JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

同所性同種人間原発性脳腫瘍を運ぶ免疫不全マウスにおける準備と同種の人間のリンパ球の脳定位固定装置の管理のためのプロトコルを紹介します。本研究は、実現可能性と intrabrain 配信細胞免疫療法の抗腫瘍効果の概念実証を提供します。

要約

膠 (GBM)、成人では、最も頻繁に、積極的な脳腫瘍の症例は、予後不良な一般的に関連付けられている、最後の 10 年間で不足している効率的な治療法が提案されています。新しい治療戦略を設計するための有望な候補者、間細胞免疫療法は高度侵襲を排除する対象となっているし、化学療法放射線腫瘍細胞、可能性がありますこの癌の迅速かつ致命的な再発に関与します。したがって、腫瘍近傍の人間の Vϒ9Vδ2 の T リンパ球など、同種の糸球体基底膜反応免疫細胞エフェクター administration(s) 効率を提供するユニークな機会を表しますが、非常に直接の治療薬に集中して、脳の悪性腫瘍のサイト。同所性同種人間原発性脳腫瘍を運ぶ免疫不全マウスにおける準備と同種の人間のリンパ球の脳定位固定装置の管理のためのプロトコルを紹介します。本研究は、可能性と intrabrain 腫瘍ベッド内で同種の人間のリンパ球の定位注射に依存するこれらの細胞免疫療法の抗腫瘍効果の前臨床証拠の概念を提供します。

概要

糸球体基底膜 (WHO グレード IV 星状細胞腫) は、成人では最も頻繁に、積極的な脳腫瘍の症例です。積極的な治療法は手術とラジオ化学療法を組み合わせた、GBM 変わりません非常に予後不良 (14.6 カ月と 2 年死亡 > 73% の生存期間中央値)1に関連付けられています。これは、いくつかの効率的な治療の進歩が2の最後の 10 年を検証されている証拠します。効果的な治療戦略3,4、5のデザイン候補の中で免疫療法6現在検討するいると高度侵襲とラジオ/化学療法抵抗性の腫瘍を削除セルは、迅速かつ致命的な腫瘍再発7への重要な貢献の疑いがあります。様々 な潜在的な免疫学的ターゲットが識別されたとの提案された免疫療法や自然を含むまたは変更した αβ GBM の腫瘍抗原など応力誘起分子8,9、ϒδ T リンパ球 10。選択した糸球体基底膜反応免疫細胞エフェクターを管理する可能性は、残存腫瘍のサイトに直接エフェクター リンパ球の上昇量を提供するユニークな機会を表します。この戦略をサポートするため、我々 は最近脳腫瘍 GBM 患者9,11の開発を忠実に同所性同種ヒト糸球体基底膜移植を運ぶ免疫不全マウスに基づくモデルに要約を示しています。さらに、これらのモデルに対して転送された同種の人間 Vϒ9Vδ2T のリンパ球の強い抗腫瘍活性効率を示すため使用されました。

このプロトコルでは、糸球体基底膜、同種リンパ球の養子の転送に基づくなどの脳腫瘍の定位放射線免疫療法を達成するため重要な実験手順について説明します。記事ショー: (i) 治療同種免疫エフェクター T リンパ球, リンパ球 Vϒ9Vδ2T 人間; などの増幅(ii) これらのエフェクター T のリンパ球の注射用の準備(iii) 内腫瘍近傍の脳定位放射線管理のための手順。この記事は、定位注射後これらの細胞のエフェクターの行動に洞察力を提供します。

ここで紹介する治療法は、それぞれの脳腫瘍免疫不全マウスの線量あたり20 x 106エフェクター細胞の注入に基づいています。初期の in vitro拡張ステップは、免疫細胞の大量生産に必要です。したがって、非特異的細胞拡張フィトヘマグルチニン (PHA L) を使用して実行され、同種フィーダー細胞を照射: 健常者とエプスタイン バール ウイルス EBV 変換 B リンパ芽球細胞から末梢血単核球 (PBMCs)EBV を含む培養 1 μ G/ml シクロスポリン A の存在下で、マーモセット B95 8 細胞ラインから上清中の体外感染による PBMCs 由来株 (BLCLs)

抗糸球体基底膜の免疫細胞が比較され、生体外の試金9から選択。これらのエフェクター細胞がアクティブになります、標準プロトコルを使用して (例えば、人間 Vγ9Vδ2 T リンパ球9またはヒト抗ヘルペス ウイルス T リンパ球12) 性質に従って最低純度として日常的に、> 80% で増幅フローサイトメトリー解析をチェックします。下記のとおりセル拡張プロシージャは、様々 な人間のリンパ球のサブセットに適用されます。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

次プロシージャを含む動物科目制度ガイドライン (契約 #00186.02; ペイ ド ラ ロワール [フランス] の地域倫理委員会) によるとを行った。人間の PBMCs は情報に基づいた健康なドナー (エタブリセモン Français デュ歌ったナント, フランス) から集められた血から分離しました。すべての手順は、無菌条件の下で実行されます。

1. 非特異的細胞エフェクター T 細胞の拡張

  1. 準備し、フィーダー細胞 35 Gy を照射します。2 x 105 - 4 x 105エフェクター細胞の刺激の 3 つの明確な健康なドナーから 10 x 106 PBMCs と 1 x 10 の6 BLCLs を準備します。
  2. フィーダー細胞と 15 ml の 10% の熱不活化 FCS、2 ミリメートル L グルタミン、ペニシリン (100 IU/mL) とストレプトマイシン (0.1 μ g/mL) と 300 IU/mL 組換え IL-2 添加 RPMI のエフェクター細胞を再懸濁します。
  3. 最終濃度 1 μ G/ml に PHA L を追加、慎重にミックス、および 150 μ L/ウェルの 96 穴 U 底プレート細胞懸濁液を配布します。
  4. 37 ° C で、加湿雰囲気で 5% CO2で孵化させなさい。
  5. 大細胞塊文化井戸のフォームまでプレートの日常点検 (~ 7 日)。
  6. 1 x 106セル/mL の新鮮な培養液中で培養用フラスコにセルを転送します。
  7. (2 倍の週) を数えることで細胞数を決定し、新鮮な培地の 1 x 106セル/mL でそれらを維持します。
    注: エフェクター免疫細胞は静止状態 (初期増幅刺激後通常 3 週間) で治療的投与の準備ができてする必要があります。純度とこれらのエフェクター細胞の反応性は、生体内注入 (例えば、生体外の試金と) 前にチェックしなければなりません。

2. 術前のエフェクター細胞の準備

  1. エフェクター細胞数を確認した後遠心分離 (300 x gで 5 分) で 50 mL のチューブでエフェクター細胞を収集します。
    注: 任意の損失を補うために細胞 (例えば50 × 106) の超過分を準備します。
  2. 慎重に上澄みを除去し、15 mL の滅菌 PBS と 300 × gで 5 分間遠心洗浄を実行するのに細胞を再懸濁します。
  3. 慎重にそして完全に上澄みを除去し、1 mL の滅菌 PBS で細胞ペレットを再懸濁します。
  4. 5 分間 300 × gで遠心分離を 1.5 mL マイクロ チューブの再懸濁のセルを転送します。
  5. 慎重にそして完全にゆっくりとピペッティング上澄みを削除します。
  6. マウスごと滅菌 PBS の 8 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。
    注: これは重要なステップです。
  7. マイクロ ピペットを用いて細胞懸濁液の量を測定します。必要に応じて、滅菌 PBS (20 × 106線量あたり 15 μ L の PBS セル) を追加し、慎重に混ぜます。
  8. 15 と 20 μ L (強制的 < 20 μ L) 間マウスあたり最終巻にあるマイクロ ピペットを使用して確認してください。
  9. 定位注射まで氷の上細胞を保ちます。
    注: 3 時間以上縦長はテストしませんでした。

3. 定位注射

  1. 機器のセットアップ
    1. 組み立てるし、頭蓋内注射 (例えば、シリンジ サイズ、音量、注入の速度) の精度を確保するための製造元の指示に従って小動物定位脳手術フレームをキャリブレーションします。
      注: 低速注入率は (すなわち2 〜 3 μ L/分) 推奨します。
    2. 感染症から微生物安全キャビネット (MSC) 楽器の無菌性を維持し、マウスを保護するための下で材料をインストールします。
      注: 場所"等温ブロック」の 37 ° C の水浴中このシステムは、手術中にマウスの体温を制限します。手続き後のケアのために必要であるパッドを加熱は、連続温度監視中に使用する必要があります。
  2. 動物の術前準備
    1. ケタミン (10 mg/mL) とマウスの体重の 10 μ L/g でキシラジン (0.1 mg/mL) の腹腔内注入マウスを麻酔します。
    2. 完全な麻酔と動物の鎮痛を確保するつま先ピンチ テストを実行します。
      注: 任意の動きが非深い鎮痛の表示、操作を繰り返す前に、数分以上が必要な場合は。
    3. マウスは麻酔は正しく、(間に 2 つの耳、鼻まで) 手術部位から毛皮を削除するのにはさみを使用します。
  3. 術前セル準備
    1. 任意のセルの凝集を防ぐために各注入前にピペットで細胞の (複数回) を慎重に再懸濁します。
    2. 慎重に泡の吸引を避けるために 22 G 変らずに必要な細胞懸濁液容積 (15-20 μ L) を描画します。
      注: 変らずにこのセルの読み込み手順は注入されたボリュームでの差異を最小化することが重要です。各コホートのエフェクター細胞学も数を確保するための手続任意のセルの凝集を防ぐために個別注射用セルを再読み込みします。
    3. その後、適応シリンジ ポンプに注射器を配置します。
  4. 手続きの注意
    1. ポビドン ヨードの 5% 溶液を少なくとも 3 に浸した綿棒で手術部位を消毒 x。
    2. マウスの目の角膜の乾燥防止のために潤滑の眼軟膏を配置します。
    3. 暖かい等温ブロック上の定位脳手術フレームに麻酔下のマウスの位置は、手術中にマウスの温度を維持し、死亡率を制限する滅菌ラップで覆われて。
      マウスの鼻と歯注: はプロシージャの間に十分な呼吸流量を確保するため、歯のバーの上適切に配置する必要があります。
    4. 歯のバーの上にマウスが、一度頭を固定するマウスの耳の下でしっかりとイヤバーを締めます。
      注: するまたは呼吸の妥協に鼓膜を損傷しないように注意してください。
    5. 頭蓋骨を公開する後方前方から頭蓋の上部に沿って滅菌ハサミで 1-2 cm 正中矢状皮膚切開を確認します。
    6. 矢状面と冠状縫合糸 (図 1に示すように) 注入前に定位のローカリゼーションのためのランドマークとして機能する (前) 交差点を識別します。
    7. このポイントより上, マイクロシリンジを配置します。
    8. 変らず右横 2 mm と 0.5 mm 前の前方に移動します。
    9. あらかじめ定義された座標で滅菌ドリルで頭蓋骨に小さな穴を作り、ドリルを使用する。脳の任意の外傷性の損傷を避けるために表在性のままに注意してください。
      注: このプロトコルでは、免疫細胞が確立された腫瘍 (腫瘍細胞の注入後 1 週間) 内で注入されました。皮膚がリニューアル オープン (瘢痕)、注射をする必要があります (穴は注入後 2 週間までまだ存在一般に) 腫瘍細胞移植に使用される同じ座標で行われます。座標は、脳実質13,14の腫瘍とエフェクター細胞を注入するために選ばれました。
  5. 免疫エフェクター細胞の注入
    1. 慎重に穴に、変らずを挿入し、ゆっくり動いて、硬膜下 3 mm とエフェクター細胞を注入する前に 2.5 mm の最終的な深さにして後方 0.5 mm の針を転送します。
    2. 2-3 μ L/分でエフェクター細胞の注入を実行し、射出時間に沿ってマウスを監視します。
    3. 注入が完了すると、わずか 1 mm の針を撤回し、変らずを注入サイトから漏洩を防ぐため、変らず撤退完全にゆっくりと前に 1 つの追加分の場所に保管します。
      注: 次の定位脳手術装置から動物の除去、今後実験用噴射装置がすぐにきれい。
  6. 手術後のケアとマウスのフォロー アップ
    1. 定位脳手術フレームから動物を削除してすぐに切開部位のポビドン ヨード溶液の 5% を適用し、適切な外科的縫合糸で皮膚を閉じます。
    2. 傷口に直接 2% リドカイン ゲルを適用し、手続き後の鎮痛のため皮下注射ブプレノルフィンの 0.15 μ g/g を管理します。
    3. 場所戻ってマウスの適切な体温を維持し、低体温症を避けるために、加熱パッドの上のケージに麻酔下のマウスは 37 ° C に設定。
      注: 別のハウジングは必要ではありません。
    4. それは完全に麻酔から回復するまでマウスを監視し、ハウジング ルームにそれを転送します。
      注: までに、このプロトコルもサポートいくつかの予期せぬ合併症が発生したとして (注入されたマウスの < 5%)。
    5. 毎日、マウスを監視し、(例えば、背を丸めて姿勢、減らされた移動性、虚脱、または重要な体重減少 [≥ 15%])、健康の減少兆候が観察されるときそれらを安楽死させます。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

