Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino

Riepilogo

Questo studio utilizza una tecnica di microscopia (LSFM) foglio di luce di fluorescenza-retro illuminazione combinata con compensazione ottica per studiare il cuore murino.

Abstract

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio è stato ampiamente utilizzata per l'acquisizione rapida immagine con un'alta risoluzione assiale da micrometro scala del millimetro. Tecniche tradizionali di luce-foglio implicano l'uso di un fascio di illuminazione singola direzionato ortogonalmente al tessuto dell'esempio. Immagini di grandi campioni che sono prodotte utilizzando un fascio di illuminazione singola contengono strisce o artefatti e soffrono di una risoluzione ridotta dovuto la dispersione e l'assorbimento della luce da parte del tessuto. Questo studio utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione e una semplificata chiarezza ottica, tecniche di taglio per il cuore murino. Queste tecniche permettono di imaging più profondo rimuovendo i lipidi dal cuore e producono un grande campo di formazione immagine, maggiore di 10 x 10 x 10 mm³. Di conseguenza, questa strategia permette di quantificare le dimensioni ventricolari, traccia la linea cardiaca e localizzare la distribuzione spaziale delle proteine cardiache specifiche e canali ionici da post-natali ai cuori di topo adulto con sufficiente contrasto e ad alta risoluzione.

Introduzione

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio era una tecnica sviluppata nel 1903 ed è usata oggi come un metodo per studiare l'espressione genica ed anche a produrre modelli 3D o 4D di tessuto campioni^1,2,3. Questo metodo di imaging utilizza un sottile foglio di luce per illuminare un unico piano di un campione in modo che solo quell'aereo è catturato dal rivelatore. Il campione può quindi essere spostato in direzione assiale per catturare ogni strato, una sezione alla volta e il rendering di un modello 3D dopo il post-processing delle immagini acquisite⁴. Tuttavia, dovuto l'assorbimento e la dispersione dei fotoni, LSFM è stato limitato ai campioni che sono entrambi a pochi micron di spessore o sono otticamente trasparente¹.

Le limitazioni di LSFM hanno portato a studi approfonditi di organismi che hanno i tessuti che sono otticamente trasparenti, come il pesce zebra. Studi condotti su differenziazione e sviluppo cardiaco sono spesso condotte su zebrafish poiché ci sono geni conservati tra esseri umani e zebrafish^5,6. Anche se questi studi hanno portato a progressi nella ricerca cardiaca legate a cardiomiopatie^6,7, c'è ancora la necessità di condurre una simile ricerca sugli organismi di livello superiore come i mammiferi.

Mammiferi del tessuto cardiaco presenta una sfida a causa dello spessore e l'opacità del tessuto, l'assorbimento a causa dell'emoglobina nei globuli rossi e lo striping che si verifica a causa di illuminazione unilaterale del campione sotto tradizionale LSFM metodi^{1 , 8}. per compensare queste limitazioni, abbiamo proposto di utilizzare-retro illuminazione e una versione semplificata della chiarezza tecnica⁹ combinati con un indice di rifrazione corrispondente soluzione (cerchi). Di conseguenza, questo sistema permette l'imaging di un campione che è maggiore di 10 x 10 x 10 mm³ mentre mantenendo una buona qualità risoluzione assiale e laterale piani⁸.

Questo sistema è stato calibrato prima utilizzando perline fluorescenti disposti in diverse configurazioni all'interno della tubazione di vetro. Quindi, il sistema è stato usato all'immagine cuori murini postnatali e adulti. In primo luogo, il cuore del topo postnatale era imaged in 7 giorni (P7) per rivelare la cavità ventricolare, lo spessore della parete ventricolare, le strutture di valvola e la presenza di trabeculation. In secondo luogo, è stato condotto uno studio per identificare le celle che vuoi differenziare in cardiomiociti utilizzando un cuore del topo postnatale al giorno 1 (P1) con Cre-labeled cardiomiociti e la proteina fluorescente gialla (YFP). Infine, topi adulti a 7,5 mesi erano imaged per osservare la presenza di potassio midollare esterna renale canali (ROMK) dopo la terapia di gene⁸.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state approvate da comitati di revisione istituzionale (IACUC) presso la University of California, Los Angeles, California.

