JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

濃厚血小板含有微粒子をスクリーニングに基づく血小板在庫管理は品質改善活動の新しい病院の血液銀行です。目標は、活性化された血小板の使用を最適化するために非活性化血小板から区別するためにです。血液腫瘍患者に非活性化血小板を提供する難治性になる高リスクを減らす可能性があります。

要約

微粒子含有濃厚血小板をスクリーニングに基づく血小板在庫管理は病院の血液銀行の新しい品質改善の取り組みです。彼らが強調しているとき、セルは微粒子 (MP) をフラグメントします。血と血のコンポーネントから様々 な細胞、活性化した血小板から最も顕著な細胞断片があります。自然免疫系細胞や主要なプレーヤーとしての役割を実行する、凝固と止血で、血小板は形を変え、微粒子を生成します。動的光散乱法 (DL) と-基づく微粒子検出非活性化 (低微粒子) 血小板輸血、内から活性化 (高微粒子) を区別するため、この不足している血液製剤の使用を最適化することが可能です。これまでの研究では、非活性化血小板の血液腫瘍患者における予防的使用のために提供することが難治性になることのリスクを軽減、患者ケア向上を示唆しています。このスクリーニング法の目的は、非活性化血小板からアクティブに日常的に区別するためにです。病院の血液銀行で定期血小板在庫管理に対して実行する手順の概要をここで述べる方法: テスト DL を実行するサンプルを読み込んで DLS 測定用キャピラリー血小板輸血からのサンプルの取得微粒子、および活性化した血小板を識別するために報告された微粒子のコンテンツを使用して識別します。

概要

微粒子への関心はほとんど細胞細胞コミュニケーションと生物学的プロセスに関与中心でした。1,2,3最近、微粒子がまた関心を集めて自己免疫疾患および心血管疾患の早期診断マーカーとして。4,5として知られている細胞の小胞または、エクソソームの微粒子は、広くフローサイトメトリーによって研究されてきた。残念ながら、従来の流れの cytometry のプロトコルを標準化するための努力にもかかわらず無いコンセンサスを使用する最適なプロトコル。6,7,8,9,10

従来のフローサイトメトリーは、特定の MP のサブポピュレーションを特徴付けることができる、制限報告11が収められています。11,12,13,14これらの制限のいくつかは、いわゆる高出力レーザーや検出器を使用して対処されている「小さな粒子オプション」、15、16 15 °-25 ° 前方で検出角度を散布し、シース圧を変更.17,18それにもかかわらず、これらの高度な方法と組み合わせることができます迅速かつ簡単に使用できるスクリーニング法まだ必要です早期診断マーカーとしての微粒子を利用します。微粒子レベルの上昇は正常な血液ドナー19の約 3 分の 1 で検出可能であり、潜在性の条件を示す可能性があります。その結果、献血血液製品に高い微粒子レベル影響を受ける受信者と互換性があるかもしれない。20

血小板輸血に際し、非免疫不応性 - 前記患者の体連続輸血を拒否し、循環する血小板のかなりの部分を許可しない状態の危険性があります。21,22非免疫不応性無駄な輸血の結果、健康合併症患者、および延長病院の滞在します。23微粒子の高番号を含む血小板輸血は影響を受ける血液がん患者における非免疫不応性の開発のための貢献の要因をすることができます。20微粒子傷つきやすい患者のリスクを減らすためのスクリーニングによって血小板輸血の組成によると血小板の在庫を管理することが可能です。ただし、ほとんどの微粒子検査血小板5,12から微粒子を分離する必要または非常に労働は、それ以外の場合集中24,25したがってない実装できます定期的に病院で血液銀行。

説明する手法は、ここで動的光散乱 (DL) - としてまた知られている光子相関分光法や準弾性光散乱を使用します。何十年も、動的光散乱広く使用されています製薬業界におけるリポソーム医薬品製剤またはエマルジョンの特性評価に粒径がサブミクロン範囲内にあります。26,27しかし、これらのアプリケーション開発ツールは、画面血液製剤に最適化されていません。新しい DL システムは、技術的な限界を克服し、血小板輸血のスクリーニングに役立つ動的光散乱に開発されました。28

動的光散乱測定は、懸濁粒子レーザー光を照らすと、粒子懸濁液中の移動の結果である散乱光強度の時間変化の分析によって実行されます。さらに、高速小さな粒子が移動されたときにこのメソッドを使用して、パーティクルの速度およびサイズの間の逆関係、大きな粒子はサイズ分布とサンプル コンポーネントの相対的な濃度情報を提供するためにゆっくりと - 移動します。平均微粒子の DL を使用して微粒子コンポーネントのコンテンツ、平均半径を定量化することができます。血液製剤の微粒子のコンテンツは、% MP 50 550 nm から粒子半径測定ヒストグラムのエリアをベースとして与えられます。50 以下の半径で粒子をしながら nm は DLS により検出および %mp には含まれていない DL システムによって報告されます。血小板から微粒子を分離するのではなく血小板輸血の不均一性は、微粒子とサンプルの血小板の相対的な内容に基づいて決定されます。実際には、血小板と微粒子のピーク比は、血小板数がわかっている場合は、絶対 MP 濃度を計算する使用できます。19

