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Method Article
MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ T 細胞孤立したアカゲザルから
要約
96 遺伝子の発現を量的に方法論が説明し、単一セルがex vivo、差動の同定を可能にする 18 の表面タンパク質は感染していない細胞を基準にしてウイルスに感染した細胞の遺伝子そして蛋白質を表明しました。+ T 研究 SIV 感染 CD4 にアプローチを適用アカゲザルから分離した細胞。
要約
単一細胞解析は、細胞の異種個体集団を解剖するための重要なツールです。同定や希少細胞の分離は困難することができます。このような課題を克服するためにインデックス付き cytometry 流れの手法の組み合わせと高スループット多重量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を開発しました。目的は、識別し、特徴付けるサル免疫不全ウイルス (SIV)-感染細胞アカゲザル内に存在します。多次元のプロファイルを作成するホスト遺伝子および蛋白測定と組み合わせてウイルスの遺伝子によって識別がウイルス感染細胞表面タンパク質蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えると qPCR による mRNA の定量を.アプローチ、対象の単一細胞タンパク質転写評価または tSCEPTRE と呼びます。メソッドを実行するには、実行可能なセルは細胞サブセットおよび/または下流の表現型解析の FACS 分離に使用される表面マーカーの特定蛍光抗体で染色が。単一のセルは即時換散、多重の逆のトランスクリプション (RT)、pcr 前、最大 96 の転写産物の高スループット qPCR の順で並べ替えられます。FACS 測定選別の時に記録、その後結合蛋白質と転写プロファイルを作成するよく位置によって遺伝子発現データにリンクします。Ex vivoセル直接 SIV 感染を研究するのには、セルが複数のウイルス RNA 種の qPCR の検出によって識別されました。それぞれの量とウイルスの転写産物の組み合わせ (例えば、非生産性対生産的な) ウイルスのライフ サイクルの異なる段階に細胞を分類するためのフレームワークを提供します。また、SIV+細胞の tSCEPTRE に比べて感染していない細胞発現宿主遺伝子とタンパク質を評価する同じ標本から分離したしていた。分析では、感染細胞だけでなく体内の SIV を介した転写後遺伝子発現制御単一セルの解像度の以前功績のウイルス RNA 式異質性を明らかにしました。TSCEPTRE メソッドは表面蛋白質のマーカー、ホストまたは病原体の遺伝子、またはこれらの組み合わせの式による識別に従う任意のセルの人口の分析のため。
概要
多くの細胞内の病原体は頻繁にホスト細胞生物学を変更すること、または伝播の彼らのチャンスを最大化するために宿主細胞の非常に特定の集団を対象と、レプリケートする宿主の細胞機構に依存します。その結果、細胞生物学的プロセスがホストの全体的な健康に有害な影響をよく破壊され。ウイルス、複製する、ホスト細胞間の相互作用を理解することは感染を防ぐために改良された治療法と戦略の開発に役立つ可能性があります病気のメカニズムを解明します。宿主-病原体相互作用の研究を可能にする直接の分析ツールこの年末に向けて不可欠です。単一細胞解析は、明確に特定の遺伝子または感染状態1に細胞の表現型を属性する唯一の手段を提供します。たとえば、病原性感染症はよくホスト細胞の直接と間接の両方の変化を誘発します。したがって、よう一般化感染していない相手からの感染細胞は直接感染する二次的影響属性ホスト セルの変更に必要な区別する炎症。また、SIV とヒト免疫不全ウイルス (HIV) のような多くの病原体を早く、遅く、ホスト細胞への感染のように複数の段階を進行または潜在的なそれぞれの特徴付けることができる個別の遺伝子、タンパク質発現プロファイル2で,3,4,5. 細胞の混合物の分析がこの不均質性6をキャプチャに失敗します。対照的に、両方のウイルスの発現を定量化することができる単一細胞解析の高多重し、宿主遺伝子が感染の段階でバリエーションを含む感染特異的細胞摂動を解決する手段を提供します。さらに、ホスト病原体の相互作用を生理学的分析関連する設定は、感染した生物で発生するイベントを識別するために重要です。したがって前のヴィヴォ、生体内で最高の可能性が高いキャプチャ直接適用できるメソッドを処理します。
SIV と HIV は、CD4 をターゲット+ T 細胞レセプターの抗原提示分子感染を確立し、免疫監視7、8を避けるためとホスト抗ウイルス「制限」の要因に対抗します。 9,10,11。治療せずに、感染は CD4 の大規模な損失の結果最終的に+ T 細胞免疫不全症候群 (AIDS)12を取得で最高潮に達する。抗レトロ ウイルス療法の設定、潜伏感染細胞の貯蔵所は、何十年も治療戦略に手強い障壁をポーズ保持されます。SIV 感染細胞の生体内での特性を理解病因と永続化に尽力のホスト細胞機能を明らかにする可能性があります。ただし、これは非常に挑戦して、感染した細胞のユーザヘとそれらを簡単に識別することができる試薬の不足のために主に。ウイルスの RNA を転写細胞は 0.01-1 に存在すると推定される CD4 の %+ T 細胞血液とリンパ組織13,14,15。抑制療法下で潜伏感染細胞は 10-3– 10-7 16,17,18より頻繁に。体外感染細胞内のギャグなどを学ぶためによく働く、背景は 0.01-0.1 染色による最適な試金のウイルス蛋白質の汚損 %、感染細胞13、周波数以上のよう 14。よ特徴付けられた SIV/HIV Env-特異的モノクローナル抗体を使用して Env 蛋白質の表面の汚損は、おそらく同様の理由から困難であること実証されています。最近では、新規ツールをいずれかでギャグを発現する細胞の検出率の向上目指すギャグ RNA または代替イメージング技術14,15,19を使用して特定の試金を組み込みます。しかし、このようなアプローチは限られている残る量的測定値の数で各セルに対して実行されます。
ここでは、(1)前のヴィヴォ特異的かつ高感度のウイルス遺伝子定量 qPCR、(2) 感染ごとに最大 18 の表面タンパク質および 96 の遺伝子の発現を定量化直接単一のウイルスに感染した細胞を識別する方法論について述べる (感染していない) のセルです。この方法論を組み合わせた即時セル換散によって続いて FACS による単一細胞表面タンパク質測定および Biomark システムにターゲットを絞った qPCR を多重遺伝子発現解析を使用しています。集積流体回路 (IFC) 技術は、9,216 室個別 qPCR 反応が実行されますのマトリックスによって達成、96 のサンプルから 96 遺伝子の多重化の定量を同時にできます。すぐに実行全体のトランスクリプトーム解析を維持しながら高蛋白質豊富な測定を記録ライブ セル FACS 並べ替え下流。ウイルスに感染した細胞を識別するための代わりにスプライシングと, ウイルス Rna (vRNA) 特定のアッセイまで 96 遺伝子で現在収容される試金の最大数の合計ユーザー定義アッセイのパネルと一緒に、qPCR 解析に含まれています。IFC。遺伝子発現とタンパク質情報を各セルには、よく位置によってリンクされています。我々 は以前20をこの分析結果を報告しました。ここで、SIV に感染した CD4 のさらにわかりやすい表現と同様に、方法論のガイドラインの詳細を提供+ T 細胞。
TSCEPTRE 長期的なこのアプローチは、蛍光に分類された抗体とトランスクリプトーム利用 qPCR アッセイと互換性を表現に反応の任意の実行可能なセル人口の懸濁液に適用できます。たとえば、差動遺伝子と希少な細胞または細胞表面蛋白質のマーカーによって簡単に区別の蛋白質の表現の特性評価に使用できます。サンプル調製は、市販の抗体を用いてのプロトコルを汚す標準に依存します。単一セルの並べ替え機能を備えた Cytometers も、市販されているが、追加安全予防策が感染細胞を処理するため必要。称するよく位置によって各セルの単細胞タンパク質の発現プロファイルを記録の並べ替え、インデックスとしては市販 FACS 選別ソフトウェアの一般的な機能です。興味の細胞集団間発現宿主遺伝子の解析はここでは、説明しませんが、参照は、以前に発行されたメソッドに提供されます。
プロトコル
注: プロトコル ワークフローの模式図は、図 1に示すです。3 つの主要手順で構成されています: FACS、RT と cDNA 中古増幅、qPCR 最大 96 の遺伝子を同時に。希釈を制限することで単一のセルを並べ替えセルを並べ替え、プロトコルの 2 つのバージョンは、それぞれ手順 5 と手順 6 で詳しく説明します。これらの戦略は様々 な研究の質問に対処が、同様の手順に従ってください。
1. 前提条件や事前分析
- 前述6として使用するすべての遺伝子発現アッセイを検証します。
注: この手順は、試験日の前に実行されます。すべてのアッセイを検証、商業とカスタム、単一細胞レベルまでの関連する RNA の効率的かつ線形増幅を確保するため必要です。多くの商業的利用とカスタムの試金は、これらの仕様を満たすために失敗します。処理と最大 96 遺伝子の発現アッセイの同時の資格のための自動化されたカーブ フィット補足符号化ファイル 1-5で提供されますが、R2と直線近似の傾斜を使用して、個々 のアッセイを修飾できます。代表的な成功および失敗したアッセイ資格プロットは図 2のとおりです。 -
