交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。

要約

これ以降のプロテオーム解析の架橋クロマチンのシーケンス固有のキャプチャに依存する特定のターゲット遺伝子の新規 DNA と相互作用する蛋白質を識別する方法です。潜在的な結合蛋白質、またセル変更についての事前知識も必要ありません。技術は、当初は酵母の開発、哺乳類細胞に対して適応を今されています。

要約

プロテオミクス (HyCCAPP) の技術のクロマチン蛋白の交配のキャプチャは、酵母の新規 DNA 蛋白質の相互作用を明らかにするために開発されました。対象地域にバインドされている可能性が高いタンパク質についての事前知識を必要とせず興味のターゲット領域の解析をことができます。これは、理論では、関心の任意のゲノム領域を分析に使用する HyCCAPP ができ、異なる電池で動作するように十分な柔軟性を提供します。このメソッドは、クロマチン免疫沈降 (チップ) とチップのようなメソッドに適しているタスク、知られている転写因子の結合部位を研究するためのものではありません。HyCCAPP の強みは、その能力のある限られた DNA 領域を探索するのにバインドされて蛋白質についての知識。それは、抗体を用いたタンパク質ベース クロマチンの濃縮によって導入されたバイアス (チップのようなメソッドに存在) を避けるために便利な方法ことができます。潜在的に、HyCCAPP は本当に新規 DNA 蛋白質の相互作用を明らかにする強力なツールをすることができます。これまでで、酵母、哺乳類細胞の系列を繰り返す高コピー技術は主に適用されています。我々 が思い描く強力なツールになる、HyCCAPP アプローチ哺乳類細胞における単一コピーの遺伝子座を効率的にキャプチャするように最適化する必要があります。HyCCAPP はひと細胞ラインにプロトコルをキャプチャし、シングル コピー クロマチン領域はこの修正されたプロトコルを効率的に分離することができますを表示最初の酵母の我々 の適応を紹介します。

概要

過去 10 年間に、シーケンス技術、大量のサンプルと驚異的な解像度にゲノムの広い範囲の研究の劇的な改善を見ています。百科事典の DNA 要素 (エンコード) コンソーシアムは、大規模な多施設共同努力、国立ヒトゲノム研究所国立衛生研究の主導がどのように個々 の転写因子に洞察力を提供しています。その他の規制の蛋白質にバインドし、ゲノムとの対話します。初期の努力は、100 以上知られている DNA 結合蛋白質¹のクロマチン免疫沈降 (チップ) により評価した特定の DNA 蛋白質の相互作用を特徴付けられます。DNase フット プリント²ホルムアルデヒド規制要素 (放任)³のアシストの分離は、タンパク質ではなく、明白な制限を操作するゲノムの特定の領域を検索する使用されているなどの代替方法をこれらの実験的アプローチは、相互作用の蛋白質を識別しません。過去年にわたって広範な努力にもかかわらず技術浮上しているない、クロマチンと同定蛋白質 DNA 相互作用の包括的な評価とクロマチン関連タンパク質の定量が効率的にできます。

この必要性に対処するため、我々 は Hybridization Capture of Chromatin-Associated タンパク質のプロテオミクス (HyCCAPP) と呼ばれる手法を開発しました。^5,6、アプローチ酵母^4,開発当初シーケンス固有の交配のキャプチャを使用して (バインドされたタンパク質) と利子の架橋クロマチン領域を分離します。タンパク質-DNA 複合体の分離後、興味のシーケンスにバインドされている蛋白質のセットを特徴付ける質量分析法などの方法を使用できます。したがって、その抗体に依存しない意味での新規 DNA 蛋白質の相互作用を明らかにする非バイアス アプローチは見つけられるかもしれない蛋白質について完全に依存しないものとしては、HyCCAPP を検討できます。明らかに小説 DNA と相互作用するタンパク質の⁷、しかし、最もチップのようなメソッド^8,9,10, プラスミッド挿入^{11,12に依存することができる他の方法があります。 13,14}、または高いコピー番号¹⁵の地域。対照的に、HyCCAPP はマルチとシングル コピー領域に適用できる、地域の蛋白質についての事前情報は必要ありません。さらに、上記が貴重な機能、特に DNA とタンパク質の架橋反応、HyCCAPP の独特の機能はシングル コピー領域に適用できることの必要性を回避変更セル、前述のメソッドのいくつかとせず推定結合蛋白質、または入手可能な抗体に関する知識。

この時点で、HyCCAPP 酵母^4,5,6、様々 なゲノム領域の解析に主に適用されている、アルファ衛星 DNA、リピート領域の蛋白質 DNA 相互作用の分析に使用された最近人間のゲノムの¹⁶。私たちの継続的な作業の一環として、我々 は酵母クロマチンひと細胞の分析を適用する、シングル コピー対象を選択的に捕獲を可能にする変更されたプロトコルを紹介するために開発の交配キャプチャ方法を適応しています。酵母における私たちの初期の研究に類似した効率と人間のゲノムにある地域。この新しい最適化されたプロトコルは今、適応および質量分析などの分析手法を用いたヒトゲノム全体蛋白質 DNA の相互作用を調査するテクノロジーの活用をことができます。

HyCCAPP メソッドの特定のターゲット領域の解析のためのものはまだゲノム解析に最適ではないことを強調することが重要です。技術は、相互作用の蛋白質の不足について地域を扱うとき、または特定ゲノム遺伝子座での相互作用の蛋白質のより包括的な詳細な解析が必要な場合に便利です。HyCCAPP は、明らかに DNA 結合蛋白質が genomic DNA の特定の蛋白質の結合サイトを正確に特徴づけるものです。現在の実装では、方法論は DNA 結合シーケンスまたは個々 の蛋白質のためのモチーフに関する情報を行いません。したがって、素敵なフェアなどの既存技術を補完する、初期の FAIRE 分析によって識別されるゲノム領域の新規結合蛋白質の同定ができます。

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プロトコル

1. キャプチャ オリゴヌクレオチド設計

1. 対象地域/s の交配キャプチャ中に使用するオリゴヌクレオチドのパネルをデザインします。
   1. 最低ではなく対象地域ごとに 4-8 オリゴヌクレオチドをデザイン、ターゲットにターゲット領域の各終わりに少なくとも 1 つのオリゴヌクレオチドのデザインを目指してください。
   2. ターゲット シーケンスが長い場合 (> 500 塩基対)、対象の地域全体にわたって効果的な濃縮クロマチンを保証するためにできるだけ広げてとしてオリゴヌクレオチドをデザインします。
      注: 我々 は 4-8 オリゴヌクレオチドと最適なキャプチャを観察しました。詳細オリゴヌクレオチドでうまく処理することができます、にもかかわらずあまりにも多くのオリゴヌクレオチドを使用する場合、濃縮収量の減少を観察することも珍しくはないです。
2. 同様の溶融温度とオリゴヌクレオチドを設計し、彼らはありません強力なヘアピンを形作るまた (交配は 42 ᵒC で実施される考慮して) 強い相互作用があるかどうかを確認します。
   注: 足掛かり溶出 (4.12.3) を選択する場合追加外部 8 塩基は、オリゴヌクレオチドに追加する必要があり、溶出¹⁷時 'リリース' の相補的なオリゴヌクレオチドが必要になります。オリゴヌクレオチドを分析し、いくつかの商用ソフトウェア ツールを使用できます。25 mers は良い結果を示しているが、ゲノムサイズとシーケンスによってキャプチャ オリゴヌクレオチドは 20-80 拠点間どこか含めることができます。通常は、キャプチャ オリゴヌクレオチドは 62 ᵒC に近い融点がの長さによって変わることができます。一貫性のある溶融温度および/またはキャプチャ ミックス全体のオリゴヌクレオチドの長さは、濃縮で不要な先入観を避けるため助けることができます。
3. 3' 末端をビオチン基 (できればキャプチャ シーケンスからスペーサーで区切られた) キャプチャ オリゴヌクレオチドをデザインします。

2. 細胞培養

1. 37 ᵒC で 5% CO₂(ここに示す GM12878) などヒトリンパ芽球細胞または 1% ペニシリン-ストレプトマイシン、2 mM L グルタミン 5% ウシ胎児血清 (FBS) と添加 RPMI 1640 メディアの他の細胞株に成長します。
   1. Seed 初期 RPMI 1640 メディアの 2.1 での 6 mL で T-25 フラスコの因数 (2-5 x 10 の⁵セル) を凍結します。
   2. 細胞の密度と生存率を監視します。
      1. 代表的な細胞の分注とトリパンなど適切な染料で青、それらを染色します。
      2. 診断または自動化された細胞カウンターを使用して細胞密度を測定します。
   3. セル 1 x 10⁶セル/ml の濃度に達すると、前に 5 分の 100 x g でセルをスピンダウンし、セルを RPMI 1640 メディアの 2.1 での 25 ml T-75 フラスコに転送します。細胞密度に近づく 1 x 10⁶セル/mL までセルを育てなさい。
   4. RPMI 1640 メディア (2.1) の 38 ml T-150 フラスコにセルを転送し、さらに 2 日間のセルの成長します。
      注: ヒトリンパ芽球様細胞は懸濁液で育ちます。ヒトリンパ芽球様細胞の成長のための一般的なガイドラインでは、0.2-1 x 10⁶セル/mL の間保たれる細胞密度をお勧めします。この技術に必要な材料の大きい量のため議定書意図的ものが一般的に使用されるを超えて細胞密度に細胞を成長に書き込まれます。細胞成長のプロトコルを修正し、使用する細胞の種類によってリーダーが適応できます。
   5. 5 分間 100 x g でセルをスピンダウン、RPMI 1640 メディア (2.1) の 10 mL の細胞を再懸濁します、メディアの 500 mL を含む 850 cm²ローラー ボトルに懸濁液を注ぐ。前に、と同じ条件の下のセルを孵化させなさいが、この時点で一定回転 (~0.5 rpm) の使用を開始します。
   6. 細胞の成長を監視し、(通常 3-4 日おき) を必要に応じてメディアを変更します。2 x 10⁶セル/mL (合計 1 x 10 の⁹セル) に可能な限り近い密度に成長する細胞をしましょう。
   7. 目的のセル数に達すると、100 × g で 5 分でダウン セルを回してセルを収穫し、RPMI 1640 メディア (2.1) の 36 mL の細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を 50 mL の円錐管に転送します。細胞数および DNA の抽出のための小さい因数を取る。
2. 最終濃度 1% に到達する 37% ホルムアルデヒドの 1 mL を追加することによって架橋。
   注意: ホルムアルデヒドは、発がん性物質発煙のフードで処理する必要があります。
   1. 回転セルを孵化させなさい (~ 30-60 rpm) 室温 (RT) で 10 分。
   2. 125 mM の最終的な集中のための 2.5 M グリシン溶液 2 mL を追加することによって架橋反応を抑制します。
   3. 回転セルを孵化させなさい (~ 30-60 rpm) ルートで 5 分間 5 分間 100 × g で遠心分離によって細胞をペレットし、氷冷 1x PBS で 2 回細胞を洗浄します。
3. 次のステップまたはセル換散バッファー (5 mM Hepes、85 mM KCl、0.5 %igepal, プロテアーゼ阻害薬 (PI)) 5 mL にペレットを再懸濁しますスナップ-凍結懸濁液液体窒素で一滴ずつを継続します。-80 ᵒC でサンプルを格納します。
   注: 準備 > Igepal と PI なしセル換散バッファーの 25 mL を使用する準備ができたら、これらの試薬の新鮮なを追加。Igepal と PI を追加したら、セル換散バッファーの長期保管を避けてください。4 ᵒC で 3 ヵ月のセル換散バッファーを格納します。Igepal は、非イオン性、非変化の洗剤です。NP 40 は潜在的代わりに Igepal を使用できますが、我々 はこのコンテキストでそれを使用していないサンプルを最終的に DNA 結合蛋白質を特徴付けるための質量分析法で分析するとき、NP 40 は推奨されていませんように。

3. 溶解とせん断

1. 準備 > 15 mL の核溶解バッファー (10 mM EDTA、50 mM Tris pH 8.0、1 %sds、PI)。
   注: 追加 PI 新鮮なただ金額が使用されます。PI を追加したら核の換散バッファーの長期保管を避けてください。核の換散バッファーは、1 ヶ月常温保存できます。
2. セル換散バッファー (Igepal と PI を含む) 20 mL にペレットを再懸濁します。一度融解したものを氷の上に解凍し、ミックスのペレットにしましょう。サンプルを氷の上にさらに 10 分間座ってみましょう。400 の x g で 5 分の 4 の ᵒC で細胞を遠心します。
3. 上澄みを廃棄し、PI と核換散バッファーの 6 mL の細胞を再懸濁します (細胞懸濁液を形成しない場合ボリュームが増加することができます)。
4. 超音波処理の準備で、~ 6-8 で均等にサンプルを分割 (各チューブの 600 に 1,000 μ L) の microfuge の管。
   1. 氷や冷たいラック上サンプルを配置し、陰極と、超音波発生装置を使用してサンプルを超音波照射します。5 x 20 s 一定バースト、サスペンションが少なくとも 40 の冷却を許可すると 65% 振幅を使用するパルス間の s。
      注: ボリュームを増やす場合 > 10 mL のサンプルでは、セルを冷却ガラスあたりを代わりに使用することができます。ますます長いバーストが必要になりますし。Sonicators は大きく異なります。条件は、リーダーによって最適化する必要があります。他の超音波処理の選択肢を同様に使用できます。
5. 4 ᵒC で 10 分間 12,000 × g で細胞を遠心、上清を新しいチューブに転送し、ペレットを破棄します。
6. 蛍光法を用いた総復旧時を推定します。
7. 次のステップまたはスナップ凍結し-80 ᵒC でサンプルを保存し続けます。
8. オプション: 0.3 M の NaCl の 67 ᵒC の一夜インキュベーションそれで割り切れる、逆クロスを取る。DNA をきれいにしバイオアナライザー フラグメントの長さを決定するためにそれを実行します。フラグメントのバルクは、500、1,000 bp の間でなければなりません。
   注: この時点で停止し、-80 ᵒC でサンプルを保存する [ok] です。

4. 交配キャプチャ

1. 交配 (Hyb) バッファー x 2 の 500 mL を準備 (200 mM MES の 2 M の NaCl、40 ミリメートルの EDTA、0.02% Tween 20) と 500 mL の洗浄バッファー (200 mM NaCl、0.2% SDS 50 mM Tris pH 8)。Hyb と保存の洗浄バッファー 4 ᵒC で室内の温度、それぞれ、3 ヶ月間。2 x Hyb バッファーの半分を使用して交配バッファー × 1 を準備します。また 4 ᵒC で 3 ヶ月間保管してください。
   注: 前の手順で作成されたサンプルの体積の 2 倍になります交配キャプチャの総量 (前述のこれまでのところ、試料の量は約 6 mL になるし、こうして合計交配ボリューム 12 mL になる)。
2. 合計交配キャプチャ ボリューム (この場合は 600 μ L) の 5% と等しいビーズ置いておきます。次の手順でビーズを使用する適切な適当な磁石です。
3. X Hyb バッファー 2 倍ビーズのボリューム (1200 μ L) を使用して 1 にビードを 3 回洗浄しなさい。Hyb バッファー x 2 の 1,200 μ L でビーズを再懸濁します。ソリューションを消去するまで、磁石にチューブを配置し、バッファーを削除します。
4. 最大 700 μ 管ごとにサンプルの 1.5 mL の microfuge の管の前清算反応を実行します。十分なビーズ (5%) と 2 倍 (600 μ L のサンプル、Hyb バッファー x 2 で再停止される洗浄ビーズの 120 μ L 480 μ Hyb バッファー x 2 と 10 の管) x 1 Hyb バッファーをうすめる Hyb バッファーを追加します。最後の回転端 31 ᵒC で 10 分間インキュベートそれら (~ 30-60 rpm)。
5. ビーズに固定化し、新しいチューブにサンプルを転送するまで、磁石にチューブを置きます。ビーズを破棄します。
   注: このポイントから低バインド チューブが推奨されます。
6. 10 pmol/μ L の実用的なソリューションをキャプチャ オリゴヌクレオチドを再懸濁します、各チューブにこのソリューションの 4 μ L を追加します。
   注: さまざまな地域はお互いのためコントロールとして機能することができますが、真陰性対照としてスクランブルそのシーケンスでキャプチャ オリゴヌクレオチドを含めることをお勧めです。
7. 最後の回転で終わりと 42 ᵒC で 40 分間チューブを孵化させなさい (~ 30-60 rpm)。
8. 、インキュベーション中に必要なビーズ (0.3 μ L/キャプチャ オリゴヌクレオチドの pmol) 置いておきます。4.3、手順の説明に従って、ビーズを 3 回洗浄が、Hyb バッファー x 1 の細胞を再懸濁します。
9. サンプルに洗浄のビーズを追加し、最後の回転で終わりと RT で 30 分のサンプルをインキュベート (~ 30-60 rpm)。磁石にチューブを置き、ビーズが固定化されて後、上清を削除します。
10. ビーズを洗浄
    1. 1.2 mL の洗浄バッファーを追加し、最後の回転で終了 5 分のサンプルをインキュベート (~ 30-60 rpm) 磁石と待機した場所管でソリューションまでの分のカップルをクリアします。バッファーを削除し、この手順を繰り返します。
    2. 1.2 mL の洗浄バッファーを追加し、最後の回転で終わりで 1 h インキュベート (30 ~ 60 rpm) 室温磁石に管を配置し、ソリューション クリアまで分のカップルを待ちます。バッファーを削除し、2 回目から 30 分インキュベーション時間を短縮この手順を繰り返します。
    3. 洗浄バッファーの 200 μ L を追加し、最後の回転で終わり 15 分インキュベート (~ 30-60 rpm) 31 ᵒC で。磁石のチューブ、ソリューション クリアまで幾つかの分を待ちます。バッファーを削除します。
    4. 200 μ L の PBS を追加し、最後の回転で終了 5 分インキュベート (~ 30-60 rpm) 室温磁石に管を配置し、ソリューション クリアまで分のカップルを待ちます。バッファーを削除し、この手順を繰り返します。
11. 単純な溶出
    1. ビーズに分子グレードの水の 40 μ L を追加し、5 分の 94 の ᵒC でそれを孵化させなさい。
    2. 磁石のチューブ、ソリューションをクリアするまでに数分を待ちます。
    3. 新しいチューブに上清を移します。ビーズを破棄します。
    4. プロテオーム解析に進むか-80 ᵒC でサンプルを格納します。
       注: この種類の溶出作品後 qPCR の分析といくつかのプロテオミクスの測定は、他のインスタンスでは収量「クリーナー」波は以下 2 つの代替アプローチ。
12. DNase 溶出します。
    1. 各チューブに DNase バッファー x 1 と DNase の 2 U の 40 μ L を追加します。
    2. 37 ᵒC で 15 分間チューブを孵化させなさい。
    3. 磁石にチューブを置き、ソリューションをクリアするまでの分のカップルを待ちます。
    4. ビーズから溶出サンプルを削除し、新しい低バインド チューブのサンプルを配置します。
    5. 酵素を不活性化し、プロテオーム解析に進む 7 分 94 ᵒC でチューブを孵化させなさい。
       注: プロテオーム解析との干渉が発生した場合は、濃度 DNase を使用できます。DNase 処理は完全にサンプルの DNA の材料を破壊するので、この溶出メソッドを使用する場合、qPCR によるキャプチャ濃縮を計算することはできません。
    6. プロテオーム解析に進むか-80 ᵒC でサンプルを格納します。
13. 足掛かり溶出¹⁷。
    注: この方法は長いオリゴヌクレオチドのため推奨されません (> 40 拠点)。このメソッドは、ゲノム配列と重複しない追加の 8 拠点を含むキャプチャ オリゴヌクレオチドおよびキャプチャ オリゴヌクレオチドからターゲットを転置するために相補的なリリース オリゴヌクレオチドの必要があります。
    1. SSC バッファーの 40 μ L でリリース オリゴヌクレオチドの 2 nanomoles を希釈します。
    2. 室温に 20 分間インキュベートします。
    3. 磁石のチューブ、ソリューションをクリアするまでに数分を待ちます。
    4. ビーズからソリューションを削除します。
    5. プロテオーム解析に進むか-80 ᵒC でサンプルを格納します。

5 興味のターゲットをキャプチャ領域のためのプライマーと qPCR による降伏をキャプチャの評価

1. プライマーとプローブ ターゲット領域の設計、適切なソフトウェアまたはオンラインのツールを使用します。
   注意: この実験では、 DUSP3とDUSP5のプロモーター領域が対象だった。プライマーとプローブは、次のとおりです。DUSP3: プライマー 1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC、プライマー 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG、FAM ラベル プローブ - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG;DUSP5: プライマー 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC、プライマー 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG、FAM ラベル プローブ TGC ATT タグ AGC AGC CAG ATG AGG TT。
2. (以上 10 μ L)、溶出液の因数を取り出して希釈 1:10 分子グレード H₂o.
3. 2.1.7 の手順で撮影した因数の 1 つの DNA を抽出し、その DNA のサンプルを使用して、5 つシリアル 1:10 分子の希釈グレード H₂o. により標準曲線を作る
4. QPCR マスター ミックス (さまざまな商業代わり) を準備のプライマーとプローブを追加して、適切な量 (15 μ L の 20 μ L 反応を実行している場合) を各ウェルに分配します。
5. いずれかの追加 5 μ L:) 希釈サンプル、b) の標準カーブまたは c) 分子グレード H₂O (テンプレートなしのコントロールとなる) を各ウェルに。
6. プレート シールし、1 分 100 × g で遠心分離します。
7. 次のパラメーターと qPCR システムで実行: 95 ᵒC で 5 分は続いて 40 サイクル 95 ᵒC の 20 s、20 59 ᵒC s と 25 の 72 ᵒC s。
8. キャプチャの特異性を評価するためにロバの利回りとスクランブルのキャプチャに標準曲線を使用します。

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結果

クロマチンの入力量が多い HyCCAPP を成功させるために必要な細胞は密度の比較的高いレベルに成長してください。トリパン ブルー染色の細胞死亡率が中程度であることが確認される (< 10%)。シングル コピー実験、クロマチン コンテンツ交配キャプチャ フェムトモルの範囲である必要する前に少なくとも 10 の⁹セル開始材料として通常必要とします。実物大実...

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ディスカッション

ここで説明した HyCCAPP メソッドには、とらえどころのないまま、ある DNA 相互作用を明らかにする強力なアプローチは、多くのユニークな機能があります。プロセスの性質は、HyCCAPP に異なった有機体とゲノムの領域で動作する柔軟性を与えます。メソッドは、しかし、いくつかの制限があると見なす。

HyCCAPP は、適用される初代培養細胞、細胞培養システム、またはも?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PrimerQuest tool	IDT
OligoAnalyzer 3.1	IDT		Analyze capture oligonucleotids
PairFold	UBC		Analyze interactions
RPMI 1640 media	Thermo Fisher	11875093
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	26140079
Countess automated cell counter	Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle	Greiner Bio-one	680058
Roller system	Wheaton	22-288-525
37 % formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
Glycine	Sigma-Aldrich
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P4380
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Branson digital sonifier SFX 150	Emerson
Qubit 3.0 fluorometer	Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit	Thermo Fisher	Q32850
Bioanalyzer 2100	Agilent
Agilent DNA 1000 kit	Agilent	5067-1504
MES sodium salt	Sigma-Aldrich	M3885
NaCl 5M	Thermo Fisher	AM9760G
EDTA	Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet	Thermo Fisher	12321D
DynaMag-15 magnet	Thermo Fisher	12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin	Thermo Fisher	60210
Low binding tubes	Eppendorf	22431081
Hybridization oven	SciGene
Tube shaker and rotator	Thermo Fisher	415110Q
DNase I (RNase-free)	New England BioLabs	M0303
SSC buffer 20× concentrate	Sigma-Aldrich	S6639