DL システムは、人間の血液や血液製剤由来の標本は、微粒子に関する定性的および定量的な情報を医療従事者を提供します。Cytometry 流れ、電子顕微鏡、分析30または31を検出可変抵抗パルス追跡29ナノ粒子などの代替技術の説明の DL 方法の主な利点は、サンプル準備です。血小板製剤の因数は、血小板、サンプル希釈またはその他の変更から MP を分離することがなく直接測定できます。9,17また、DL に絶対サイズ変更メソッドは、適切な屈折率の校正ビーズの欠如に苦しむされず。14,32

血小板活性化と MP は、コンテンツの相関顕微鏡33,20によって示されている以前と病理学の条件15,34,の MP 量の増加から推測することができます。35,36血小板をアクティブにする知られている培養条件の下で。19,37,38しかし、さらに研究が必要完全に微粒子の DLS 測定コンテンツと血小板活性化との関係を理解します。当社の現在の知識に基づいて積極的に出血患者39、非活性化恩恵を受ける血液がん患者の治療に使用される活性化した血小板が、最高な微粒子、高数が含まれてない血小板または微粒子20の低レベル。最近、回復と安定、大抵非出血血液腫瘍患者40 に単一輸血におけるこれらの血小板の生存ドナー血小板の生体外での応答性が大幅に影響しなかったと報告されています。.この発見からまた高 MP の内容によって識別される血小板活性化は患者の予防的治療でない重要な役割を担うが締結される可能性があります。ただし、患者の絞込みのため本研究はないの複雑な患者は発熱 (研究から除外) ドナーの要因の影響に対応し、安定していない多くの 2 つ以上の血小板輸血を受け取る。-これは不応期を短縮するための約束を保持している - どのようにこれらの患者の場合のコストを削減できる質問は未解答に残る。

微粒子炎症41,42,43,44 , 血小板活性化45の早期マーカー、したがって多く通常ドナーで検出されます。19は、したがってに活性化した血小板および微粒子は、血小板の寄付金で表示されます。熱、すなわち、完全に活性化生得免疫システム、患者が活性化した血小板の輸血の追加の課題を許容できないと仮定するが妥当です。しかし、研究はこの仮説を証明するために必要です。微粒子スクリーニングは血小板輸血の内容について現在の不確実性を軽減し、患者の治療の複雑さを軽減できます。

病院の血液銀行の非活性化に活性化した血小板の割合依存ドナー人口に主に、輸送や照射、病原体不活化血小板活性化を増やす可能性があります他のプロセスにはるかに低い程度に集中しています。19アメリカ合衆国の主要な病院血液銀行からデータを示した血小板在庫の平均組成がアクティブ化される 49%、51% が非活性化 (活性化した血小板の範囲: 38 62%、個人通信)。血液製品プロバイダーや病院の血液銀行は彼らを生成または受信、および彼らの目録を管理するどのように多くの活性化および非活性化血小板製剤として微粒子によって示される血小板活性化に基づくを知りたい場合コンテンツ、これプロトコルはそれらのために適切かもしれない。

病院の血液銀行は予防のための非活性化、同質な血小板を使用し、活性化、異機種混在の血小板治療上の使用を直接できる血小板成分に基づきます。血小板スクリーニングでは、病院への患者のケアを向上し、コストを削減在庫の使用率を最大化することができます。このプロトコルは、基本的な処理および血液製剤の操作に精通している研究者向けです。

ここに提示すると、微粒子の内容に基づいて製品を選択することが望ましい、微粒子病院血液銀行在庫管理に定期的に適用できる血小板輸血のスクリーニング法です。この議定書の目的は、寄付された血小板のスクリーニングのための実装と DL の評価の概要を説明することです。記述されていたプロトコル アドレス サンプルは、非侵襲的なアクセス、血液銀行の仕事の流れと性能テストの統合の一般的な質問です。

プロトコル

次のプロトコルは、すべてのカナダの血サービス (CBS) のガイドラインに準拠して行われています。ボランティアが彼らの寄付ができることに同意を与えたこれらの研究を遂行するために使用します。血小板製剤は、CBS 標準業務手順書に従って調製しました。ここで説明したすべてのパフォーマンス テストを行ったセンターで血液研究ブリティッシュ ・ コロンビアの大学、バンクーバー、カナダの機関研究倫理委員会の承認と。