興味のセル表面のマーカーを染色する抗体の流れフローサイト メーター パネルを開発します。
- 各抗体と関連するサンプルは、たとえば、アカゲザル末梢血単核球 (PBMCs) の汚損によって抗体滴定しなさい。100 μ L のテストあたり抗体の 20 μ L で開始反応を染色し、8 の 2 倍のシリアル希薄を作成します。最大の正および負の集団間の明確な分離を維持しながら染色を示す最適な濃度を特定します。
- 1.2.1 ステップで決定した最適な濃度ですべての抗体の混合物を使用して追加のセル試料に結合された染色を評価します。染色が個々 の抗体の汚れの観察に似ていることを確認します。染色抗体が単独で使用されたときに観察されたものよりも小さいですが、このような抗体を交換する抱合体代替螢光色素を検討してください。
2. 遺伝子発現の分析の準備
- 1-15 mL チューブ、RNase/DNase 自由に試金する結合 96年遺伝子発現 (並べ替え板の数とサイズが異なる場合があります)。本研究で使用される試金のパネルは、表 1と表 2で指定されます。得られた材料は、「アッセイ ミックス」と呼ばれます。180 の最終的な集中に各試験を追加 nM の前方および逆のプライマー。アッセイ ミックスの適切な希釈を達成するために DNA の懸濁液のバッファーを追加します。
注: 実用的な目的は、カスタム (ユーザー生成) 分析の株式準備かもしれない 18 μ M で市販"20 x"遺伝子発現 qPCR 試金 (材料表) の濃度と一致します。各遺伝子のカスタムの前方および逆のプライマーの 18 μ M ミックスは、DNA サスペンション バッファー内の貯蔵液から作られています。市販の試金 (材料表) もなくほかのプローブ、プローブ RT または cDNA 中古増幅することができます、必要なカスタム試金のため省略します。それは 1 つを含めることが推奨または並べ替え、細胞回復および cDNA 合成の効率を評価するため品質管理でのハウスキーピング遺伝子を使用します。CDNA を生成するランダムなプライマーの使用は決定されていないが、遺伝子特定のプライマーより効率が低下する予定です。 - 手順 7.1 (多重 qPCR) で使用するアッセイ プレート × 2 を用意します。96 x 96 チップ アレイが予想されるごとに 96 ウェル PCR プレートの指定ごとに各試験の 6 μ L をピペットします。たとえば、5 チップの各アッセイの 30 μ L、96 ウェル プレートで単一の井戸を占有します。96 の試金を使用して、96 ウェル プレートの各ウェルにアッセイが含まれます。プレートをシール粘着シールを。
注: 理想的には、手順 2.1 と 2.2 は同時に実行、遺伝子発現の試金のための複数の凍結融解サイクルを避けるために。すべて遺伝子アッセイ プレート内する必要がありますもに存在しているアッセイ ミックス (ステップ 2.1)。アッセイ ミックスとアッセイ プレートの両方は、それぞれの長期または短期使用のための 4 ° C または-20 ° C で保存できます。
3. 表面汚れの進行生菌
注: 細胞内染色、透過、および固定、互換性がないこの方法で RNA を危険にさらします。
- 補正のサンプルを準備するには、細胞染色に使用される 2.5-fold の高い濃度で補正ビーズを 40 μ l 添加する材料の表に記載されている各抗体を追加します。光から保護された 25 の ° C で 20 分間インキュベートします。3 mL の PBS を追加ビーズ 500 x gで 25 ° C で 3 分間遠心しPBS を吸引し、〜 300 μ L の PBS のビードを再停止しなさい。
- サンプル処理のフロー フローサイトメトリー セルソーターを準備: 補償管を取得、補償行列を作成し、実験供試体のマトリックスを取得ファイルに適用します。
- 各抗体の材料表、染色されるすべてのサンプル オレンジ 1.5 mL チューブで指定されている適切なボリュームを組み合わせることにより蛍光抗体カクテルのマスターの組合せを準備します。渦と遠心分離機抗体をペレットに 25 ° C で 2 分間 21,000 x gでカクテルを集計します。
注: ここで使用される抗体の材料表のとおりです。 - 2 分追加 0.5-2 mL の PBS の 12 ml 500 x gで 25 ° C で 3 分間遠心 15 mL チューブに細胞懸濁液のための 37 ° C の水浴で凍結保存した細胞を解凍し、PBS を吸引します。PBS 3 mL、5 mL のポリスチレン管への転送で再懸濁します。上記の遠心し、残して 〜 20 μ L 残留 PBS PBS を吸引します。
注: 染色条件に応じて (ステップ 1.2 参照) 抗体価を変更することによって特定のアプリケーションの必要に応じて、染色温度は暖かいまたは冷たい温度に適応する場合があります。 - 最大 2 x 107カクテル 80 μ L 抗体の細胞を洗浄再懸濁し、光から保護された 25 の ° C で 20 分間インキュベートします。2 x 10 の7セルを超えるサンプル増加染色反応ボリュームに応じて維持するために < 2 x 107セル/100 μ L。
- 3 mL の PBS を追加することによって、細胞を洗って 3 分 500 × gで遠心分離し、上清を吸引します。
- 徹底的に 35 μ m ナイロン セル ストレーナー キャップをピペッティングで 300-500 μ L の PBS とフィルターで細胞を再懸濁します。氷の上の細胞を維持し、並べ替えまで光から保護します。
4. セル コレクション プレート、FACS 並べ替えの実行、および生成 cDNA を準備します。
- 単一 RNAse 空き DNAse の生殖不能の管にピペッティングして RT プリアンプ反応混合物のコンポーネント (表 3) を組み合わせます。
注: 手順 3 で染色時に前に、この手順を実行できます。RT 酵素は、qPCR 信号に DNA テンプレートの寄与を決定するここに省略されるかもしれません。 - 96 ウェル PCR 並べ替えコレクション プレートの希望数に RT プリアンプ反作用の組合せの 10 μ L を分注するのにマルチ チャンネル ピペットを使用します。粘着フィルムでプレートをシールし、中古冷蔵 96 ウェル アルミ ブロックにプレートを置きます。
- ステンド グラスのサンプルのおよそ 20,000 のセルからデータを取得することによって流れの cytometer でゲート方式を並べ替えセルを確立します。補償行列が収集されたデータに適用されたことを確認します。ゲートを描画し、遺伝子発現解析のため分離する興味のセル population(s) を識別するゲートのツリーを定義します。
注: 潜在的な SIV vRNA+セルのコレクションに使用されるゲートのツリーは図 3に示すです。 - 各ウェルに分類番号とセルのサブセットを指定する適切な機器の設定を入力します。いずれかの並べ替えのための追加の詳細な命令制限セル希釈系列または単一の細胞それぞれが用意されて手順 5 と 6 で。
- FACS は準備された 96 ウェル PCR コレクション プレートにセルを並べ替えます。並べ替えの前に粘着シールを取り外して、新鮮なシールを次のように置き換えます。
注: は、すべての回、並べ替えの間を含む事前冷却アルミ ブロックにプレートを保ちます。 - 並べ替え、渦および遠心分離機の直後にコレクションが 4 ° C で 1 分間 2,000 x gでプレートします。
- 陶歯, 次の条件を使用して予熱した蓋な PCR 機械で板: 15 分 (RT)、95 ° C 2 分は 50 ° C に続いて 18 サイクル 95 ° C の 15 s の 60 ° C で 4 分 (中古増幅)。
- 20 μ L の DNA 新しい 96 ウェル PCR プレートにバッファーが懸濁液に cDNA の 5 μ L を転送することにより cDNA 1:5 を希釈します。希薄化後の cDNA が 4 ° C または-20 ° C で不明確に保存されるこの時点で。CDNA は、qPCR (ステップ 5.2 7.4) のテンプレートとして使用する準備が整いました。
注: この希釈により RT プリアンプ反応に存在のプライマーが下流 qPCR に寄与しません。
5. 変動 a: FACS 並べ替えセル制限希釈系列内の vRNA+の周波数を決定するために細胞や実験の品質管理を行う
メモ: 単一セルの並べ替えを実行する前にことを使用して複製のシリアル希薄にセルを並べ替えによって興味のセルの周波数を決定のです。この手順も提供します貴重な品質管理並べ替え cDNA 合成 RNA 回復、セル換散効率ステップ 5.3 で説明したよう。VRNA+セル周波数による事前決定適切に動力を与えられた vRNA+細胞遺伝子発現解析のための十分なサンプル サイズを達成するために並べ替える必要があります単一セルの数のより正確な推定が可能です。
- FACS は、4.1-4.2 の手順のように 96 ウェル プレートにセルを並べ替え、複数のレプリケートの井戸あたり 1-1,000 細胞を収集しています。
注: 各セルの希釈でレプリケート井戸の数は一般的にウェルあたり細胞濃度と逆相関します。感染した細胞の頻度は 1% を下回るが、セル希釈する必要がありますウェルあたり 100-1,000 の細胞に焦点を当てます。並べ替えプレート マップの例は、図 1、左上で提供されます。結果の増加を避けるべき井戸ごとのセル数 1,000 を超える反応体積と下流 cDNA 合成と定量化に干渉。 - 表 4のマスター ミックス ソリューションの qPCR 試薬を組み合わせます。25 μ L 反応ボリュームのマスター ミックスの 22.5 μ L は 3.9 のステップからの希薄化後の cDNA テンプレートの 2.5 μ L と組み合わされます。QPCR 標準サイクリング条件を使用してを実行 (94 ° C の 40 のサイクルが続くなど、94 ° C、5 分 15 秒/1 分の 60 ° C)。
注: 従来のリアルタイム qPCR 器具を使用して Singleplex qPCR 反応は、効率的な細胞選別、RNA 回復と cDNA 合成を示す 1 つまたはいくつかのアッセイの経済的な予備的分析として推奨されます。VRNA+細胞の頻度の計算にも使えます。多重 qPCR 反応、Biomark を使用して、通常より大規模な単一細胞分析適しています。 - 品質管理、プロット Et 値 (Et = Ct最大− Ct) あたりもよく、ログスケール10並べ替えセルの数と、線形回帰分析を適用。
注: 一貫した複製、3.3 (± 0.3) の線形回帰斜面と R2 > 0.9 効率的な実験を示唆しています。および並べ替えの例については、RT プリアンプの実験は図 4のとおりです。 - VRNA+細胞の頻度を決定する、プロットの x 軸 (ログ10スケール) との割合によくあたりソート セル番号に肯定的な y 軸に各セル希釈 vRNA の井戸します。例については、図 1 (下左、ポアソン分布) を参照してください。港 1 つの肯定的なセル平均、井戸正 (y 軸の 0.632)21の 63.2% に対応するセルの数を決定するデータを線形回帰モデルを適用されます。このセル希釈数 (x 軸切片) を割合で表した周波数に変換します。たとえば、48 セルあたり 1 つの vRNA+セルは 2.1% の周波数と同じです。
6. 変化 b: 単一細胞解析のため細胞の FACS 並べ替え
- 手順 4.1-4.8 してよく位置によってマップも流れの cytometer のインデックスの並べ替え機能を使用して並べ替え、各セルの個々 の FCS ファイルを作成するごとに並べ替え 1 つのセルを指定します。
注: 並べ替えコレクション板の数は、利用可能な thermocyclers の数を超えた場合、サイクリングを停止できる逆転写酵素不活性化ステップ (2 分の 95 ° C) の後、thermocyclers が利用可能になるまで、4 ° C で cDNA を格納することができます。この場合、15 の 95 ° C の最初のサイクルで中古増幅を開始 s。 - オプション: 残留原液 cDNA を使用して興味の希少な細胞のためのスクリーンに単一細胞のバッチをユーザー定義から cDNA から成る「プール」cDNA を作成します。マルチ チャンネル ピペットで新しい 96 ウェル プレートに 2 μ L 原液単一セル中古増幅 cDNA を転送します。同じに指定されたプールのすべての追加の単一セルからの cDNA の 2 μ L 分注してを繰り返します。従来の qPCR を使用して陽性の細胞を含むものを決定するため (例えば、内の vRNA) 興味の遺伝子の cDNA プールを画面します。プールには、各セルからの cDNA の小さい因数だけする必要がある、ので cDNA の残り 〜 8 μ L が単一細胞解析できます。
注: リソース集中型多重 qPCR による尋問単一セルの数を減らすために単一細胞遺伝子発現解析を実行する前に推奨される戦略にプールします。予備単一プレックス qPCR 法により (例えば、SIV mRNA +) 興味のセルが識別される状況に適したです。単純な高スループット戦略を cDNA のプールを作成する新しい板の単一の井戸に原液 cDNA コレクションの並べ替えプレートの (すなわち行 A のセルをすべて 12) 行または列 (すなわち列 1 のセルをすべて 8)、2 μ L を組み合わせるもあります。最高のプールの方法するには、ステップ 5.4 から興味のセルの予想される頻度を検討してください。たとえば、セルの 10% がプラスになる場合は、六つの単一細胞 cDNA サンプルから成るプールが頻繁にマイナスになるし、そのプールで表されるセルは、こうして下流の単一細胞解析から除外することができます。
7. Biomark プラットフォーム上の qPCR の多重化します。
注: このセクションは、バージョン A または B 上記に続くかもしれない。記載の研究でそれは単一細胞解析にのみ適用されました。
- QPCR アッセイ プレート (2.2 の手順で準備) アッセイ プレート x 2 から各分析の 4 μ L 分注 4 μ L の各ウェルに試薬を読み込みアッセイを含む新しい 96 ウェル PCR プレートに準備します。4 ° C でアッセイ プレートを維持します。
メモ: アッセイ プレートは 4 ° C、1 週間で 1 ヶ月-20 ° C で安定しました。したがって、複数のチップのための十分な材料を準備し、適切に保管すると便利場合があります。 - チップの 2 つの吸気バルブにプライミング注射器からコントロール ライン流体を分配します。プレートの下からプラスチック製の保護を削除します。場所 A1 位置に切り欠き側と IFC コント ローラーのチップ。メイン メニューから「プライム」スクリプトを選択します。スクリプトを実行します。
- 50 μ L の試料 500 μ L PCR マスター ミックス (材料表) の各マイクロ チップと試薬を混合することによってリアルタイム反応混合物を準備します。今後「サンプル プレート」として示される新しい 96 ウェル PCR プレートの各ウェルに 4.4 μ l のピペット。
- 1:5 ステップ 4.8 リアルタイム反応混合物を含むサンプル プレートに希釈 cDNA の 3.6 μ L をピペットします。
注: 場合、PCR ダウン選択したステップ 6.2 で説明したように稀である (例えば、vRNA+) の下流解析のためのセルを画面で、肯定的なプールで表されるセルのみが含まれます。 - チップ プライミングが完了した後、チップの他の (サンプル) 側にも対応するのにサンプル板からチップの切欠き (アッセイ) 側も対応にアッセイ プレートから 5 μ L 分注し、5 μ L チップ入り江をロードします。IFC コント ローラーにチップを挿入し、「ロード ミックス」スクリプトを実行します。
- チップを多重 qPCR を実行する Biomark プラットフォームに転送します。計測器のセットアップと qPCR プログラミング リアルタイム PCR 解析ソフトウェアによって提供される、PCR の 40 のサイクルと遺伝子発現 (GE) 96.96 標準 V.1 プロトコルを使用してステップバイ ステップの命令を次に進みます。指定したフォルダーに ChipRun ファイルを保存します。
注: 1 日あたり、複数日にわたる複数のチップを実行できます。 - QPCR データを分析します。
- リアルタイム PCR 解析ソフトウェアを開きます。「ChipRun.bml」ファイルを開くと、"ファイル |メニューを開きます"。
- ソフトウェアのウィンドウの左上隅に「エクスプ ローラー チップ」と「チップの実行の概要」を検索します。チップ実行概要の 3 つのコンポーネントを識別する: 分析ビュー、サンプルのセットアップ、および検出器のセットアップ。
- 「検出器のセットアップ」をクリックしてします。「タスク」の下で「新規」をクリックし、コンテナー型「SBS プレート」とコンテナ フォーマット"SBS96"を選択します。「マッピング」横あるをクリックして、... ボタンをクリックし、、"M96-分析-SBS96.dsp"を選択します。
- (省略可能) は、各検出器 (アッセイ) 番号または各ウェルの「名」セクションの名を割り当てるも 1stをダブルクリックしています。"F2"を押しても次に移動します。
- 「サンプルのセットアップ」をクリックします。「タスク」「マッピング」の横にある、をクリックして、... ボタンをクリックし、"M96-サンプル-SBS96.dsp"を選択します。
- 「分析ビュー」をクリックします。「QPCR」タブの"タスク"、[選択「リニア (派生物) のベースライン補正」、および"ユーザー (探知機) の Ct しきい値法"。「Ct しきい値」タブで「自動ボックスを初期化」をチェックします。上記の「分析」ボタンをクリックします。
- 「分析ビュー」の右上に、2 番目のタブ「結果表」をクリックしてします。ドロップ ダウン メニューから「ヒート マップ ビュー」を選択します。ヒート マップにデータが表示されます。
- オプション: 制服の ROX 蛍光するチップを渡って流れるように、同じメニューからの「ヒート マップ ビュー」ではなく「イメージ ビュー」を選択します。ヒート マップ上右側のウィンドウから 2 番目、「ロックス」を選択します。最初は右側のウィンドウから、1-40 のサイクルの 1 つを選択します。ROX 蛍光の白黒表示に切り替える右側のウィンドウから 4 番目をクリックします。粒子、飛び散っを通知またはチップ上の欠陥のイメージが表示されます。ROX の均一性が著しく隠されている場合は、チップを再実行します。
- ヒート マップでは、「しきい値」と「ログ グラフ」をクリックします。アッセイ (ヒート マップの列) をクリックして指数段階の増幅曲線が交差する場合は必要に応じてしきい値をドラッグ手動で、各検出器 Ct しきい値を調整します。完了したら、「分析」をクリックします。
- QPCR データを .csv ファイルとしてエクスポートします。スプレッドシートまたは統計解析ソフトウェア (例えばJMP) にデータをインポートし、チップ上のサンプルと試験位置によって結果をマップします。セルを新しい列を作成すると、条件付き数式を使用してウイルスの遺伝子発現に基づくグループにまとめます。「分析」の下で"フィット Y で X"を選択し、グループ対遺伝子発現をプロットします。統計分析を適用します。
注: 4 SIV RNA 種の代表的な単一細胞の定量的表現は図 5 aの二変量プロットで描かれています。SIV RNA+細胞における定量的ホスト遺伝子発現を図 5Bに示します。 - 単一細胞の FACS データから定量的なタンパク質発現値を抽出します。
- .Fcs を開いて、FACS からファイルを並べ替える FlowJo バージョン 9 を使用して 96 ウェル プレートに対応する (ステップ 6.1)。強調表示されているファイル名を選択」プラットフォーム |イベント番号ゲート |インデックス付きの並べ替えを作成ゲート」。個々 のセルは、行で表示で表示されます。
- すべて 96 セル (行ではない) を強調表示し、選択"ワークスペース |エクスポート |「すべて補償 fluors をを選択します。「データ型」の下「FCS ファイル」、「エクスポート」をクリックし、指定フォルダーを選択します。
- 新しい FlowJo ワークスペースに個々 の細胞の新しい .fcs ファイルをドラッグします。すべてのセルを強調表示、「追加統計」(左上隅にある「Σ」ボタン) をクリックして"|意味 |すべての蛍光パラメーター"。
- 左上隅の左から 4 番目のボタンをクリックして「表エディター」を開きます。最初のセルのすべての蛍光灯を選択し、テーブル エディター ウィンドウにドラッグします。テーブル エディター ウィンドウの上部「を作成し、ビュー テーブル」に同じボタンをクリックします。これは 96 セルと各フローの数値パラメーターのテーブルが作成されます。
- 出力 (4 からテーブルの上に左ボタン) いずれかのコピー/貼り付けまたは「アプリケーションの保存および起動」をクリックしてデータベースのソフトウェア (例えば、エクセル、JMP)、にコピーします。
注: この手順は、FlowJo バージョン 9 の特定です。FlowJo バージョン 10 では、インデックス付きデータをインポートするのに別の手順を使用します。インデックス付きデータのセルソーターで作成した .csv ファイルから直接 JMP にコピー/貼り付けることができます。
- 単一細胞の FACS データとナンバー プレートの番号によって qPCR データをマージし、よく配置します。結合された単一細胞遺伝子 (qPCR) でグラフィカルな統計分析を実行およびタンパク質発現 (FACS) データ。
注: 単一のセルの例を組み合わせて qPCR、FACS データは図 6に示す (SIV 感染、スプライシング vRNA+アカゲザル サル細胞の表面蛋白質発現プロファイルのホスト)、図 7 (対表面CD4遺伝子発現CD4 細胞におけるタンパク質発現スプライシング vRNA+アカゲザル サル)、以前20を公開。特異的に識別する興味のセル population(s) の遺伝子を表現、単一細胞解析メソッドが前に説明した推奨20,22,23,24, 占める連続遺伝子の式の値と同様、遺伝子陽性細胞の割合。
結果
プロトコル全体のワークフローは、図 1に描かれています。細胞の数によって定義された 2 つのバリエーションで構成されています: いずれかの制限の希釈または単一のセル、テキストで説明されているようです。2 倍シリアル RNA 希釈プライマー プローブ資格解析の例を図 2に示します。SIV+の潜在的な細胞を識別?...
ディスカッション
プロトコルは、ここで説明、tSCEPTRE と呼ばれる、高多重 RT qPCR による単一細胞 mRNA の発現を定量的に多項目フローサイトメトリーによる単一細胞表面タンパク質定量を統合します。これら 2 つのテクノロジの連合有効高コンテンツ スナップショットを組み合わせて転写および高スループット形式で単一のセルの蛋白質のプロファイルにします。我々 はこれまでとらえどころのない細胞を?...
開示事項
この仕事は、軍事医学の進歩, inc. のヘンリー ・ m ・ ジャクソン財団と米国国防総省 (DOD) の間の協力協定 (W81XWH-07-2-0067) によって支えられました。見解はこれらの者、米国陸軍や国防総省の位置を表す解釈すべきではないです。研究動物福祉法その他の連邦法と動物に関する規制に準拠して AAALACi 認定施設における動物の使用を承認されたプロトコルの下で実施された実験含む動物と原則を遵守してケアと NRC 文書実験動物使用の 2011 年版のためのガイドに記載されています。
謝辞
著者は NIAID VRC 流れ Cytometry コアと FACS 器具及び分別装置のメンテナンスおよび操作のための MHRP 流れ Cytometry 中核施設を感謝したいです。マリア ・ モンテロ、Vishakha シャルマ、開明歌の専門テクニカル サポート;マイケル ・ Piatak ・ ジュニア (故人) については SIV の qPCR の試金のデザイン。ブランドン メルディと SIV のマシュー Scarlotta 分離シーケンス。見解はこれらの者、米国陸軍や国防総省の位置を表す解釈すべきではないです。研究動物福祉法その他の連邦法と動物に関する規制に準拠して AAALAC 認定施設における動物の使用を承認されたプロトコルの下で実施された実験含む動物と原則を遵守してケアと NRC 文書実験動物使用の 2011 年版のためのガイドに記載されています。
資料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction and PCR reagents and consumables | |||
| Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate | BioExpress/VWR | T-3060-1 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | ThermoFisher | AB0558 | |
| Armadillo 384-well PCR Plate | ThermoFisher | AB2384 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems/ThermoFisher | 4311971 | |
| DEPC Water | Quality Biological | 351-068-101 | |
| Glass Distilled Water | Teknova | W3345 | |
| Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen/ThermoFisher | 11732088 | |
| SUPERase-In Rnase Inhibitor | Invitrogen/ThermoFisher | AM2696 | |
| Platinum Taq | Invitrogen/ThermoFisher | 10966034 | |
| dNTP Mix | Invitrogen/ThermoFisher | 18427088 | |
| ROX Reference Dye (if separate from kit) | Invitrogen/ThermoFisher | 12223012 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0223 | |
| RNAqueous kit | Invitrogen/ThermoFisher | AM1931 | |
| TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 | |||
| CD6 | Applied Biosystems/ThermoFisher | Hs00198752_m1 | |
| TLR3 | Applied Biosystems/ThermoFisher | Hs1551078_m1 | |
| Biomark reagents | |||
| Control Line Fluid Kit | Fluidigm | 89000021 | |
| TaqMan Universal PCR Mix | Applied Biosystems/ThermoFisher | 4304437 | |
| Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000736 | |
| Sample Loading Reagent | Fluidigm | 85000735 | |
| Dynamic Array 96.96 (chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| FACS reagents | |||
| SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) | Spherotech Inc. | CMIgP-30-5H | |
| CompBeads Anti-Mouse Ig,k | BD Biosciences | 51-90-9001229 | |
| 5 ml Polystyrene tube with strainer cap | FALCON | 352235 | |
| Aqua Live/Dead stain | Invitrogen/ThermoFisher | L34976 | dilute 1:800 |
| Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 | BD Biosciences | 563916 | dilute 1:40 |
| Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 | BD Biosciences | 563914 | dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 | BD Biosciences | 564804 | dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 | Biolegend | 302948 | dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 | BD Biosciences | 564710 | dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 | Biolegend | 301842 | dilute 1:83 |
| Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 | Biolegend | 302048 | dilute 1:167 |
| Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 | Biolegend | 302340 | dilute 1:37 |
| Anti-CD38-R PE clone OKT10 | NHP reagent recource | N/A | dilute 1:100 |
| Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 | BD Biosciences | 564364 | dilute 1:10 |
| Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 | BD Biosciences | 561358 | dilute 1:20 |
| Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A | Biolegend | 313528 | dilute 1:80 |
| Instruments | |||
| BioPrptect Containment Enclosure | Baker | ||
| BD FACS Aria | BD Biosciences | ||
| ProtoFlex Dual 96-well PCR system | Applied Biosystems/ThermoFisher | 4484076 | |
| Quant Studio 6 qPCR instrument | Applied Biosystems/ThermoFisher | 4485694 | |
| IFC controller HX | Fluidigm | IFC-HX | |
| Biomark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD |
参考文献
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