1. imaging System Setup

Nota: Vedere Figura 1 e Figura 2.

1. Recuperare un laser ad onda continua (CW) con 3 lunghezze d'onda: 405 nm, 473 nm e 532 nm. Posto 2 specchi (M1 e M2) distanza di 150 mm e allinearli con i loro aerei di specchio a 45° alla trave.
   Nota: Questo passaggio viene eseguito per reindirizzare il laser lontano il setup di fronte-retro illuminazione. Il fascio risultante sarà nella stessa direzione del raggio iniziale.
2. Passare il raggio attraverso un diametro di 25 mm diaframma/pinhole (PH), un filtro di densità neutra (NDF) di diametro 50 mm con una gamma di densità ottica pari a 0 - 4.0, un espansore del fascio (BE), una fessura di 30 mm (S) con la larghezza di ~ 0 - 6 mm e uno specchio (M3) , tutti posizionati 150 mm da altro. Posizionare lo specchio con il suo piano di specchiatura a 45° alla trave.
3. Passare il raggio attraverso un divisore di fascio di 50: 50 a 150 mm dalla M3. Posizionare uno specchio (M6) 150 mm dal divisore di fascio e allinearlo in modo che il piano di specchiatura è a 45° per la trave che viene emesso in avanti. Utilizzare il fascio riflesso per formare un lato del foglio doppio-illuminazione luce.
4. Posizionare uno specchio (M4) 150 mm dal divisore di fascio e allinearlo in modo che il piano di specchiatura è a 45° per la trave che è stata emessa ad un angolo di 90° dal divisore di fascio. Inserire un secondo specchio (M5) 150 mm dalla M4 e allinearlo affinché il piano di specchiatura è a 45° per il fascio riflettuto da M6. Utilizzare il fascio emesso dalla M5 per formare il secondo lato del foglio doppio-illuminazione luce.
5. Impostare il sistema di illuminazione su due lati in modo simmetrico (Vedi Figura 1). Inserire una lente cilindrica (CL1) [Diametro (d) = 1; lunghezza focale (f) = 50 mm] 150 mm in linea con il fascio emesso dalla M5 su un lato e un altro identico lente cilindrica (CL2) 150 mm in linea con il fascio emesso dalla M6 sul lato opposto della setu dual-illuminazione p. Posizionare 2 specchi (M7 e M8) ogni in linea con le lenti cilindriche a distanza di 50 mm per riflettere il fascio a 90 °.
6. Formare un doppietto acromatico da un paio di lenti. Posizionare il primo obiettivo, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm da M7 e la seconda lente, L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm da L1. Ripetere che questo sul lato opposto del doppio-illuminazione con obiettivi identici (L3, L4) posizionato alla stessa distanza da M8.
7. Posto specchi, M9 e M10, 60mm da lenti L2 e L4, rispettivamente e in linea con il fascio. Posizionare gli obiettivi di illuminazione, OL1 e OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm da M9 e M10 e in linea con il fascio. Il fascio emesso dagli obiettivi forma il foglio leggero per i campioni di imaging.
8. Utilizzare una stampante 3D per stampare il portacampioni da acrilonitrile butadiene stirene (ABS). Incorporare un pezzo di vetro di copertura [indice di rifrazione (RI) = 1.4745] su ogni lato della camera, perpendicolare al fascio di illuminazione, per ridurre al minimo l'indice di rifrazione di disadattamento. Posizionare in modo uniforme la camera tra i raggi emessi dalle lenti dell'obiettivo.
9. Installare un microscopio stereo con un 1 obiettivo di ingrandimento e una fotocamera di semiconduttore (sCMOS) scientifico ossido di metallo complementare perpendicolare all'illuminazione aereo (Vedi Figura 2).

2. calibrazione del sistema imaging

1. Recuperare fluorescente perle di polistirolo che sono 0,53 μm di diametro.
2. Preparare il campione di perlina fluorescente diluendo la soluzione di perlina in una soluzione corrispondente indice di rifrazione (cerchi) con puntamento agarosio all'1% basso-fusione di 1: 150, 000. Tagliare un pezzo di tubo di vetro borosilicato con un diametro interno di 12 mm e un diametro esterno di 18 mm per una lunghezza di 30 mm.
   Nota: Il tubo di vetro borosilicato viene utilizzato per abbinare l'indice di rifrazione (1,47).
3. Mescolare il campione diluito perlina con 1% di agarosio e dispensare la soluzione di agarosio/tallone nel tubo borosilicato. Consentire l'agarosio a solidificare a temperatura ambiente (23 ° C).
4. Riempire la camera ABS (dal punto 1.7) con una soluzione di glicerolo al 99,5%. Posizionare il tubo di vetro borosilicato contenente le microsfere all'interno della camera. Posizionare la camera di ABS in sistema di imaging in modo che è al centro del fascio gaussiano creato dal sistema di doppia illuminazione.
5. Allegare una fase traslazionale motorizzata 3-d per il tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e l'orientamento del campione all'interno della camera ABS (Vedi Supplemental figura 1).
6. Acquisire immagini tramite la fotocamera di sCMOS a una velocità di 30 fotogrammi al secondo (fps). Utilizzando il controller del motore, spostare il campione 1 mm in direzione laterale e acquisire immagini a ogni incremento di 1 mm utilizzando la fotocamera sCMOS. Continuare fino a quando l'intero campione è stato ripreso.
7. Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione (Vedi Tabella materiali). Misurare la funzione di diffusione del punto (PSF) del sistema utilizzando queste immagini della perla. Utilizzare questo PSF per deconvoluzione durante l'elaborazione nei passaggi successivi di immagini.

3. preparazione del campione

1. Sezionare i cuori da un mouse di tipo selvaggio P1 e da un doppio eterozigote sarcolipin-Cre knockin mouse con il gene Rosa26-YFP (Sln^{Cre / +}; R26^{reporter YFP / +}) a P7.
   Nota: L'eutanasia è stata effettuata usando pentobarbital e la tecnica descritta da Robbins et al. ¹⁰. la dissezione è stata realizzata secondo la tecnica descritta dal National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI)^10,11.
2. Eseguire un prodotto chimico di compensazione dei cuori murini come descritto da Kevin Sung et al. ¹².
   Nota: La seguente procedura dovrebbe essere eseguita in una cappa poiché i prodotti chimici utilizzati sono tossici.
   1. Sciacquare i cuori in 1x tampone fosfato salino (PBS) 3 x per 10 min. Dopo il risciacquo, mettere i cuori in una soluzione di paraformaldeide 4% e incubare questi campioni a 4 ° C durante la notte.
   2. Posizionare i campioni in una soluzione di 4% di acrilammide contenente 0.5% p/v di 2, 2'-Azobis dicloridrato. Consentire ai campioni di incubare a 4 ° C durante la notte. Dopo l'incubazione overnight, rimuovere i campioni e li Incubare a 37 ° C per 2-3 ore.
   3. Sciacquare i campioni con PBS e poi metterli in una soluzione di solfato dodecilico di sodio di 8% w/v e 1,25% w/v acido borico. Incubare i campioni a 37 ° C fino a quando non sono chiare. Questo può richiedere diverse ore a seconda dello spessore del campione. Dopo aver eliminato, rimuovere i campioni e metterli in 1x tampone fosfato salino per 1 giorni.
   4. Preparare un indice di rifrazione corrispondente soluzione con 40 g di medio gradiente di densità non ionico (Vedi Tabella materiali) in 30 mL di tampone fosfato 0,02 M (PB), 0.1% Tween-20 e 0,01% di sodio azide. Portare la soluzione a un pH di 7,5 con idrossido di sodio.
3. Posizionare il campione deselezionato in cerchi con un indice di rifrazione di 1,46-1,48 e 1% di agarosio. Inserire il campione nel tubo di vetro borosilicato e consentire l'agarosio a solidificare a temperatura ambiente (23 ° C).
4. Allegare una fase traslazionale motorizzata 3-d per il tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e orientamento del campione entro il 3-d stampato alloggiamento ABS (Vedi Supplemental figura 1).

4. Imaging del cuore adulto

1. Iniettare 8,7 x 10¹² virus di tipo vettoriale virus adeno-associato 9 (AAV9) che contiene un promotore specifico troponina T (cTnT) e la proteina fluorescente verde (GFP) in un volume di 100 μL in vena caudale di un mouse di tipo selvaggio 2-mese (C57BL/6).
   Nota: Il AAV9 è stato sviluppato secondo la tecnica descritta da Yuan et al. ¹³. in questo modo GFP da associare al canale midollare esterna renale del potassio (ROMK) producendo AAV9-cTnT-ROMK-GFP (Vedi Tabella materiali).
2. Sezionare i cuori di topo adulto a 7,5 mesi dell'età secondo la tecnica descritta da NHLBI¹¹. Preparare i campioni utilizzando passaggi 3.1-3.3.
3. Collegare il controller del motore per l'attuatore motore. Collegare l'attuatore al tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e orientamento del campione entro il 3-d stampato camera di ABS.
4. Posizionare il campione in modo che è al centro del fascio gaussiano creato dal sistema di doppia illuminazione. Acquisire immagini tramite la fotocamera di sCMOS ad un tasso di 100 fps.
5. Utilizzando il controller del motore, spostare il campione 1 mm in direzione assiale e acquisire immagini a ogni incremento di 1 mm con la fotocamera di sCMOS. Continuare fino a quando l'intero campione è stato ripreso.
   Nota: Il sistema è controllato da un software di controllo di strumenti personalizzati.
6. Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione (Vedi Tabella materiali). Sviluppare le immagini 3D utilizzando queste serie di immagini e il software di visualizzazione¹⁴. Deconvoluzione il PSF da passo 2.6 con lo stack di immagine acquisita. Impostare un valore di intensità di soglia pixel per osservare i contorni del cuore e aggiungere pseudo-colore alle immagini basate su questa intensità di scala di grigi.

Risultati

La tecnica descritta qui usato un fascio di fronte-retro illuminazione combinato con una compensazione ottica dei campioni di tessuto del cuore del mouse per ottenere una maggiore profondità di imaging e un più grande volume di imaging con sufficiente formazione immagine ad alta risoluzione (Figura 1). Per calibrare il sistema, perline fluorescenti sono stati collocati all'interno dei tubi di vetro e all'interno del sistema di imaging. Le perle sono stati p...

Discussione

Il sistema LSFM e la tecnica qui descritta utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione combinato con una compensazione ottica a immagine del cuore del topo nelle fasi post-natali e adulti del suo sviluppo. Un fascio di illuminazione singola tradizionale soffre di photon scattering e assorbimento attraverso tessuti più spessi e più grandi campioni^1,3. Le travi-retro forniscono un'illuminazione più uniforme del campione, riducendo al minimo l'effetto di str...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CW Laser	Laserglow Technologies	LMM-GBV1-PF3-00300-05	Excitation of fluorophores
Neutral density filter	Thorlabs	NDC-50C-4M	Controls amount of light entering system
Achromatic beam expander	Thorlabs	GBE05-A	Expands the beam of light
Mechanical slit	Thorlabs	VA100C	Controls width of beam
Beam splitter	Thorlabs	BS013	Forms dual-illumination beam
Stereo microscope with 1X objective lense	Olympus	MVX10	Used for observation of sample
ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera	Hamamatsu Photonics	C11440-42U	Used to capture Images
Acrylonitrile butadiene styrene (ABS)	Stratasys	uPrint	Material used to 3-D print a sample holder
Fluorescent polystyrene beads	Spherotech Inc	PP-05-10	Used for imaging system calibration
Borosilicate glass tubing	Corning	Pyrex 7740	Tubing for sample embedding
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4	Fill for sample chamber
Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP39920	Rinse solution for mouse hearts
Paraformaldehyde	Electron microscopy sciences	RT-15700	First incubation solution
Acrylamide	Wako Chemicals	AAL-107	Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts
2,2'-Azobis dihydrochloride	Wako Chemicals	VA-044	Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	71725	Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts
Boric acid	Fischer Scientific	A74-1	Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts
Sigma D2158	Sigma Aldrich	D2158	Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution
Tween-20	Sigma Aldrich	11332465001	Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002	Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution
Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP	Vector Biolabs	VB2045	Expresses GFP when bound to ROMK
DC Servo Motor Actuator	Thorlabs	Z825B	Used for movement of sample in axial direction within light sheet
K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller	Thorlabs	KDC101	Connects to motor actuator and controls movement of the actuator
Amira	FEI Software	N/A	Visualization software for producing 2-D and 3-D images