1. 品質管理チェック

  1. 少なくとも一度 DL システムの適切なオペレーションを確認する日をテストごとの品質管理チェックを実行します。使用するメーカーの指示に従って指定されたコントロール ビーズ (50 nm の半径) を測定します。
  2. コールド ストレージからコントロール バイアルを取得し、常温に 15 分を許可します。ビーズは、使用する前に室温に釣り合う必要があります。
  3. 最初のサンプルはテストの準備時間 15 分レーザー ウォーム アップ期間を完了するようにサンプルを準備する前に DL システムをオンにします。
  4. コンソールを立ち上げた、一度ログインしてシステムのテストを選択して、コントロールのサンプルを測定するタッチ スクリーンの指示に従います。
  5. 渦ミックス 10 バイアル s 代表的なサンプルを確認します。
  6. 100 μ L の一定量ピペット、ピペット チップおよびテスト キットからキャピラリーを用いた制御ビーズで毛細血管を埋めます。
  7. テストが完了すると DL システムの画面の指示に従います。
    注: コントロール ドロービード試験結果が自動的にコントロール ビーズ バーコード ラベルとパスに格納されている情報と比較やサンプル情報と同様に、失敗通知をテストの終わりに DL システム画面に表示。

2. 血小板の濃縮物からサンプルを取得

注: これらの手順は、テスト ルーチン血小板在庫管理用キャピラリー DLS に血小板輸血から非侵襲的サンプリングのプロセスを説明します。概要を図 1に示します。必要な付属品: チューブ シーラー、手動管ストリッパ、はさみ、スプラッシュシールド。

  1. 未検証の在庫から血小板の濃縮物を削除します。
  2. 未使用サンプリング ポーチから血小板の製品のサンプルを入手 (2.3 の手順に進みます) またはチューブ セグメント (空の場合 2.4 の段階に進むまたは手順 2.5 空でない場合)。
    袋を切断するには、配管またはチューブ セグメントはチューブ シーラーを使用します。チューブ シーラーを操作するには、製造元の指示を従ってください。簡単に言えば、2 つ温水顎間の正確な位置にシールするチューブをクランプします。ハンドヘルド デバイスで一緒に溶融チューブを押して、高圧力の下で (期間中は緑色の光で示される) レバーを押しながらクールな永久的な漏れ防止シールの結果します。
  3. ポーチからサンプリング
    1. 5 穏やかな水平運動によってよく血小板バッグの内容をミックス s (チップ端から端まで 5 回)。
    2. ポーチにクランプを開きます。ポーチや避難はそれ自体でいっぱいになります。のみ 100 μ L のサンプルが DL テストに必要な場合袋を完全に記入する必要はありません。
    3. ヒートシール接続チューブ チューブ シーラーで袋から袋を外します。手順 3 に進みます。
  4. 空チューブからサンプリング
    1. 血小板がバッグを確認チューブを空に格納されているし、チューブ ブロックが設定されています。チューブ チューブで血小板の濃縮物のかなりの量がないことを確認を調べます。チューブが空でない場合は、2.5 の手順に進みます。
    2. ローラー間チューブを圧迫するハンドルを圧縮することによってできるだけチューブ ブロックに近いとして管の上管ストリッパを閉じます。
    3. 垂直に袋を掛けるし、ストリッパーのハンドルを圧縮してください。
    4. ストリッパーを維持するを閉じると、配管ブロックをリリースします。
    5. ストリッパーの後ろに合わせてゆっくりとチューブを可能にする空の管をストリッパーをゆっくり引き出します。後述のストリッパーが完全に膨張するかストリッパーが管末の 1 インチまでを続行します。
    6. 使用熱管シーラー シール チューブのストリッパーと停止位置に達すると、ストリッパーの上の 1 インチ。
    7. 手動管ストリッパのハンドルを解放します。
    8. ヒートシールのもう一度テストのセグメントを作成する以前のシールの上の 1 から 2 インチ。
    9. 血小板ユニットからテストのセグメントを切断します。このセグメントは、dl がテストされます。
  5. 空ではないチューブからサンプリング
    1. 垂直に袋を掛けるし、場所の場合チューブ ブロックをリリースします。
    2. 任意の大きな固体の塊があるかを決定するためのチューブを目視で確認します。彼らは袋に脱げないように固体の塊が存在する場合はそれらの上シールします。
    3. できるだけチューブのシールの端として管の上管ストリッパを閉じます。
    4. 袋に向かってチューブに沿って管ストリッパを移動クランプ力を維持しながら、ローラー間、チューブを圧迫するハンドルを圧縮して袋にチューブの内容を除去します。
    5. 吊りフックから血小板のバッグを取り出して、軽くミックス 5 袋をひっくり返すことによってそれ端から端まで 5 回ストリッパーを維持しながら s を閉じる。
    6. 閉じたストリッパーを維持しながら垂直方向に袋を掛けます。
    7. ストリッパーの後ろに合わせてゆっくりとチューブを可能にする空の管では、ダウンのストリッパーをゆっくり引き出します。後述のストリッパーが完全に膨張するかストリッパーが管末の 1 インチまでを続行します。
    8. 使用熱管シーラー シール チューブのストリッパーと停止位置に達すると、ストリッパーの上の 1 インチ。
    9. ストリッパーをリリースします。
    10. ヒートシールのもう一度テストのセグメントを作成する以前のシールの上の 1 から 2 インチ。
    11. 切断し、管の最後の部分を破棄します。
    12. 血小板ユニットからテストのセグメントを切断します。このセグメントは、dl がテストされます。

3. 毛細血管をテスト DL にサンプルを充填

  1. スプラッシュシールドと清潔で乾燥したはさみを使用してチューブまたはセグメントをテスト ポーチの一方の端をカットしました。
    注: テスト DL 用キャピラリーはすぐに記入されるべき。
  2. (組み立てられた 100 μ L の一定量ピペット、ピペット チップ、キャピラリー) キャピラリーに開いたポーチまたはチューブ セグメントから直接サンプルを描画するためのサンプリング ツールを使用して、毛細血管を記入してください。
  3. 優しく穏やかなひねりを加えた、トレイに対していくつかの圧力を適用するとき毛管シーリング材に充填キャピラリーを押すことにより充填キャピラリーの底をシールします。
  4. キャピラリー チューブのシール材にしっかりと埋め込まれて固定ボリューム ピペットおよび毛管、キャピラリーを保持からのヒント 100 μ L を外します。
  5. キャピラリー チューブのシール材トレイから毛細血管を削除、イソプロピル アルコール パッドで一掃し、毛細血管の下部を軽くフリックで閉じ込められている空気の泡がないことを確認します。
  6. DL システムにキャピラリーを配置します。

4. DL テストを実行します。

  1. 血小板サンプルの微粒子の内容を測定するための新しい DL テストを開始する MP テスト オプションを選択します。
  2. サンプル情報 (寄付識別番号 (ISBT)、コレクション/生産期限や製品コード) を入力してバーコード スキャナーを使用して、または手動で。
  3. 製品コードが見つからない場合、DL システム流体媒体情報を抽出、適切な流体媒質を手動で選択 (ほとんど血小板濃縮プラズマを選択、血小板添加剤ソリューション (PAS) を含むサンプルを入力、残留プラズマの割合)。
    注: 公称 65% から PAS 割合に小さい偏差が計算される MP 半径がない MP を % にほとんど影響しません (DL システムで自動的に計算) 粘度で小さなエラーが発生します。
  4. 指示に従って DL システムにキャピラリーを配置し、テストを開始します。
  5. テストが完了したら、キャピラリー ホルダーと施設のガイドラインに従って適切に消耗品の処分からサンプルを削除します。キャピラリー ホルダーと施設のガイドラインに従って適切に消耗品の処分からサンプルを削除します。
  6. タグ血小板バッグの結果、たとえばオレンジ色に対応する色で非アクティブ (均質) %mp 等しいまたは 15% とピンクの下で % MP 15% 以上 (異種) 活性化します。

figure-protocol-4474
図 1: メソッドの概要。病院の血液銀行で定期血小板在庫管理に対して実行する手順の概要: 微粒子を識別するためにテスト DL を実行する DLS 測定用キャピラリーにサンプルを読み込む、濃縮血小板からサンプルを取得報告された微粒子の活性化した血小板を識別するためにコンテンツを使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

結果

平均準備時間
DL システムを使用してプロセスをスクリーニング血小板は、図 1のとおりです。血小板は、血液供給業者からの領収書の時間で DL システムがテストされます。表 1に詳細な訓練されたユーザーの平均準備時間は 2 分 23 秒でクリーンアップと事後テスト作業時間は 14 秒と 46 秒、それぞれ。合計では、平均的なユーザーは 3 分と 23 テストごとのハンズオン タイムの s。

アクティビティアクティブな時間徒歩距離のテスト時間合計
DL のシステムを準備します。14 s
サンプリング ツールを組み立てる28 s
セグメントを取得します。52 s
毛細血管を入力し、テストを開始49 s
5 分
クリーンアップ14 s
タグと在庫の血小板バッグ46 s
サンプルごとに必要な合計時間3 分 23 秒5 分8 分 23 秒

表 1: アクティブなテスト時間内訳。テスト自体は、5 分の平均時間と歩行距離テストです。平均的なユーザーは、テストの DL システムを準備、取得してこのプロトコルを次のサンプルをテストし血小板バッグのタグ 3 分 23 秒をかかります。

精度
DL のシステムの精度は 0 7 3 つの微粒子レベルで評価された %、12-25%、28-75%。%Mp の臨床的に関連する範囲は 3 75% です。2 つの演算子は、並列で 2 つの DL システム 16 営業日の低、中、および高のコントロールのサンプルをテストしました。サンプルは、各試験日の重複がランダムな順序でテストされました。

表 2は、血小板に対する % 微粒子 (%mp) の DLS 測定のデバイス内で精度をまとめたものです。

微粒子コンテンツ
低媒体高
意味 %mp (%)4.419.553.8
標準偏差 (%)1.82.65.8
CV (%)40.413.210.6

表 2: % 微粒子 (%mp) のデバイス内の精度です。小さな血小板 % に貢献するかもしれない非常に低い微粒子コンテンツで MP は低微粒子コンテンツ サンプルの変動を増加しました。

50 550 nm 間の平均微粒子半径の DLS 測定のデバイス内で精度を表 3に示します。

微粒子コンテンツ
低媒体高
半径 (nm) を意味します。331161188
標準偏差 (mm)1334125
CV (%)40.125.213.5

テーブル 3: 微粒子の半径の内でデバイスの精度です。非常に低い微粒子でコンテンツの小さな血小板 % 微粒子 (%mp) に貢献するかもしれない低微粒子コンテンツ サンプルのばらつきの増加の結果します。

表 4は、DLS % 微粒子 (%mp) 測定の再現性を示します。

微粒子コンテンツ
低媒体高
意味 %mp (%)4.429.253.6
再現性 (%)1.52.35
CV (%)3511.89.4

表 4: % 微粒子 (%mp) の動的光散乱 (DL) 測定の再現性。

直線性
DLS 結果は線形図 2ショー、すなわちサンプルの割り当てられた値に関して直線に合います。7 異なる微粒子コンテンツを用意しました。高 (MP7) と低 (MP1) 微粒子のコンテンツと一致する血小板濃度サンプル準備、中間サンプル (MPx) を作成する別の比率で混合します。サンプル フローサイトメトリー19および DL を前述のようにテストされ、各濃度 %mp 結果をプロットした入力と出力として。決定係数は 0.985 をことが判明しました。低、高微粒子コンテンツの DL のヒストグラムの例を図 3Aに。DL の結果は、フローサイトメトリー (図 3B) によって確認されました。

figure-results-4809
図 2: フローサイトメトリーと DL 結果の比較します。%Mp の線形関係は、オープンの記号 ○ でマークされた 2 つのサンプルから元の DL データは図 3に示すフローサイトメトリー (入力) と DLS (出力) によって決まります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-5276
図 3: 微粒子コンテンツ活性化および非活性化血小板を区別します。(A) MP は、活性化した血小板 (破線) でコンテンツの DL 結果非活性化血小板 (実線) で 4% と比較して 57% であった。37 ° C の測定温度で試験を行った 1.06 の血漿粘度設定 x10-3 Pa·s、および 200 600 kHz の間の合計強度の設定。(B) (A) に示すように同じサンプルのフローサイトメトリー結果 (19を前述のように取得) の流れ前方散乱のヒストグラムで P1 と P2 を表す MP と血小板のゲート;活性化した血小板のイベント (左) の 76% は非活性化血小板 (右) のための 6% と比べて MP ゲートに落ちた。回帰直線では、一貫して高い結果につながるフローサイトメトリーによる %mp にバック グラウンド ノイズの定数の相対的寄与を示唆しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

特異性/干渉
標準化機構 (ISO) の国際組織は、検出または他の量、サンプルで現在がある中、ここだけを測定する測定プロシージャの能力として解析的特異性を定義します。微粒子スクリーニングの解析的特異性は、赤い血球 (RBC) によって影響される可能性があります。DLS では、MP は血小板のコンテンツを基準にして、コンテンツを測定します。RBC は、MP の相対的寄与を減らす血小板の散乱の寄与で RBC の散乱の寄与が含まれるためにを妨げる可能性があります。血液製剤の許容 RBC コンテンツの規制が存在します。8.0 で血小板の結果の 1 つのユニットで RBC を満載の血小板濃縮 2 mL で RBC 恕の AABB によって推奨されるしきい値の保守的な変換 x1010セル/L (前提: 赤血球量が 8.5 x10-14L、パックされた赤血球のヘマトクリット値が 68%、血小板ユニットの体積は 200 mL)。さまざまな製品で報告された残留赤血球濃度がこのしきい値の46を下回るです。

3 つの異なるドナーは、3 つの独立実験の対象として、2 つの別の日に血小板と赤血球 (RBC) を寄贈しました。血小板製剤 (サンプル参照) で初期の RBC コンテンツは 0.05 - 0.15 x109セル/L 診断で決定されました。5 その他のサンプルは、スパイクで既知量の赤血球血小板の濃縮物; の因数にによって作成されました。これらのサンプルのターゲット赤血球レベルが 1.0、5.0、10、40、80 x109セル/l.

赤血球の干渉のしきい値は約 1.0 x1010セル/L (図 4)、赤色の血液細胞の存在が視覚的に明白である (図 5) にレベルと相関します。このレベルでは、上記は、ことで視覚的に赤のサンプルを含む赤血球ヘモグロビンの報告された微粒子のコンテンツが低すぎることがなくことを意味する %mp が過小評価されました。

figure-results-7204
図 4: %Mp (DL) と赤血球濃度 (セル/L) の線形関係。0.1 の赤血球濃度の増加 x1091.0 x109、5.0 x1091.0 x1010、4.0 x1010、および 8.0 x1010セル/L (左から右へ) (○ 実験 1、● 実験 2、□ 実験 3 の独立した実験から3、線形回帰直線が表示されます各実験のため)。1.0 を超える x1010 RBC/L %mp の過小評価に 。RBC 含むサンプルの外観は、図 5に示すです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-7853
図 5: サンプルを含む赤血球の外観。血小板の赤みサンプル含む赤血球濃度 0.1 x1091.0 x109、5.0 x1091.0 x1010、4.0 x1010、および 8.0 x1010セル/L 左から右へ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

精度
精度は、1 回の測定結果とサンプルに割り当てられた正しい量値の差として定義されます。この測定誤差には、測定バイアスによる推定体系的なコンポーネントと標準偏差から推定されるランダムなコンポーネントが含まれています。したがって、計測結果の精度、真度及び精度の組み合わせです。

標準的なビーズは、DL テストの精度を決定する使用されました。精度は、3 75 %mp のアッセイの臨床的に関連する範囲内で 2 つの濃度で評価しました。参照ビーズ混合参照ビーズは、既知のサイズと濃度を持っているので、既知濃度の試料を準備する使用されました。その結果、目的の粒径と濃度のサンプルを取得する参照ビーズをミックスできます。

微粒子を表す 125 nm radius 標準ポリスチレン ビーズを用い、1.5 μ m の半径のビーズが血小板を表すために使用されました。約 20%、50% の MP のコンテンツのビーズ混合微粒子分析の精度を評価しました。参照ビーズ表 5に示すように、分析証明書に関する文書化された粒子半径測定粒子の半径の精度を比較しました。

125 nm ビーズ1.5 μ m ビーズ
分析証明書分析証明書
20% MP50% MP20% MP50% MP
半径を意味します。122.0事業は 1,138億124.41.51.61.60
標準偏差4.52.833.60.0350.060.07
CV3.60%2.48%2.89%2.20%3.74%4.05%
精度6.70%2.00%6.50 パーセント6.30%

表 5: 動的光散乱 (DL) 測定の精度です。Dl サイズ比較結果 125 nm の半径 1.5 μ m の半径とビーズの分析証明書に対して混合物。

ディスカッション

このプロトコルでは、血小板の濃縮など生物学的サンプルで見つかった高粒子濃度の最適化された微粒子検診動的光散乱法について説明します。DL の方法は本質的にサイズを正確に測定する標準化されました。血小板濃度が知られていて、参照ピーク19として血小板ピーク面積を使用場合、微粒子の相対濃度は絶対濃度に変換できます。血小板として濃度は、通常の血球計数装置が得られるまたは流れの cytometers これらの方法を考えることが DL にコンパニオン技術。

DL のシステムの機能は、コントロールのビーズを定期的に実行して、被保険者です。蒸留水は、バック グラウンド ノイズが最小限であることを確認する測定できます。MP ネガティブ コントロールとして、MP 陽性コントロールとして 125 nm 半径ビーズの添加後、市販の血小板基準を分析できます。興味の生物的範囲の MP 濃度内で手順は、実用的かつ迅速に血液銀行のルーチンの一部として実行します。

フローサイトメトリーではなくこのメソッドに基づいていない粒子の散乱強度がむしろ彼らのブラウン運動の速度を比較します。したがって、エクソソームはサイズが小さいにもかかわらずも検出することができます、MP から別に報告されます。

スクリーニング ツールとして設計され、このメソッドの制限事項は、微粒子の種類を区別できないことに関連しています。追加の分離手順を使用する場合、潜在的な改善の余地があります。サンプルは前に、と後、抗体の微粒子による特定の駆除結合磁性体ビーズ キャプチャ テストでした。さらに、検出されたすべての微粒子が細胞に由来高脂血症47,48と小さな細菌またはウイルス6形成、チロミクロンまた微粒子の範囲で報告されるのでそれを想定できません。ただし、その他の措置は、lipemic や病院の血液銀行の在庫を入力する汚染された血小板を避ける高度への血液供給内に存在します。

血小板の活性化、したがって MP コンテンツ49の範囲をサンプルで抗凝固剤の選択に影響します。さまざまな製品の比較この要因を考慮する必要があります。MP コンテンツと不均一性を決定するしきい値の PAS など MP 無料サスペンション メディアでプラズマの交換の影響また、-場合にのみ集中することに残留プラズマ内 MP は、元のコンテンツの約 3 分の 1 を左、それに応じてコンテンツ下限 MP 100% プラズマのように血小板の活性化の同じレベルがわかります。パーセントの MP は、血小板に対する MP コンテンツです。以前、平均 %mp はまだ 9.519PAS 製品の平均血小板数が低かったことが報告されました。米国でライセンスされた PAS 血小板 %mp のしきい値は 10% に設定されています。

血小板にストレスを引き起こすプロセスがストレスに血小板の感受性に応じて MP レベルを上げる、血小板製剤で MP の主なソースは、ドナーが、-場合は血小板をアクティブすでに非常にマイナー ストレスなど病原体不活化、洗浄、貯蔵寿命を拡張照射や長距離輸送は、MP は、コンテンツの大幅な増加につながる可能性があります。これらのストレスのどれもが均質、非活性化血小板19に大きく影響する示されています。また、注意する必要があるキャピラリー内サンプル組成の変化の可能性に支払われるテストされていない場合準備 (このプロトコルの手順 3 の完了) 後すぐに。

このプロトコルの焦点は、血小板輸血、血小板活性化のバイオ マーカーとしての微粒子を使用する粒子の組成を決定するのです。血小板輸血のいずれか非活性化 (オレンジ) タグまたはアクティブ化 (ピンク) 15% の微粒子の割合のしきい値に基づいて。100% プラズマにおける血小板の MP は、経験的に決め複数サイトから平均 66th百分位数として 15% のしきい値です。

DLS によるルーチンの微粒子に基づく血小板在庫管理の目的は、非免疫血小板不応性を防ぐことによって患者のケアとドライブのコスト効率を改善するためにです。血小板袋のスクリーニングのための DL システムの実装は、血小板不応性を開発するためのリスクで最も患者に非活性化血小板を指示するユーザーを有効にします。

開示事項

EMS は、LightIntegra テクノロジー株式会社、微粒子や血小板品質テストに ThromboLUX システムを開発し医療機器会社の創設者です。他のすべての作成者は、LightIntegra 技術の従業員です。生産とこの記事への無料アクセス、LightIntegra テクノロジー株式会社主催します。

謝辞

ありがとう献血者及び人材カナダの血サービス ネットワーク センターで適用開発コレクションや本研究で使用される血小板単位の生産のため。我々 は血の研究のための UBC のセンターでインフラ資金の健康研究イノベーションとマイケル ・ スミス財団のカナダの財団を認めます。出版物のための資金は、LightIntegra テクノロジー株式会社、ThromboLUX の製造元によって提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
ThromboLUX-MLightIntegra Technology Inc. LPN120DLS System
ThromboSight SoftwareLightIntegra Technology Inc. LPN124DLS analysis software
CapillariesLightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE)LPN065Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated
MiniPet LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific)LPN082100 µL fixed volume pipette for sampling  
MicroFlex 1-200 µL Pipette tipsLightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific)LPN080Pipette tips for sampling
Critoseal LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific)LPN075Capillary Tube Sealant
Dukal Alcohol Pad or equivalentLightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.)LPN085Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol)
Control beads, 50 nm radiusLightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.)LPN128Control beads
Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µmPolySciences Inc.64060Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nmPolySciences Inc.64014-15Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 - 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Genesis BPS RapidSeal II or equivalentGenesis BPS428-SE640Tube sealer
Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalentFresenius Kabi6R4452Manual tube stripper
Biohazard Shield - Cell Counter or equivalentCardinalHealthS1389-75Splash Shield
Corning LSE Vortex Mixer or equivalentCorning Incorporated6775Vortex mixer
FACSCanto II Flow cytometer  with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalentBD Biosciences338960Flow cytometer

参考文献

  1. Dinkla, S., et al. Platelet microparticles inhibit IL-17 production by regulatory T cells through P-selectin. Blood. 127 (16), 1976-1986 (2016).
  2. Yin, W., Ghebrehiwet, B., Peerschke, E. I. Expression of complement components and inhibitors on platelet microparticles. Platelets. 19 (3), 225-233 (2008).
  3. Aatonen, M., Gronholm, M., Siljander, P. R. Platelet-derived microvesicles: multitalented participants in intercellular communication. Semin Thromb Hemost. 38 (1), 102-113 (2012).
  4. Suades, R., Padro, T., Alonso, R., Mata, P., Badimon, L. High levels of TSP1+/CD142+ platelet-derived microparticles characterise young patients with high cardiovascular risk and subclinical atherosclerosis. Thromb Haemost. 114 (6), 1310-1321 (2015).
  5. Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for "on-chip" qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosens Bioelectron. 93, 250-259 (2017).
  6. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  7. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Semin Thromb Hemost. 36 (8), 807-818 (2010).
  8. Lacroix, R., et al. Standardization of platelet-derived microparticle enumeration by flow cytometry with calibrated beads: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. J Thromb Haemost. 8 (11), 2571-2574 (2010).
  9. Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Lopez, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
  10. Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
  11. Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thromb Haemost. 103 (5), 1044-1052 (2010).
  12. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. van der Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. J Thromb Haemost. 11, 36-45 (2013).
  15. Boudreau, L. H., et al. Platelets release mitochondria serving as substrate for bactericidal group IIA-secreted phospholipase A2 to promote inflammation. Blood. 124 (14), 2173-2183 (2014).
  16. Rousseau, M., et al. Detection and quantification of microparticles from different cellular lineages using flow cytometry. Evaluation of the impact of secreted phospholipase A2 on microparticle assessment. PLoS One. 10 (1), 0116812 (2015).
  17. Groot Kormelink, T., et al. Prerequisites for the analysis and sorting of extracellular vesicle subpopulations by high-resolution flow cytometry. Cytometry A. 89 (2), 135-147 (2016).
  18. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  19. Maurer-Spurej, E., Larsen, R., Labrie, A., Heaton, A., Chipperfield, K. Microparticle content of platelet concentrates is predicted by donor microparticles and is altered by production methods and stress. Transfus Apher Sci. 55 (1), 35-43 (2016).
  20. Maurer-Spurej, E., et al. Platelet quality measured with dynamic light scattering correlates with transfusion outcome in hematologic malignancies. Transfusion. 49 (11), 2276-2284 (2009).
  21. Hess, J. R., et al. Clinical and laboratory correlates of platelet alloimmunization and refractoriness in the PLADO trial. Vox Sang. 111 (3), 281-291 (2016).
  22. Doughty, H. A., et al. Relative importance of immune and non-immune causes of platelet refractoriness. Vox Sang. 66 (3), 200-205 (1994).
  23. Vassallo, R. R., Norris, P. J. Can we "terminate" alloimmune platelet transfusion refractoriness. Transfusion. 56 (1), 19-22 (2016).
  24. Anderson, W., Kozak, D., Coleman, V. A., Jaemting, A. K., Trau, M. A comparative study of submicron particle sizing platforms: Accuracy, precision and resolution analysis of polydisperse particle size distributions. J colloid inter sci. 405, 322-330 (2013).
  25. Gyoergy, B., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. Plos One. 7 (11), 49726-49726 (2012).
  26. Urey, C., et al. Combining gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis (GEMMA), light scattering, field flow fractionation and cryo electron microscopy in a multidimensional approach to characterize liposomal carrier vesicles. Int J Pharm. 513 (1-2), 309-318 (2016).
  27. Mohr, K., et al. Evaluation of multifunctional liposomes in human blood serum by light scattering. Langmuir. 30 (49), 14954-14962 (2014).
  28. Maurer-Spurej, E., Brown, K., Labrie, A., Marziali, A., Glatter, O. Portable dynamic light scattering instrument and method for the measurement of blood platelet suspensions. Physics in Medicine and Biology. 51 (15), 3747-3758 (2006).
  29. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  30. Ambrose, A. R., Alsahli, M. A., Kurmani, S. A., Goodall, A. H. Comparison of the release of microRNAs and extracellular vesicles from platelets in response to different agonists. Platelets. , 1-9 (2017).
  31. Buzas, E. I., Gardiner, C., Lee, C., Smith, Z. J. Single particle analysis: Methods for detection of platelet extracellular vesicles in suspension (excluding flow cytometry). Platelets. 28 (3), 249-255 (2017).
  32. Stoner, S. A., et al. High sensitivity flow cytometry of membrane vesicles. Cytometry A. 89 (2), 196-206 (2016).
  33. Labrie, A., Marshall, A., Bedi, H., Maurer-Spurej, E. Characterization of platelet concentrates using dynamic light scattering. Transfus Med Hemother. 40 (2), 93-100 (2013).
  34. Ueba, T., et al. Plasma level of platelet-derived microparticles is associated with coronary heart disease risk score in healthy men. J Atheroscler Thromb. 17 (4), 342-349 (2010).
  35. Badimon, L., Suades, R., Fuentes, E., Palomo, I., Padro, T. Role of Platelet-Derived Microvesicles As Crosstalk Mediators in Atherothrombosis and Future Pharmacology Targets: A Link between Inflammation, Atherosclerosis, and Thrombosis. Front Pharmacol. 7, 293 (2016).
  36. Berezin, A. E., Kremzer, A. A., Berezina, T. A., Martovitskaya, Y. V. The pattern of circulating microparticles in patients with diabetes mellitus with asymptomatic atherosclerosis. Acta Clin Belg. 71 (1), 38-45 (2016).
  37. Marcoux, G., et al. Microparticle and mitochondrial release during extended storage of different types of platelet concentrates. Platelets. 28 (3), 272-280 (2017).
  38. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
  39. Reddoch, K. M., et al. Hemostatic function of apheresis platelets stored at 4 degrees C and 22 degrees C. Shock. 41, 54-61 (2014).
  40. Kelly, A. M., et al. The effect of variation in donor platelet function on transfusion outcome: a semirandomized controlled trial. Blood. 130 (2), 214-220 (2017).
  41. Peerschke, E. I., Yin, W., Ghebrehiwet, B. Platelet mediated complement activation. Adv Exp Med Biol. 632, 81-91 (2008).
  42. Redman, C. W., Sargent, I. L. Microparticles and immunomodulation in pregnancy and pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 61-67 (2007).
  43. Ripoche, J. Blood platelets and inflammation: their relationship with liver and digestive diseases. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 35 (5), 353-357 (2011).
  44. Ling, Z. L., Combes, V., Grau, G. E., King, N. J. Microparticles as immune regulators in infectious disease - an opinion. Front Immunol. 2, 67 (2011).
  45. Melki, I., Tessandier, N., Zufferey, A., Boilard, E. Platelet microvesicles in health and disease. Platelets. 28 (3), 214-221 (2017).
  46. Culibrk, B., et al. Application of the ADVIA cerebrospinal fluid assay to count residual red blood cells in blood components. Vox Sang. 103 (3), 186-193 (2012).
  47. Connolly, K. D., et al. Lipoprotein-apheresis reduces circulating microparticles in individuals with familial hypercholesterolemia. J Lipid Res. 55 (10), 2064-2072 (2014).
  48. Mork, M., et al. Prospects and limitations of antibody-mediated clearing of lipoproteins from blood plasma prior to nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1308779 (2017).
  49. Raczat, T., et al. The influence of four different anticoagulants on dynamic light scattering of platelets. Vox Sang. 107 (2), 196-199 (2014).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

131

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved