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要約

この研究は、マウスの心を研究するのに光クリアと組み合わせて両面イルミネーション ライト シート蛍光顕微鏡 (LSFM) 法を使用します。

要約

光シート蛍光顕微鏡は、ミリメートル単位にマイクロメータから高軸分解能高速イメージ獲得のため広く使用されています。伝統的な光シート テクニックには、単一の照明ビーム直交サンプル組織での使用が含まれます。単一の照明ビームを駆使して生産される大型サンプルの画像はストライプまたは成果物を含めるし、組織によって光の吸収と散乱のため低解像度に苦しみます。本研究では両面照射ビームと簡略化された透明度の光学マウスの心法をクリアします。これらのテクニックは、心の底から脂質を除去することによってより深いイメージングを可能にして、イメージング、10 × 10 × 10 mm3以上の大規模なフィールドを作り出します。その結果、この方法により心室の大きさを定量化、心臓の系統を追跡し心臓特異的蛋白と十分なコントラストを持つ成体マウス心に出生後からイオン チャネルの空間分布をローカライズし、解像度。

概要

光シート蛍光顕微鏡は、1903 年に最初に開発された技術をされ、遺伝子発現を研究する、また組織サンプル1,2,3の 3 D または 4 D モデルを生成する方法として今日使用されています。このイメージング法は、飛行機だけは探知器によってキャプチャされるようにサンプルの 1 つの平面を照らす光の薄いシートを使用します。キャプチャする、サンプルの軸方向に移動できるし、レイヤー、一度に 1 つのセクションと、取得した画像4の後処理後 3-D モデルをレンダリングします。ただし、吸収と散乱のため LSFM は、いずれかの数ミクロンまたは光学的に透明な1サンプルに制限されています。

LSFM の制限は、ゼブラフィッシュなど、光学的に透明な組織を持っている生物の広範な研究につながっています。人間とゼブラフィッシュ5,6の間保存の遺伝子があるので、心臓発生と分化を含む研究はゼブラフィッシュに行われる。これらの研究は、心筋症6,7に関連する心臓の研究の進歩につながっている、まだ哺乳類などの上位の生物に似たような研究を実施する必要性があります。

哺乳類心筋厚と組織、赤血球、および伝統的な LSFM の方法1の下でサンプルの片面照射により発生するストライピング ヘモグロビンによる吸収の不透明度のための課題します。,8します。 これらの制限を補うために提案した両面イルミネーションと屈折率マッチング ソリューション (リム) と組み合わせてわかりやすくテクニック9の簡易版を使用します。したがって、このシステムは、イメージングが8機の軸方向と横方向で良い品質の解像度を維持しながら 10 mm3 x 10 x 10 より大きいサンプルのためことができます。

このシステムでは、ガラス チューブ内の異なる構成で整理される蛍光ビーズを用いた校正された最初。その後、システムは、出生後、大人のマウスの心のイメージを使用されました。まず、7 日 (P7)、心室、心室壁の厚さ、弁構造肉の存在を明らかにするため出生後マウスの心臓をイメージしました。第二に、Cre 標識心筋と黄色い蛍光蛋白質 (YFP) 1 日 (P1) に出生後マウスの心臓を用いた心筋細胞に区別するとセルを識別するために調査しました。最後に、遺伝子療法8後腎外側延髄カリウムの存在 (ROMK) チャンネルを観察する 7.5 ヶ月で成体マウスをイメージしました。

プロトコル

動物の使用を含むすべての手続きは、カリフォルニア大学ロサンゼルス、カリフォルニア州で制度検討委員会 (IACUC) によって承認されています。

1. イメージング システム セットアップ

注: は、図 1および図 2を参照してください。

  1. 3 波長の連続波 (CW) レーザーを取得: 405 nm、473 nm と 532 nm。場所 2 ミラー (M1、M2) 150 mm 離れてビームに 45 ° のミラー面に合わせて整列します。
    注: この手順を実行両面の照明セットアップからレーザーをリダイレクトします。結果のビームは最初のビームと同じ方向になります。
  2. 0 - の光学濃度範囲で、直径 25 mm の虹彩絞り/ピンホール (PH) 直径 50 mm 中性密度フィルター (NDF) を梁を渡す 4.0、ビーム拡大器 (BE) の幅で 30 mm スリット (S) ~ 0 - 6 ミリメートル、およびミラー (M3)、すべては互いから 150 mm を配置。ビームに 45 ° で、ミラー平面が付いているミラーを配置します。
  3. M3 から 150 mm を配置 50: 50 ビームスプリッターを介してビームを渡します。ビームスプリッターから 150 mm ミラー (M6) を置き、そのミラー平面が 45 ° 前方に放出されるビームになるよう合わせます。反射されたビームを使用して、デュアル照明光シートの片側を形成します。
  4. ビームスプリッターから 150 mm ミラー (M4) を置き、そのミラー平面は 45 ° ビームスプリッターから 90 ° の角度で生成されたビームになるよう。2 番目のミラー (M5) M4 から 150 mm を置き、そのミラー平面は 45 ° M6 から反射されたビームになるようです。M5 から放出されるビームを使用して、デュアル照明光シートの 2 番目の面を形成します。
  5. 対称的に両面照明システムを設定 (図 1参照)。1 つ円筒レンズ (CL1) [直径 (d); 1 = 焦点距離 (f) = 50 mm] 150 mm M6 デュアル照明 setu の反対側から放出されるビームに沿って 1 つの側面で別の同一円筒レンズ (CL2) M5 から放出されるビームに沿って 150 mmp. ミラーを置く 2 (M7 および M8) 各シリンドリカル レンズに合わせて 90 ° ビームを反映するように 50 mm の距離で。
  6. 色消しレンズのペアを形成します。最初のレンズ、L1 (d; 1 = f = 100 mm)、M7 と第二のレンズ、L2 から 100 mm (d; 1 = f = 60 mm)、L1 から 160 mm。M8 から同じ距離を置いた同一レンズ (L3、L4) とデュアル照明の他の側にこれを繰り返します。
  7. 場所ミラー, M9、M10、L2 および L4、レンズから 60 ミリメートル, とビームに沿って。OL1 と OL2 照明目的の場所 (d; 2 = f = 150 mm)、梁に沿って M9、M10 から 150 mm。目的から放出されるビームは、試料のイメージングのための光シートを形成します。
  8. アクリロニ トリル ・ ブタジエン ・ スチレン (ABS) から試料ホルダーを印刷するのに 3 D プリンターを使用します。カバーのガラスの部分を埋め込む [屈折率 (RI) = 1.4745] 室内には、屈折のミスマッチを最小限に抑えるため、照明ビームに垂直の各側に。対物レンズから放出されるビームの間にチャンバーを均等に配置します。
  9. ステレオ顕微鏡倍率客観的かつ科学的な相補的金属酸化物半導体 (sCMOS) カメラの照明に垂直な X 1 面 (図 2を参照) をインストールします。

2. イメージング システム校正

  1. 直径 0.53 μ m は、蛍光のポリスチレン ビーズを取得します。
  2. 1: 150, 000 に 1% 低溶融ポインティング agarose が付いて屈折率マッチング ソリューション (リム) のビーズ ソリューションを希釈して蛍光ビーズ サンプルを準備します。30 mm の距離に 12 mm の内径と外径 18 mm のホウケイ酸ガラス管の部分をカットします。
    メモ: ホウケイ酸ガラス管は、屈折 (1.47) を一致するように使用されます。
  3. 1% の agarose が付いて希薄ビード サンプルをミックスし、ビーズ/アガロース溶液をピペット ホウケイ酸チューブに。常温 (23 ° C) を固めるアガロースを許可します。
  4. 99.5% グリセロールの解決で (ステップ 1.7) から ABS 室を埋めます。チャンバー内ビーズを含むホウケイ酸ガラス管を配置します。それはデュアル照明システムが作成したガウス ビームの中心部で、イメージング システムの ABS のチャンバーを配置します。
  5. 三次元電動並進ステージを付ける動きと ABS チャンバー内サンプルの向きを制御するホウケイ酸ガラス管 (補足図 1を参照)。
  6. 30 フレーム/秒 (fps) のレートで sCMOS カメラを使用して画像を取得します。モーター コント ローラーを使用して、横方向にサンプル 1 mm を移動し、sCMOS カメラを使用して各 1 mm ピッチで画像を取得します。サンプル全体のイメージまで続行します。
  7. 可視化ソフトウェアを使用して取得した画像をスタック (材料の表を参照してください)。これらのビーズ画像を用いたシステムの点拡がり関数 (PSF) を測定します。画像は、後の手順で処理中にデコンボリューションのこの PSF を使用します。

3. サンプル準備

  1. P1 野生型マウスと Rosa26 YFP 遺伝子をもつ二重ヘテロ接合体 sarcolipin Cre knockin マウスからの心を解剖 (SlnCre/+;R26YFP 記者/+) P7 で。
    注: 安楽死ペントバルビ タールとロビンスらで説明する手法を使用して実行されました。10. 国民の中心、肺および血の協会 (NHLBI)10,11で説明する手法によると郭清を行った。
  2. 前述のケビン成らによってネズミの心のクリア化学を実行します。12。
    注: 使用されている化学物質、有毒であるので次の手順が実行ヒューム フードにする必要があります。
    1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 3 × 1 で心を洗い 10 分 x。洗浄した後、4% パラホルムアルデヒド溶液に心を置き、4 ° C でこれらのサンプルを一晩インキュベートします。
    2. 4% アクリルアミド溶液 0.5 %w/v 2, 2'-アゾビス塩酸にサンプルを配置します。4 ° C で一晩インキュベートするサンプルを許可します。一晩インキュベートした後、サンプルを削除し、2-3 h の 37 ° C でそれらを孵化させなさい。
    3. PBS でサンプルをすすいで 8 %w/v ドデシル硫酸ナトリウムと 1.25 %w/v ホウ酸溶液に配置。彼らが明らかになるまでは、37 ° C でサンプルをインキュベートします。試料の厚みに応じて数時間をかかるでしょう。後、サンプルを削除し、リン酸緩衝生理食塩水 x 1 に 1 日置いてください。
    4. 40 g イオン密度勾配媒体の解決策に一致する屈折の準備 (材料の表を参照してください) 0.02 M のリン酸バッファー (PB) は、0.1% アジ化ナトリウム、Tween 20 と 0.01% の 30 mL で。水酸化ナトリウム 7.5 の pH にソリューションをもたらします。
  3. 屈折率 1.46 1.48 と 1% のアガロースのリムにクリアされたサンプルを配置します。ホウケイ酸ガラス管に試料を挿入でき、アガロース室温 (23 ° C) で凝固します。
  4. 三次元電動並進ステージを動きを制御するホウケイ酸ガラス管に接続し、3次元内でサンプルの向き印刷 ABS 商工会議所 (補足図 1を参照)。

4. 成人の心臓イメージング

  1. 2 月野生型 (C57BL/6) マウスの尾静脈に 100 μ L のボリュームの特定の心臓トロポニン T プロモーター (cTnT) と緑色蛍光タンパク質 (GFP) を含む 10 型アデノ随伴ウイルスベクター 9 の12ウイルス (AAV9) x 8.7 を挿入します。
    注: AAV9 元らによって記述された手法によると開発されました。13。 これが原因で腎外側延髄カリウム チャネル (ROMK) AAV9 cTnT ROMK GFP を生産にバインドする GFP (材料の表を参照してください)。
  2. NHLBI11で説明する手法によると年齢の 7.5 ヶ月で成体マウスの心を解剖します。ステップ 3.1 3.3 を使用してサンプルを準備します。
  3. 電動アクチュエータにモーター コント ローラーを接続します。アクチュエータの動きを制御するホウケイ酸ガラス管を付けるし、3次元内でサンプルの向き印刷 ABS 商工会議所。
  4. サンプルの位置で、デュアル照明システムが作成したガウス ビームの中心です。100 fps のレートで sCMOS カメラを使用して画像を取得します。
  5. モーター コント ローラーを使用すると、軸方向にサンプル 1 mm を移動し、sCMOS カメラで各 1 mm ピッチで画像を取得します。サンプル全体のイメージまで続行します。
    注: システムは、独自に開発した計測器制御ソフトウェアによって制御されます。
  6. 可視化ソフトウェアを使用して取得した画像をスタック (材料の表を参照してください)。これらの画像のスタックと可視化ソフトウェア14を使用して 3次元画像を開発します。取得した画像のスタックのステップ 2.6 から PSF を deconvolve します。心の輪郭を観察し、この輝度に基づく画像を擬似カラーを追加ピクセルのしきい値の輝度値を設定します。

結果

ここで説明する手法は深いイメージング深さと十分な解像度の画像 (図 1) とより大きい画像ボリュームを達成するためにマウス心臓組織サンプルの光クリアと組み合わせて両面照射ビームを使用しました。システムを校正するため、蛍光ビーズ イメージング システム内でガラス管の中に置かれました。ビーズがイメージ x y 平面、y-z 平面で可?...

ディスカッション

LSFM システムとここで説明する手法は、その開発の出生後の大人の段階からイメージ マウスの心臓に光クリアと組み合わせて両面照射ビームを採用しています。伝統的な単一の照明光は光子散乱と吸収より厚くより大きい組織のサンプル1,3から苦しんでいます。両面梁は、サンプルでは、ストライピングや一方的な照明によって生成された画像で?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、イメージへマウス サンプルを提供するためカリフォルニア大学ロサンゼルス校からグエン ・ テ ・ タオと中野敦に感謝を表したいと思います。この研究は、NIH の HL118650 (Tzung, Hsiai) に、HL083015 (Tzung, Hsiai) に、(N. C. チーと Tzung k. Hsiai.) に HD069305、HL111437 (Tzung, Hsiai n. C. チーし)、HL129727 (Tzung, Hsiai) に、テキサス大学システムは補助金の星 (柱賢への資金によって支えられました。イ)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
CW LaserLaserglow TechnologiesLMM-GBV1-PF3-00300-05Excitation of fluorophores
Neutral density filterThorlabsNDC-50C-4MControls amount of light entering system
Achromatic beam expanderThorlabsGBE05-AExpands the beam of light
Mechanical slitThorlabsVA100CControls width of beam
Beam splitterThorlabsBS013Forms dual-illumination beam
Stereo microscope with 1X objective lenseOlympusMVX10Used for observation of sample
ORCA-Flash4.0 LT sCMOS cameraHamamatsu PhotonicsC11440-42UUsed to capture Images
Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)StratasysuPrintMaterial used to 3-D print a sample holder
Fluorescent polystyrene beadsSpherotech IncPP-05-10Used for imaging system calibration
Borosilicate glass tubingCorningPyrex 7740Tubing for sample embedding
GlycerolFisher ScientificBP229-4Fill for sample chamber
Phosphate-buffered salineFisher ScientificBP39920Rinse solution for mouse hearts
ParaformaldehydeElectron microscopy sciencesRT-15700First incubation solution
AcrylamideWako ChemicalsAAL-107Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts
2,2'-Azobis dihydrochlorideWako ChemicalsVA-044Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts
Sodium dodecyl sulfate Sigma Aldrich71725Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts
Boric acidFischer ScientificA74-1Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts
Sigma D2158Sigma AldrichD2158Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution
Tween-20Sigma Aldrich11332465001Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution
Sodium azideSigma AldrichS2002Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution
Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFPVector BiolabsVB2045Expresses GFP when bound to ROMK
DC Servo Motor ActuatorThorlabsZ825BUsed for movement of sample in axial direction within light sheet
K-Cube Brushed DC Servo Motor ControllerThorlabsKDC101Connects to motor actuator and controls movement of the actuator
AmiraFEI SoftwareN/AVisualization software for producing 2-D and 3-D images

参考文献

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