本研究では、脳内定位注射腫瘍ベッド内で直接実行に基づく腫瘍を持つマウスの細胞免疫エフェクター細胞の養子の転送の戦略について説明します。

大規模な注入量に関連付けられている脳損傷のすべてのリスクを最小限に抑える、エフェクター細胞懸濁液 (20 x 106 15 20 μ L の PBS セル) を集中する必要があります?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

養子伝選択ネイティブまたは設計された免疫エフェクター細胞腫瘍浸潤の脳腫瘍、非変形細胞15、に対して反応性を制限することの世話などを効率的に治療するために有望なアプローチを表す 16,17,18。ただし、脳を含む中枢神経系は、血液脳関門の存在と古典的なリンパ排液システム

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、ナントから大学病院動物施設 (UTE) ナントの畜産とケア、細胞と組織イメージング、イメージング ナント大学 (MicroPICell) の中核施設とフローサイトメトリー施設 (Cytocell) のスタッフに感謝します。彼らの専門家のテクニカル サポート。この仕事 INSERM、CNRS、ユニヴェルシテ ・ ド ・ ナント、Institut 国立デュがん (インカ #PLBio2014-155)、リーグのナシオナル contre le がん (AO 地域間 2017 年)、欧州コンソーシアム時代ネット Transcan2 によって資金が供給された (Immunoglio)。チームは財団注ぐラ凝った Medicale (DEQ20170839118) によって資金を供給します。LabEX 囲碁のコンテキストでこの作品を実現し、IHU セスタス プログラムでサポートされている、国家研究機関 Investissements d'Avenirを介してプログラム ANR-11-LABX-0016-01 と ANR-10-IBHU-005、それぞれ。IHU セスタス プロジェクトはナント メトロポールとペイ ・ ド ・ ラ ・ ロワール地域でもサポートされます。著者は、Chirine ラフィア ・が原稿を修正ヘルプを提供することをありがちましょう。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
PBMCsfrom 3 different healthy donors
BLCLsfrom 3 different donors
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)Gibco31870-025
FCSDutscherS1810-500
L-glutamineGibco25030-024
penicillin/streptomycinGibco15140-122
IL-2Novartisproleukin
PHA-LSigmaL4144
Stereotaxic frameStoelting Co.51600
Mouse adaptator for stereotaxic frame  Stoelting Co.51624
microsyringe pump injector WPIUMP3-4
NanoFil SyringeWPINF34BV-2
NSG miceCharles RiverNSGSSFE07S
KetamineMerialImalgène 1000
XylazineBayerRompur 2%
ScissorsWPI201758
ForcepsWPI501215
OmniDrill 115/230VWPI503598
Vicryl 4-0EthiconVCP397H
XylocaineAstrazeneca3634461

参考文献

  1. Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
  2. Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
  3. Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
  4. Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305(2018).
  5. Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824(2018).
  6. Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545(2014).
  7. Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
  8. Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
  9. Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554(2016).
  10. Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
  11. Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
  12. Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
  13. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403(2011).
  14. Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
  15. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  16. Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
  17. Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
  18. Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
  19. Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
  20. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  21. Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
  22. Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
  23. Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
  24. Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
  25. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

139 stereotaxy

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved