

동물의 사용을 포함 한 모든 절차는 제도적 검토 보드 승인 프로토콜 (IACUC 중서부 대학)에 의해 승인 되었습니다.

1. 마우스 배아에서 DRG 수확

1. 잘린 뒤 질 식 방법 (CO₂)에 의해 성인 쥐 안락사 즉시 수술 척추 열 제거를 진행 합니다.
   1. Dorsally 좋은 위를 사용 하 여 피부 레이어 아래로 절단 하 여 척추 열을 노출 합니다. 동물의 나머지에서 척추 열을 구분 하는 천 골을 통해 열의 양쪽에 있는 갈비뼈를 절단 하 여 척추 열을 격리 합니다.
   2. 바늘/핀을 사용 하 여 수술 매트에 척추 칼럼 (복 부 쪽)를 탑재 합니다.
2. 좋은 위 만들기를 사용 하 여 double 척추 운하의 복 부 측 폭로 척추의 양쪽에 잘라.
3. 현미경 수술 (배율 X 4로 설정)가 위를 사용 하 여 부드럽게 contralateral 등 쪽 척추 뿌리를 노출 하 고 주변 신경의 지 뿌리 따라 DRG를 찾으려고 편이 척수를 이동. 각 절의 척추 foramina 안에 부분적으로 숨겨집니다.
4. DRG, 수확 한 집게 (척수와 사이 DRG) 지 루트 꼬집어 고 부드럽게 척추 구멍에서 DRG를 꺼내.
5. DRG에 주변 척추 신경에 두 번째 집게를 배치 하 고 척추 신경 및 척추 루트 DRG를 당겨.
6. 수집된 DRG 35mm 차가운 혈 청 자유로운 미디어 (SFM)³⁴의 3 mL를 포함 하는 배양 접시에에서 놓습니다.
7. 마른 유리 샬레에에서 각 개별 DRG 전송, 수술 현미경 청소 하 고 트림 초과 섬유와 여전히 DRG는 블레이드를 사용 하 여에 연결 하는 결합 조직. DRG는 흰색 척추 신경/루트 따라 불 룩 한 투명 구조로 쉽게 식별. 종종는 DRG를 둘러싼 혈관 발견 된다.
8. 얼음 처럼 차가운 SFM 미디어를 포함 하는 새로운 페 트리 접시에 청소 DRG를 놓습니다.
9. 젤라틴 단백질 혼합물을 희석 ( 재료의 표참조)에 얼음 처럼 차가운 SFM (1:1).
10. DRG 비보 전 12-잘 접시에 접시 미리 젤라틴 단백질 혼합물의 10/20 µ L로 코팅 하 고 30-60 분에 대 한 37 ° C, 5% CO₂ 배양 기 안에 그들을 설정 합니다.
11. 부드럽게 커버 전체 explant 및 유지 조건 (37 ° C, 5% CO₂) 경작에서 explants 문화 시스템에 SFM의 1.5-2 mL를 추가 합니다.
    참고: 이것은 중요 한 단계는 DRG 유리 요리만 생산 젤라틴 단백질 혼합물에 의해 고정 되어 있기 때문 에입니다. 중 합 및 pipetting 능력의 시간 부동 피하기 위해 중요 하다.
12. 성장 DRG 마다 72 h의 매체 변경 하 고 필요한 만큼 성장 하는 DRG를 하자.

2. 격리 DRG에서 단일 셀 신경

1. 모든 DRG 콜라 IV의 1.25 mg/mL를 포함 하는 F12 미디어의 1.2 mL 살 균 1.5 mL 튜브에 수집 하 고 37 ° C, 5% CO₂ 45 분에서 그것을 품 어 또 다른 45 분에 대 한 첫 번째 부 화 후이 단계를 반복 합니다.
2. 30 분에 대 한 트립 신 (0.025%)를 포함 하는 37 ° C, 5% CO₂에 콜라 IV 치료 후 즉시 F12 미디어의 2 mL와 explants 취급 합니다.
3. 15 분 동안 37 ° C, 5% CO₂ 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, 33%)를 포함 된 F12 미디어 2 mL와 함께 품 어.
4. Explants F12 미디어의 2 mL로 세 번 세척 하 고 기계적으로 해리 그들 유리 피 펫과 미디어 흐린 변할 때까지 계속 합니다.
   참고:이 절차는 이전 섹션에 설명 된 대로 동물에서 청소/손질 DRG의 컬렉션을 포함 한다. Explants의 기계적 분리를 수행할 때 부드러운 고 흘림 및 작업 자료의 손실을 발생할 수 있습니다 이후 과도 한 무력을 사용 하지 마십시오.
5. 0.22 μ m 필터 어떤 불순물 및 과도 결합 조직 제거를 통해 해리 세포 배양을 필터링 합니다. 필터링 된 셀 (2500 x g)에서 lysate 원심 2 분.
6. 제거는 상쾌한 고 셀 펠 릿 신경 문화 (1x), 항생제 혼합 (1x), L-글루타민 산 염 (0.5 m m)에 대 한 보충을 포함 하는 neurobasal 미디어의 500 µ L에서 resuspend 및 신경 성장 인자 (5 µ g/mL) ( 재료의 표참조).
7. 기본 셀 밀도 laminin 코팅 커버 슬라이드 (50 µ g/mL, 참조 테이블의 재료)에 천연된 셀 접시. 셀 카운터를 사용 하 여 셀 밀도 결정 합니다.
   참고: 우리가 도금 25000 셀/커버 슬라이드에 세포. 이 기술은 신경 그리고 glial 위성 세포의 분리 수 있습니다. Pseudounipolar 신경와 공동 경작 glial 구성 요소 신경 생존을 위해 중요 한 역할을 한다.

3. HSV-1 감염 DRG Explants의 DRG 파생 해리 셀

참고:이 작업 엄격 하 게는 우리는 완벽 하 게 갖춘된 실험실 중서부 대학 biosafety 위원회에 의해 승인 되는 biosafety 수준 2 (BSL-2) 요구에 따라 이루어졌다. HSV-1에의 KOS 스트레인이이 연구에 사용 되었다. 바이러스 긴장을 사용 하는 경우 적절 한 측정 및 현지 기관 지침에 따라 안전 조치 보시기 바랍니다.

1. 확인 하 고 바이러스 감염 모델 SFM 미디어에 올바른 희석에 준비. 이 연구에 사용 된 바이러스는 HSV-1에의 KOS 긴장 했다. DRG 파생 작업 셀 해리 때 감염, 바이러스 같은 셀의 수 수를 의미에 대 한 다양 한 감염 (MOI)의 1 단위를 사용 합니다.
2. Explants DRG를 감염 하는 경우 셀에는 explant의 정확한 수를 확인할 수 없으므로 virions (예를 들어, 10000 virions)의 수를 사용 합니다.
3. Explant/셀 수 바이러스에 감염 된 살 균 셀 접시 또는 SFM 미디어와 바이러스의 혼합물을 포함 하는 튜브에 놓습니다.
   참고: 우리는 25000 셀 (1 나)를 포함 하는 커버 슬라이드에 대 한 25000 virions를 사용. explant 감염, 우리는 10000 virions를 사용 합니다.
4. 열릴; 감염에 대 한 37 ° C에서 셀 플레이트 또는 관 배치 바이러스 노출 시간 바이러스 infectivity 따라 달라질 수 있습니다.
   참고: 바이러스 항목 직교-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) 및 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) 분석 실험²⁶사용 하 여 확인 되었다.

4입니다. 면역 형광 검사

1. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4% 포 르 말린에 explants 및 단일 셀 샘플을 수정. PBS에서 3 시간 10 분 대 한 샘플을 씻으십시오.
2. 원하는 기본 항 체 (안티-β-tubulin, 안티-peripherin, 안티-heparan 황산 염 (HS), 또는 반대로 당단백질 D (gD) 항 체, 희석에 대 한 참조 테이블의 자료 ) 0.3% 버퍼 PBS에에서 희석 된 샘플을 품 어 트리톤-X (PBST) 및 10 % 정상 염소 혈 청입니다. 밤새 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
3. 3 번 10 분 각 PBS 가진 대 한 샘플을 씻으십시오. 1 h 적절 한 이차 항 체에 대 한 실 온에서 샘플을 품 어 (488 또는 Cy3; 희석에 대 한 재료의 표 참조) PBS에 희석.
4. 3 번 10 분 각 PBS 가진 대 한 샘플을 씻으십시오. 설치 단계 전에 20 분에 대 한 PBS에 Hoechst 염료 (1.5 µ M)와 샘플을 품 어.
5. 형광 장착 매체와 coverslip를 사용 하 여 유리 슬라이드에 샘플을 탑재 합니다.

결과

Neuroplasticity 및 신경-환경 상호 작용의 여러 측면 DRG와 단일 해리 셀 문화 모델을 사용 하 여 조사 수 있습니다. 우리는 DRG explant와 DRG 파생 해리 셀 개요로 서 그림 1에 표시를 분리 하 여 연구를 시작 했다. 조직 및 단일 셀 모델은 다양 한 면역 형광 검사, 서쪽 오 점, 게놈 분석, 실험 설계 및 목표의 성격에 따라 다른 분석 기법 등 분자 기술 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 첫...

토론

Ex vivo DRG 모델 두 신경 그리고 glial 대사³⁷에 있는 microenvironment의 효과 뿐 아니라 신경 명과 상호 작용 등의 다양 한 스펙트럼을 조사 하기 위해 매우 유용 합니다. 또한, DRG 모델 병원 성 메커니즘 및 급성 만성 및 잠재성 단계 감염 또는 특정된 질병에 대 한 ex vivo 시스템 개발 하 여 마커를 관련 된 관련 된 질문을 해결 하기 위해 비용 효율적인 도구로 사용 될 수 있?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mice NIH/Swiss	Harlan Laboratories
35mm petri dish	Cell Treat	229635
Matrigel ECM	Sigma-Aldrich	E1270	gelatinous protein mixture
F12 Media	Gibco	11765-054	*Part of SFM media
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Trypsin	Sigma-Aldrich	25200-056
FBS	Sigma-Aldrich	F6178
0.22um filter	BD Falcon	352350
Neurobasal media	Gibco	10888-022
B27 supplement	Gibco	17504-044	Supplement for neuronal culture
PSN antibiotics	Gibco	15640-055	*Part of SFM media Antibiotic mixture
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G7513	*Part of SFM media
NGF	Alomone Labs	N-100	Nerve growth factor
Laminin coated coverslide	Neuvitro	GG-14-Laminin
ONPG subtrate	Pierce	34055
X-gal	Invitrogen	15520034
Antibody anti-B-tubulin	Sigma-Aldrich	T8328	1:2000 dilution
Antibody anti-peripherin	Millipore	AB1530	1:1000 dilution
Hoechst dye	Thermo Fisher	62249	1.5 µM final concentration
Anti-heparan sulfate	US Biological	H1890-10	0.180555556
Anti gD antibody	Virostat	196	1:10 dilution
BSA	Sigma-Aldrich	A2153-100G	*Part of SFM media
BME	Gibco	21010-046	*Part of SFM media
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	*Part of SFM media
KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A)	Gibco	51300-044	*Part of SFM media
Vitamin-C	Sigma-Aldrich	A4403	*Part of SFM media
Putrescine	Sigma-Aldrich	P7505	*Part of SFM media
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029
Cy3 (goat anti-rabbit)	Jackson Immunoresearch laboratories	111-165-003
Normal Goat serum	Vector	S-1000
Formalin Solution	Sigma-Aldrich	HT5014-120ML
PBS	Gibco	10010-031
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
VectaShield	Vector	H-1500	Flurescence mount
Diamond White Glass Coverslides	Globe Scientific	1380-20