정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

요약

여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 세포 immunotherapies intrabrain 전달의 antitumor 효능에 대 한-의 증거-개념을 제공합니다.

초록

세포종 님 (GBM), 성인에서 가장 자주 하 고 공격적인 주 뇌 암은 일반적으로 빈약한 예 지와 연결 하 고 지난 10 년간 부족 한 효율적인 치료 제안 되었습니다. 새로운 치료 전략을 디자인 하기 위한 유망한 후보자 중 세포 immunotherapies는 높게 침략 적 제거 하 표적이 되었습니다 및 항 암 치료-radioresistant 종양 세포, 가능성이이 암의 신속 하 고 치명적인 재발 있습니다. 따라서, 종양 주변 인간 Vϒ9Vδ2 T 림프 톨 같은 수용자 GBM 반응 면역 세포 이펙터의 administration(s) 것이 효율적 제공 하는 독특한 기회 나타내고 고도로 집중에 직접 치료제를 뇌 악성 사이트입니다. 여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 intrabrain 종양 침대에서 수용자 인간 림프 톨의 정위 적 주사에 의존 하는 이러한 세포 immunotherapies의 antitumor 효능에 대 한 전 임상 증거의 개념을 제공 합니다.

서문

GBM (누가 학년 4 astrocytoma), 성인에서 가장 자주 하 고 공격적인 주 뇌 암 이다. 수술과 라디오 화학 요법을 결합 하는 적극적인 치료에도 불구 하 고 GBM는 매우 빈약한 예 지 (14.6 개월 및 2 년 사망률 > 73%의 메디아 생존)¹와 관련 남아 있습니다. 이 몇 가지 효율적인 치료 발전²지난 10 년 동안 검증 된 증거. 더 효과적인 치료 전략^3,,45의 디자인에 대 한 후보자, 중 immunotherapies⁶ 현재 탐험 추적 하 고 매우 침략과 라디오/항 암 치료-방지 종양 제거 셀, 신속 하 고 치명적인 종양 재발⁷에 그들의 주요 기여에 대 한 의심. 다양 한 잠재적인 면역 목표 식별 및 제안 immunotherapies, 자연 관련 된 또는 수정 된 αβ 또는 GBM 특정 종양 항 원 등 스트레스 유발 분자^{8,9, ϒδ T 림프 톨 했다 10}. 선택한 GBM 반응 면역 세포 이펙터 관리 가능성 잔여 악성의 사이트에 직접 효과 기 림프 톨의 높은 금액을 제공 하는 독특한 기회를 나타냅니다. 이 전략을 지원 하기 위해 우리가 최근에 나타났습니다 orthotopic 기본 인간의 GBM xenografts를 충실 하 게 수행 하는 immunodeficient 마우스에 따라 모델 GBM 환자^9,11에서 뇌 종양의 개발을 정리. 또한, 이러한 모델 adoptively 전송된 수용자 인간 Vϒ9Vδ2T 림프 톨의 강한 antitumor 효율을 보여 주기 위해 사용 되었다.

이 프로토콜 GBM, 수용자 T 림프 톨의 입양 이동에 따라 같은 뇌종양의 정위 적 immunotherapies를 달성 하기 위한 중요 한 실험 단계를 설명 합니다. 문서 쇼: (i) 인간 림프 톨 Vϒ9Vδ2T; 같은 치료 수용자 면역 효과 기 T 세포의 증폭 (ii) 분사;에 대 한 이러한 이펙터 T 림프 톨의 준비 (뇌 종양 근처에서 정위 적 관리를 위한 절차 iii). 이 문서는 또한 정위 적 주입 후 이러한 셀룰러 이펙터의 동작에 대 한 통찰력을 제공합니다.

여기에 제시 된 치료 방법은 20 x 10⁶ effector 세포 당 복용량의 각 뇌 종양 베어링 immunodeficient 마우스에 대 한 주입을 기반으로 합니다. 초기 생체 외에서 확장 단계는 면역 세포의 대량 생산 해야 합니다. 따라서, 일반적인 셀 확장 phytohemagglutinin (PHA-L)를 사용 하 여 수행 됩니다 및 수용자 피더 세포 반구: 건강 한 기증자와 엡 스타인 바 바이러스 EBV 변형 B lymphoblastoid 셀에서 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 라인 (BLCLs), 포함 하는 EBV 문화 비단 B95-8 셀 라인 1 µ g/mL cyclosporin A의 존재에서 표면에 뜨는 생체 외에서 감염에 의해 PBMCs에서 파생 된

GBM 반응 이펙터 면역 세포는 비교 하 고 분석 실험 체 외에 ⁹에서 선택. 이러한 효과 기 세포 활성화 되 고 증폭 된 표준 프로토콜을 사용 하 여 (예를 들어, 인간의 Vγ9Vδ2 T 림프 톨⁹ 또는 인간 항 헤 르 페 스 바이러스 αβ T 림프 톨¹²) 그들의 성격에 따라 정기적으로 > 80%의 최소 순도와 cytometric 분석에 의해 확인. 아래 상세한 셀 확장 프로시저는 다양 한 인간 림프 톨 부분 집합에 적용 됩니다.

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프로토콜

다음 절차와 관련 된 동물 과목 (계약 #00186.02; 지역 윤리 위원회는 드 라 루아르 [프랑스]의) 기관 지침에 따라 수행 되었다. 인간의 PBMCs 정보 건강 한 기증자 (Etablissement 프랑스어 뒤 상 낭트, 프랑스)에서 수집 된 혈액에서 분리 했다. 모든 단계는 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.

1. 특정 세포 독성 효과 기 T 세포의 확장

1. 준비 하 고 35 Gy에서 피더 세포를 비추는. 2 x 10⁵ -4 x 10⁵ effector 세포 자극에 대 한 세 가지, 건강 한 기증자 로부터 10 x 10⁶ PBMCs 및 1 x 10⁶ BLCLs을 준비 합니다.
2. 피더 세포와 RPMI 10% 열 비활성화 FCS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (100 IU/mL), 고 스 (0.1 µ g/mL) 및 300 IU/mL 재조합 일리노이-2와 보충의 15 mL에 이펙터 셀 resuspend.
3. 1 µ g/mL의 최종 농도에 PHA-L을 추가 하 고 신중 하 게 혼합, 96-잘 U 바닥 접시에 잘 당 세포 현 탁 액의 150 µ L를 배포.
4. 37 ° C에서 그리고 5% CO₂ 습도 분위기에서 품 어.
5. 큰 셀 묶습니다 문화 우물에서 때까지 접시를 매일 확인 (~ 7 일).
6. 1 x 10⁶ 셀/mL 신선한 문화 매체에서 문화 플라스 크로 셀을 전송 합니다.
7. (주 2)를 계산 하 여 총 셀 수를 결정 하 고 신선한 문화 매체에 1 x 10⁶ 셀/mL에서 그들을 유지 합니다.
   참고: 이펙터 면역 세포 휴식 상태 (초기 증폭 자극 후 보통 3 주)에서 치료 관리에 대 한 준비 되어야 합니다. 순도 이러한 효과 기 세포의 반응성 vivo에서 한 주사 (예를 들면, 생체 외에서 분석으로) 전에 검사 되어야 한다.

2. 수술 Effector 세포 준비

1. 이펙터 세포 수를 확인 한 후 원심 분리 (300 x g 5 분)에 의해 50 mL 튜브에 효과 기 세포를 수집 합니다.
   참고: 모든 손실에 대 한 보상 (예를 들어, 50 x 10⁶) 세포의 과잉 준비.
2. 조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 살 균 PBS와 300 x g 에 5 분 동안 원심 분리기 세척을 수행의 15 mL에 셀 resuspend.
3. 신중 하 고 완전히 제거는 상쾌한 하 고 메 마른 PBS의 1 mL에 다음 셀 펠 릿을 resuspend.
4. 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리에 대 한 1.5 mL microtube resuspended 셀을 전송 합니다.
5. 신중 하 고 완전히 천천히 pipetting 여는 상쾌한을 제거 합니다.
6. 마우스 마다 살 균 PBS의 8 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
   참고:이 중요 한 단계입니다.
7. micropipette를 사용 하 여 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 측정 합니다. 필요한 경우 살 균 PBS (복용량 당 PBS의 15 µ L에서 20 x 10⁶ 셀)을 추가 하 고 신중 하 게 혼합.
8. 마우스 당 최종 볼륨 15과 20 μ (명령적 < 20 µ L) 사이 micropipette를 사용 하 여 확인 합니다.
9. 정위 적 주입까지 얼음에 셀을 계속.
   참고: 이상의 3 h timepoints은 테스트 하지.

3. 정위 적 주입

1. 장비 설정
   1. 조립 하 고 intracranial 주사 (예를 들어, 주사기 크기, 원하는 볼륨 및 사출 속도)의 정확성을 보장 하는 제조업체의 지침에 따라 작은 동물 정위 적 프레임 보정.
      참고: 느린 주입 속도 (즉, 2-3 µ L/min) 좋습니다.
   2. 감염에서 미생물 안전 캐비닛 (MSC) 악기의 불 임을 유지 하 고 쥐를 보호 하기 위해 아래 자료를 설치 합니다.
      참고: 장소 "등온선 진영" 37 ° c.에 물 목욕 이 시스템 수술 시 쥐의 저체온증을 제한 한다. 패드는 포스트 절차적 케어에 필요한 난방 지속적인 온도 모니터링 하는 동안 사용 해야 합니다.
2. 수술 동물 준비
   1. 케 타 민 (10mg/mL) 및 xylazine (0.1 mg/mL) 마우스의 몸 무게의 10 µ L/g의 복 주사와 마우스 anesthetize
   2. 완전 한 마 취 및 진통 동물의 발가락 핀치 테스트를 수행 합니다.
      참고: 모든 운동 비 깊은 진통의 표시 이며, 몇 분 작업을 반복 하기 전에 필요한 경우.
   3. 일단 마우스 제대로 마 취가 위를 사용 하 여 (두 귀, 코까지) 사이 수술 사이트에서 모피를 제거.
3. 수술 세포 준비
   1. 신중 하 게 resuspend는 피 펫 셀 (여러 번) 셀 응집을 방지 하기 위해 각 주입 전에.
   2. 신중 하 게 거품의 열망을 피하기 위해 22-G microsyringe에 필요한 셀 서 스 펜 션 볼륨 (15-20 µ L)를 그립니다.
      참고:이 셀 로드 단계는 microsyringe에는 주입 된 볼륨에 분산을 최소화 하는 것이 중요입니다. 셀 응집을 방지 하 고 이펙터 셀 관리는 일대에는 짝수를 위해 절차 사이 각 개별 주입에 대 한 셀을 다시 로드 합니다.
   3. 그런 다음, 적응된 주사기 펌프에 주사기를 놓습니다.
4. 절차적 케어
   1. Povidone-요오드 5% 솔루션 적어도 3에에서 젖은 면봉으로 수술 부위의 소독 x.
   2. 어떤은 각 막의 건조를 방지 하기 위해 마우스의 눈에서 윤 활 안과 연 고를 배치 합니다.
   3. 위치는 따뜻한 등온선 블록에 정위 적 프레임에 마 취 마우스 수술 하는 동안 마우스의 온도 유지 하 고 사망률을 제한 하는 살 균 플라스틱 포장으로 커버.
      참고: 마우스의 코 그리고 치아 해야 적절 하 게 배치 절차 중 적절 한 호흡기 흐름을 보장 하기 위해 치아 바 위에.
   4. 일단 치아 바 위에 마우스를 위치 귀 바 머리를 고정 하는 마우스의 귀 아래 단단히 조입니다.
      참고: 고 막 손상 하지 또는 호흡 타협 다는 것을 주의 하십시오.
   5. 후부는 두개골을 폭로 앞쪽에서 두개골의 상단 부분을 따라 살 균가 위는 1-2 cm 중간 화살 피부 절 개를 확인 합니다.
   6. 화살과 코로나 봉합 (Bregma) ( 그림 1참조) 주입 전에 정위 적 지역화에 대 한 랜드마크로 서 역할을 교차로 식별 합니다.
   7. 이 이때 위의 microsyringe를 놓습니다.
   8. Microsyringe 오른쪽 측면 2 m m와 0.5 m m는 Bregma의 앞쪽을 이동 합니다.
   9. microdrill를 사용 하 여 미리 결정 된 좌표에 살 균 드릴 비트와 함께 두개골에 작은 구멍을 확인 합니다. 두뇌의 어떤 외상 성 상해를 피하기 위하여 표면 유지 주의 해야 합니다.
      참고:이 프로토콜에 면역 세포는 설립된 종양 (종양 세포 주입 후 1 주일) 내 주입 했다. 피부 되어야 재개 (흉터) 및 사출 (구멍은 일반적으로 주사 후 2 주까지 여전히 존재) 종양 세포 이식에 사용 되는 같은 좌표에서 수행 됩니다. 좌표는 뇌 실질^13,14에서 종양과 effector 세포를 주입에 대 한 선정 됐다.
5. 면역 효과 기 세포의 주입
   1. 조심 스럽게 드릴된 된 구멍에는 microsyringe를 삽입 하 고, 경질에서 아래로 3mm 고 효과 기 세포를 주입 하기 전에 2.5 m m의 최종 깊이를 다음 뒤로 0.5 m m 바늘을 앞으로 천천히 이동.
   2. 2-3 µ L/분 effector 세포 주입을 실행 하 고 주입 시간 따라 마우스를 모니터링.
   3. 주입이 완료 되 면만 1 m m의 바늘을 철회 하 고 천천히 주입 사이트에서 어떤 누설을 방지 하기 위해 microsyringe을 완전히 철수 하기 전에 추가 분 자리에는 microsyringe를 유지.
      참고: 정위 적 장치에서 동물의 제거 다음 즉시 곧 실험에 대 한 주입 장비 청소.
6. 수술 치료 및 마우스의 후속
   1. 정위 적 프레임에서 동물을 제거 하 고 즉시 povidone-요오드 5% 솔루션 절 개 사이트에 적용 하 고 적절 한 수술 치료와 피부를 닫습니다.
   2. 상처에 직접 2 %lidocaine 젤을 적용 하 고 0.15 µ g/g buprenorphine의 사후 절차 진통에 대 한 피하 주입에 의해 관리.
   3. 적절 한 마우스 체온을 유지 하 고 어떤 저체온증을 피하기 위해 장소 다시 마 취 마우스 난방 패드 위에 그것의 감 금 소를 37 ° C로 설정 합니다.
      참고: 별도 주거 필요는 없습니다.
   4. 그것은 완전히 마 취에서 회복 될 때까지 마우스를 모니터 하 고 주택 룸에 그것을 전송.
      참고: 날짜,이 프로토콜은 잘 지원 몇 외 합병증 발생 (주입 된 쥐의 < 5%)으로.
   5. 매일 쥐를 모니터링 하 고 어떤 감소 건강 징후 (예를 들어, 돌출된 자세, 감소 이동성, 의식, 또는 중요 한 몸 무게 감량 [≥ 15%]) 관찰 하는 때 그들을 안락사.

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결과

이 연구는 종양 침대 내에서 직접 수행 하는 정위 적 주사에 따라 종양을 들고 쥐의 뇌 내 세포 면역 효과 기 세포의 입양 전송의 전략을 설명 합니다.

큰 사출 량과 관련 된 뇌 손상의 모든 위험을 최소화 하려면 effector 세포 현 탁 액 (20 x 10⁶ 셀 PBS의 15-20 µ L에) 집중 될 필요가 있다. 이 셀 농도 단계 효과 기 세포의 생존...

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토론

입양 전송 선정 네이티브 또는 조작된 면역 효과 기 세포 효율적으로 제한 비 변형 세포^{15에 대 한 reactivities의 infiltrative 뇌 암 같은 종양을 치료 하는 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 16,,1718}. 그러나, 중앙 신경 조직, 두뇌를 구성 하는 혈액-뇌 장벽의 존재와 고아 한 림프 배수 시스템¹⁹

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBMCs			from 3 different healthy donors
BLCLs			from 3 different donors
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)	Gibco	31870-025
FCS	Dutscher	S1810-500
L-glutamine	Gibco	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
IL-2	Novartis	proleukin
PHA-L	Sigma	L4144
Stereotaxic frame	Stoelting Co.	51600
Mouse adaptator for stereotaxic frame	Stoelting Co.	51624
microsyringe pump injector	WPI	UMP3-4
NanoFil Syringe	WPI	NF34BV-2
NSG mice	Charles River	NSGSSFE07S
Ketamine	Merial	Imalgène 1000
Xylazine	Bayer	Rompur 2%
Scissors	WPI	201758
Forceps	WPI	501215
OmniDrill 115/230V	WPI	503598
Vicryl 4-0	Ethicon	VCP397H
Xylocaine	Astrazeneca	3634461